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문제 정의
- 본 실험에서는 Nannochloropsis oculata의 성장과 염도별 배양액의 영향을 알아보고자 증류수, NaCl, 인공해수와 해수 총 4종류를 선정하여 실험하였다. NaCl과 인공해수의 경우는 증류수에 NaCl과 인공해수를 각각 3%의 농도로 만들었으며, 해수(부산 연근해)의 경우 해수를 여과한 후 사용하였다.
- 미세조류는 빛 이외에도 다양한 성장인자를 요구하며 물과 이산화탄소, 여러 영양분[27] 뿐만 아니라 pH, 온도, 배지성분, 교반속도 및 염농도 등 여러 가지 요인들에 의해 조절되어진다[7]. 본 연구는 배양에 필수적인 기본조건을 확립하고자 하였으며 CO2의 영향에 따른 Nannochloropsis oculata의 성장을 비교분석 하였다. 이는 Nannochloropsis oculata의 대량 배양에 필요한 효율이 높은 광생물 반응기 개발을 위하여 필요한 연구로써 Nannochloropsis oculata의 고농도 배양과 산업화에 이용이 기대된다.
- 인공해수의 농도가 Nannochloropsis oculata의 성장에 미치는 영향을 알아보고자 다음과 같이 실험하였다. 5일 간격으로 20일간 pH와 O.
제안 방법
- CO2 영향은 Spirulina platensis의 배양조건[22]을 바탕으로 실험을 진행하였다. 초기 균체 접종농도 0.
- Nannochloropsis oculata의 온도에 따른 세포성장 양상을 알아보기 위해 광도를 3000 lux로 고정하고, 25, 30, 35℃의 배양 온도 조건을 확립하여 20일 동안 배양하였으며, 그 결과는 Figure 2에 나타내었다. 세포성장 확인은 UV/Vis 분광기로 5일 간격으로 20일간 O.
- Nannochloropsis oculata의 클로로필 추출은 G. A. Codd의 방법[29]을 변형하여 사용하였다. 1 mL 균체를 원심분리하여 상층액은 버리고 100% methanol 1 mL을 첨가하였다.
- 이때 흡광도와 세포의 건조 질량과는 직선적인 비례관계가 성립하였으며 건조 균체량(dry cell weight, DCW)의 상관관계식(Figure 1)을 이용하여 계산하였다. 건조 균체량은 미리 건조기에서 건조하여 항량된 여과종이를 이용하여 여과된 균체를 105℃ 로 조절된 건조기에서 3h 동안 건조시킨 후 얻어진 건조무게로부터 건조 균체량을 계산하여 O.D. 값과의 상관관계식을 산출하였다.
- 균주의 최적 배양 온도를 확립하기 위해 25, 30, 35℃로 온도 조건을 변화하여 20일 동안 배양하였으며, 초기 pH는 pH 6.5∼9.5까지 1.0 단위로 6 N-HCl, 6 N-NaOH를 이용하여 조절하였다.
- 균체량은 UV/Vis 분광기(Optizen 2120UV, Mecacy Ltd, Korea)를 이용하여 680 nm에서 측정한 흡광도(optical density, O.D.)를 통하여 간접적으로 관찰하였다. 이때 흡광도와 세포의 건조 질량과는 직선적인 비례관계가 성립하였으며 건조 균체량(dry cell weight, DCW)의 상관관계식(Figure 1)을 이용하여 계산하였다.
- Nannochloropsis oculata의 대량배양을 위한 효율적인 광생물반응기를 개발함에 있어 최적의 배양조건 확립이 필수적이다. 따라서 Nannochloropsis oculata의 대량배양을 위해 배양조건을 확립하고자 Nannochloropsis oculata의 최적온도, 초기 pH, 배양액 변경, 인공해수 농도, 배지농도, CO2 주입에 따른 영향을 균체의 성장과 클로로필 함량을 통해 알아보았으며, 이를 통하여 최적 배양 조건을 선정하였다. 온도 25℃에서는 초록색을 띄며 0.
- 이 결과를 토대로 해수 및 인공해수 속에 포함되어 있는 미량원소들이 Nannochloropsis oculata의 성장에 필요한 필수 성분들을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 계절과 환경 변화에 영향을 받는 해수 대신 항상 일정한 염 농도 조건을 갖춘 인공해수를 이용하여 실험에 사용하였다.
- 이 결과로 미루어볼 때, 일정량의 인공해수는 Nannochloropsis oculata의 성장에 영향을 주지만, 그 이상의 인공 해수는 미세조류 성장에 영향을 미치지 못하는 것으로 생각된다. 따라서 이후 실험은 해수의 농도와 유사하고 이 실험에서 균체 성장량이 비교적 높은 3%의 인공해수를 선택하여 실험을 진행하였다.
- 40 g/L로 배양하였다. 반응기 내의 광 조사는 광주기 12h : 12h (light : dark)으로 명반응시 형광등을 이용하여 조사하였으며, 실험 환경은 온도와 조도가 적절히 조절되는 배양기 내부에서 실시하였으며, 균주의 활성을 지속적으로 유지하기 위하여 10일마다 계대배양을 실시하였다. 균주의 최적 배양 온도를 확립하기 위해 25, 30, 35℃로 온도 조건을 변화하여 20일 동안 배양하였으며, 초기 pH는 pH 6.
- 배양온도 25℃, 광도 3000 lux로 고정하고, 초기 pH 6.5∼9.5까지 1.0 단위로 총 4종류의 실험군으로 pH 실험을 실시하였다.
- 배지의 농도에 따른 세포의 성장속도를 알아보기 위해 균주의 기본 배지인 f/2를 기초로 하여 f, 2f, 3f, 4f, 5f 농도로 배지를 만들어 배양하였다. Nannochloropsis oculata 배양에 이용되는 f/2 배지는 증류수가 아닌 해수(부산 연근해)를 이용하였다.
- Nannochloropsis oculata의 온도에 따른 세포성장 양상을 알아보기 위해 광도를 3000 lux로 고정하고, 25, 30, 35℃의 배양 온도 조건을 확립하여 20일 동안 배양하였으며, 그 결과는 Figure 2에 나타내었다. 세포성장 확인은 UV/Vis 분광기로 5일 간격으로 20일간 O.D. 값을 측정하여 건조 균체량으로 환산하였다. 25℃에서는 초기접종 농도 0.
- )를 통하여 간접적으로 관찰하였다. 이때 흡광도와 세포의 건조 질량과는 직선적인 비례관계가 성립하였으며 건조 균체량(dry cell weight, DCW)의 상관관계식(Figure 1)을 이용하여 계산하였다. 건조 균체량은 미리 건조기에서 건조하여 항량된 여과종이를 이용하여 여과된 균체를 105℃ 로 조절된 건조기에서 3h 동안 건조시킨 후 얻어진 건조무게로부터 건조 균체량을 계산하여 O.
대상 데이터
- 2.3∼2.5 µm의 크기를 가진 구형의 형태로 일본국립환경연구소(www.nies.go.jp) Microbial Culture Collection at NIES (NIES)로부터 분양 받아 사용하였다.
- 배지의 농도에 따른 세포의 성장속도를 알아보기 위해 균주의 기본 배지인 f/2를 기초로 하여 f, 2f, 3f, 4f, 5f 농도로 배지를 만들어 배양하였다. Nannochloropsis oculata 배양에 이용되는 f/2 배지는 증류수가 아닌 해수(부산 연근해)를 이용하였다. 확인결과 f/2 배지에서 배양하였을 때 균체생산량은 1.
- 배지에 사용된 물(배양액)은 인공해수(Acworth, Georgia 30102 U.S.A.)를 사용하였으며, CO2의 영향에 대한 실험의 배양조건으로는 5% (vol/vol, CO2/Air) 농도의 이산화탄소를 0.1 vvm(vol/vol⋅min)으로 공급하였다.
- 본 연구에서 사용된 미세조류는 해양 서식 녹조식물문 중 녹조강인 Nannochloropsis oculata NIES-2145 (Npo-2145)이다. 2.
성능/효과
- 값을 측정하여 건조 균체량으로 환산하였다. 25℃에서는 초기접종 농도 0.40 g/L에서 0.75 g/L로 세포의 성장이 2배가량 증가하면서 가장 좋은 성장을 보였으며, 30℃에서는 세포성장이 0.57 g/L로 25℃보다는 느리게 일어남을 확인 할 수 있었다. 35℃에서는 0.
- 64배 높은 클로로필 함량을 보였다(Figure 7(C)). CO2를 공급하였을 때 CO2 공급 11일 이후 pH가 6.8로 급격히 낮아지면서 최적의 pH 범위에서 벗어나는 결과를 보였으며, 배양 후반부로 갈수록 pH의 변화가 작았다. 그러나 CO2를 공급하면 pH가 낮아짐에도 불구하고 CO2를 공급하지 않았을 때보다 높은 균체량을 생산하였다.
- f/2는 보다 높은 배지조건에서는 생장률이 커다란 차이를 보이지 않았다. 결론적으로, CO2를 주입하여 배양하였 을 때 균체의 성장이 1.50 g/L로 CO2를 주입하지 않았을 때 보다 2배 가량 높았다. CO2를 공급하지 않았을 때에는 클로로필의 함량이 26.
- 0 단위로 총 4종류의 실험군으로 pH 실험을 실시하였다. 그 결과 (Figure 3), pH 8.5에서는 0.77 g/L의 균체량을 생산하여 가장 우수한 성장을 보였으며, 0.60 g/L의 균체량을 생산한 pH 9.5에 비해 균체량이 1.28배 더 많이 생산함을 확인할 수 있었다. pH 6.
- NaCl과 인공해수의 경우는 증류수에 NaCl과 인공해수를 각각 3%의 농도로 만들었으며, 해수(부산 연근해)의 경우 해수를 여과한 후 사용하였다. 그 결과, 증류수와 NaCl은 초기 접종균체인 0.40 g/L보다 낮은 0.38와 0.36 g/L로 Nannochloropsis oculata가 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 인공해수와 해수에서는 유사한 성장 패턴을 보이며 각각 0.
- 2번의 반복실험에도 불구하고 동일한 결과를 얻었다. 따라서 본 실험에서는 Nannochloropsis oculata의 성장에 있어서 f/2 배지의 농도는 크게 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.
- 5순으로 성장 속도를 보였다. 본 실험 결과에서는 pH 6.5 이하의 산성 조건과 pH 9.5 이상의 알칼리 조건에서는 Nannochloropsis oculata의 성장이 둔화되는 경향을 보였다.
- 52 g/L로 서로 비슷한 균체를 생산하였다 (Figure 5). 본 실험에서는 배지의 농도가 진할수록 영양분 공급이 원활하게 이루어져서 Nannochloropsis oculata의 성장이 더 좋을 것이라는 예측과는 달리 고농도의 배지에서도 저농도의 배지일 때와 마찬가지로 균체 성장은 서로 비슷함을 확인할 수 있었다. 2번의 반복실험에도 불구하고 동일한 결과를 얻었다.
- 값을 측정하여 그 결과를 Figure 4에 나타내었다. 실험결과, 인공 해수 1%일 때에는 세포성장이 0.48 g/L로 성장이 저조하였으며 2, 4, 5%일 때는 세포성장이 각각 0.65, 0.67, 0.66 g/L로 서로 비슷한 성장을 관찰하였다. 인공해수 3%의 경우 세포성장이 0.
- 3으로 높아지면서 21일 동안 비슷한 pH 경향을 보였다(Figure 7(B)). 위 결과는 Nannochloropsis oculata배양에 있어서 일정량의 CO2공급은 균체의 성장을 촉진시킬 뿐만 아니라 클로로필함량 증가에 중요한 요소가 됨을 보여준다.
- 45배 정도 좋았다. 이 결과로 미루어볼 때, 일정량의 인공해수는 Nannochloropsis oculata의 성장에 영향을 주지만, 그 이상의 인공 해수는 미세조류 성장에 영향을 미치지 못하는 것으로 생각된다. 따라서 이후 실험은 해수의 농도와 유사하고 이 실험에서 균체 성장량이 비교적 높은 3%의 인공해수를 선택하여 실험을 진행하였다.
- 3배 높은 세포성장률을 보였다(Figure 6). 이 결과를 토대로 해수 및 인공해수 속에 포함되어 있는 미량원소들이 Nannochloropsis oculata의 성장에 필요한 필수 성분들을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 계절과 환경 변화에 영향을 받는 해수 대신 항상 일정한 염 농도 조건을 갖춘 인공해수를 이용하여 실험에 사용하였다.
- 5 이상의 알칼리 조건에서는 성장이 저하되는 경향을 보였다. 인공해수를 이용하여 배양한 실험에서 균체의 성장이 0.68 g/L로 다른 배양액(증류수, NaCl) 보다 성장이 좋음을 확인하였고, 인공해수 3%를 이용하는 것이 가장 이상적으로 판단되었다. f/2는 보다 높은 배지조건에서는 생장률이 커다란 차이를 보이지 않았다.
후속연구
- 64배 높은 클로로필 생산율을 보였다. 이 실험은 Nannochloropsis oculata의 배양을 위한 기초자료로써 이용될 것이다.
- 본 연구는 배양에 필수적인 기본조건을 확립하고자 하였으며 CO2의 영향에 따른 Nannochloropsis oculata의 성장을 비교분석 하였다. 이는 Nannochloropsis oculata의 대량 배양에 필요한 효율이 높은 광생물 반응기 개발을 위하여 필요한 연구로써 Nannochloropsis oculata의 고농도 배양과 산업화에 이용이 기대된다.
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