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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 환경 중에 널리 존재하는 미생물 중 keratinase를 생산하여 우모를 효율적으로 분해할 수 있는 새로운 토착 미생물을 분리하여 그 특성을 밝힌 후, 이 미생물에 의하여 생산된 우모 분해산물의 작물 생육촉진효과를 검토함으로서 새로운 환경친화적 천연비료 개발을 위한 기초자료를 확보하고자 하였다.
- 본 연구는 keratinase 활성을 가진 새로운 우모분해 세균을 분리하고 특성화하기 위하여 수행하였다. 양계장 근처 토양으로부터 keratinase 활성이 높은 K9 균주를 분리하였으며, 표현형 및 16S rRNA gene 염기서열 분석에 의하여 Xanthomonas sp.
제안 방법
- coli 16S rRNA gene의 conserved sequence를 기초로 하여 합성된 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') primer와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') primer이었다(Lane, 1991). 16S rRNA gene 염기서열을 결정한 후, GenBank 데이터베이스의 유사균주들과 비교 검토하였다.
- 육안 관찰로 우모의 분해 정도가 큰 5 균주를 선정하여 skim milk agar plate에서 배양하였다. 3일 동안 배양 후, 직경 1 cm 이상의 투명환을 생성하는 3 균주를 선별하였다. 선정된 균주를 우모가 첨가된 무기염 배지에 접종하여 5일 동안 배양한 결과, 양계장 주변 토양으로부터 분리된 K9 균주 > 붕괴중인 우모에서 분리된 F3 균주 > 주남저수지에서 채집한 낙엽에서 분리된 L12 균주의 순서로 keratinase 활성 및 우모 분해율이 높았다.
- 경남 밀양 일원의 양계장 주변 토양, 양계분뇨, 낙엽 및 퇴비 등으로부터 채취된 시료 각 1 g씩을 닭 우모가 첨가된 무기염 배지에 접종한 후, 30°C, 200 rpm에서 진탕배양하면서 우모의 분해유무를 육안으로 관찰하였다.
- 대조구로서 수도수와 합성 질소비료인 요소비료를 사용하였다. 고추 생육에 미치는 영향은 잎 면적 및 건조중량, 줄기 길이, 직경 및 건조중량 등을 측정하여 평가하였다.
- 균주 분리에 사용한 무기염 배지를 기본배지로 하여 keratinase 생산 조건을 조사하였다. 전배양은 50 ml의 nutrient broth가 함유된 250-ml 용량의 Erlenmeyer flask에 skim milk agar 배지에서 보존중인 균주 한 백금이를 접종하여 30℃, 200 rpm에서 24시간 동안 왕복 진탕배양하였다.
- 우모 분해산물이 농작물의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 시중에 유통중인 고추 육묘를 구입한 후, 크기와 길이가 동일한 것들을 선별하여 멸균된 토양이 들어있는 포트에 이식하였으며, 28℃ 및 70±3% 습도를 유지한 growth chamber에서 12시간 간격으로 빛(3,000 lux)을 조사하면서 재배하였다. 매일 충분히 관수한 후, 우모 분해산물을 2일 마다 1회, 각 포트 당 5 ml씩 뿌리를 향해 분주하였다. 대조구로서 수도수와 합성 질소비료인 요소비료를 사용하였다.
- 선별된 균주들을 닭 우모가 첨가된 무기염 배지에 접종하여 30°C, 200 rpm, 5일 동안 왕복 진탕배양한 후, keratinase 활성을 측정하여 실험균주를 선정하였다.
- 경남 밀양 일원의 양계장 주변 토양, 양계분뇨, 낙엽 및 퇴비 등으로부터 채취된 시료 각 1 g씩을 닭 우모가 첨가된 무기염 배지에 접종한 후, 30°C, 200 rpm에서 진탕배양하면서 우모의 분해유무를 육안으로 관찰하였다. 우모 분해가 확인된 실험구로부터 일정량의 배양액을 채취하여 skim milk agar plate에 접종하여 배양하면서 투명환을 생성하는 콜로니들을 선별하였다. 선별된 균주들을 닭 우모가 첨가된 무기염 배지에 접종하여 30°C, 200 rpm, 5일 동안 왕복 진탕배양한 후, keratinase 활성을 측정하여 실험균주를 선정하였다.
- 우모 분해산물이 농작물의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 시중에 유통중인 고추 육묘를 구입한 후, 크기와 길이가 동일한 것들을 선별하여 멸균된 토양이 들어있는 포트에 이식하였으며, 28℃ 및 70±3% 습도를 유지한 growth chamber에서 12시간 간격으로 빛(3,000 lux)을 조사하면서 재배하였다.
- 전배양액 2% (v/v)를 50 ml의 배지가 함유된 250-ml Erlenmeyer flask에 접종하여 30°C, 200 rpm에서 5일 동안 왕복 진탕배양하였다. 이 조건에서 각종 탄소원, 질소원, 무기염, pH 및 온도에 따른 keratinase 생산능을 조사하였다.
- 최적화된 배지에 각 기질을 0.1%씩 첨가하여 30°C, 200 rpm에서 7일 동안 배양한 후, 분해율을 측정하였다.
- 본 실험을 통하여 확립된 최적배지에 실험균주를 접종하여 30°C, 200 rpm에서 7일 동안 배양한 후, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 회수된 상등액을 우모 분해산물로 하였으며, amino acid analyzer S433 (Sykam, Germany)을 이용하여 아미노산 함량을 측정하였다.
대상 데이터
- 경남 일원에 위치하는 양계장 주변의 토양, 양계분뇨, 낙엽 및 퇴비 등 각 시료로부터 닭 우모를 분해할 수 있는 12 균주를 분리하였다. 육안 관찰로 우모의 분해 정도가 큰 5 균주를 선정하여 skim milk agar plate에서 배양하였다.
- 매일 충분히 관수한 후, 우모 분해산물을 2일 마다 1회, 각 포트 당 5 ml씩 뿌리를 향해 분주하였다. 대조구로서 수도수와 합성 질소비료인 요소비료를 사용하였다. 고추 생육에 미치는 영향은 잎 면적 및 건조중량, 줄기 길이, 직경 및 건조중량 등을 측정하여 평가하였다.
- 1은 배양 초기 및 배양 2일 후, 우모의 분해 정도를 촬영한 것이다. 본 결과에 의거하여 K9 균주를 실험균주로 선정하였다.
- 실험균주에 의하여 분해가 가능한 기질의 종류를 조사하기 위하여 닭 우모분, 오리 우모, 사람의 모발, 사람의 손톱 및 발톱 등 케라틴 단백질을 사용하였다. 닭 우모분과 사람의 손, 발톱을 제외한 다른 케라틴 기질은 0.
- 경남 일원에 위치하는 양계장 주변의 토양, 양계분뇨, 낙엽 및 퇴비 등 각 시료로부터 닭 우모를 분해할 수 있는 12 균주를 분리하였다. 육안 관찰로 우모의 분해 정도가 큰 5 균주를 선정하여 skim milk agar plate에서 배양하였다. 3일 동안 배양 후, 직경 1 cm 이상의 투명환을 생성하는 3 균주를 선별하였다.
이론/모형
- 배양액을 13,000 rpm, 4°C에서 30분 동안 원심분리한 후, 상등액을 조효소액으로 사용하였다. Keratinase 활성은 Wawrzkiewicz 등(1987)에 의한 방법에 따라 조제된 keratin powder를 기질로 사용하여 측정하였다. 조효소액 2 ml를 0.
- 실험균주의 분류학적 위치를 밝히기 위하여 형태학적, 배양적 특성을 Manual of methods for general bacteriology (Gerhardt 등, 1981)에 준하여 조사하였으며, 또한 16S rRNA gene 염기서열 분석을 통하여 계통학적 동정을 실시하였다. 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 사용된 primer는 E.
성능/효과
- 5에서 보는 바와 같다. 30-40℃의 범위에서 keratinase 활성이 우수하였으며, 그 중 30℃에서 효소 활성이 가장 높았다(67.5 U/ml). 그러나 40℃ 이상의 온도에서는 keratinase 활성이 급격히 감소하였다.
- 따라서 Xanthomonas sp. K9를 이용하여 조제된 우모 분해산물은 가축 사료성분으로서의 역할 뿐만 아니라 아미노산 액체비료로서 응용 가능성이 있음을 알 수 있었다.
- 로 동정되었다. Keratinase 생산 최적 배지조건은 0.3% fructose, 0.1% gelatin, 0.04% K2HPO4, 0.06% KH2PO4, 0.05% NaCl 및 FeSO4 0.01%이었으며, 최적 배양조건은 초기 pH 8.0, 30℃ 및 200 rpm이었다. 최적 배양조건에서 keratinase 생산량은 기본배지보다 8배 증가되었다.
- 9 U/ml), 다른 질소원의 첨가는 keratinase 활성을 저해하였다. Keratinase 생산에 최적인 gelatin과 (NH4)2SO4의 농도를 조사하기 위하여 각 질소원을 농도별로 첨가하여 배양한 결과, gelatin의 경우, 첨가 농도가 높을수록 keratinase 활성도 증가하여 0.1%에서 가장 높은 활성(41.4 U/ml)을 나타내었다. 그러나 무기질소원인 (NH4)2SO4의 경우, 농도 증가에 따라 점차 활성이 저해되었다(미제시).
- 5 U/ml), sucrose, sorbitol, mannitol, lactose, galactose, glycerol 등의 첨가는 keratinase 활성을 저해하였다. Keratinase 생산에 최적인 glucose, fructose와 maltose의 농도를 조사하기 위하여 기본배지에 상기 탄소원을 농도별로 첨가하여 배양한 결과, fructose가 0.3-0.5% 첨가된 실험구에서 활성이 가장 높았다(Fig. 3). 따라서 fructose 0.
- 4에서 보는 바와 같다. pH 8.0에서 keratinase 활성이 가장 높았으며(60.3 U/ml), 그 이상의 pH 영역에서는 활성이 완만하게 감소하였다. 그러나 pH 7.
- 799 mg/l이었다. 본 실험결과는 우모 0.1%를 첨가하여 도출된 결과이므로 우모의 농도를 높일 경우, 본 결과보다 더 많은 농도의 아미노산이 생산되리라 판단된다. 우모는 가축 사료성분 및 희소 아미노산으로 전환될 수 있음이 보고(Riffel 등, 2003)되었으며, 아미노산은 식물 생육을 촉진하는 것(Vesela와 Friedrich, 2009)으로 알려져 있다.
- 상기에서 확립된 keratinase 생산을 위한 최적 배양 조건과 기본 조건에서 각각 회분배양을 실시한 결과, 최적조건에서의 keratinase 활성은 기본 조건에 비하여 약 8배 증가하였으며, 최적 조건에서 2일까지 활성이 증가하다가 그 이후로는 비슷하였다(Fig. 6). 첨가된 우모는 배양 7일 후, 완전히 분해되었다.
- 선정된 균주를 우모가 첨가된 무기염 배지에 접종하여 5일 동안 배양한 결과, 양계장 주변 토양으로부터 분리된 K9 균주 > 붕괴중인 우모에서 분리된 F3 균주 > 주남저수지에서 채집한 낙엽에서 분리된 L12 균주의 순서로 keratinase 활성 및 우모 분해율이 높았다.
- 또한 실험균주는 catalase를 생성할 수 있었으나 oxidase는 생성하지 못하였다. 실험균주의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene의 염기서열을 분석한 후, GenBank에 등록된 유사 균주와 비교 분석하여 유전자간 상관성을 알아본 결과, 본 공시균주는 Xanthomonas retroflexus와 97%의 상동성을 가지고 있었다. NCBI Blast의 bl2seq program을 이용하여 염기서열을 정렬한 데이터는 Fig.
- 1%를 상기에서 확립된 최적배지에 첨가한 후, 7일 동안 배양하여 천연 케라틴 기질의 분해능을 조사한 결과는 Table 3에서 보는 바와 같다. 조사한 케라틴 기질 중 우모분(67%)을 제외한 모든 기질의 분해율은 닭의 우모보다 낮았다. 특히 사람의 모발 및 손발톱은 13-22%의 낮은 분해율을 나타내었다.
- 그러나 40℃ 이상의 온도에서는 keratinase 활성이 급격히 감소하였다. 진탕속도가 실험균주의 keratinase 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, 100-200 rpm 범위에서 keratinase 활성이 우수하였으며, 그 중 200 rpm에서 활성이 가장 높았다(미제시).
- 선정된 균주를 우모가 첨가된 무기염 배지에 접종하여 5일 동안 배양한 결과, 양계장 주변 토양으로부터 분리된 K9 균주 > 붕괴중인 우모에서 분리된 F3 균주 > 주남저수지에서 채집한 낙엽에서 분리된 L12 균주의 순서로 keratinase 활성 및 우모 분해율이 높았다. 특히 K9균주는 배양시간 경과에 따라 우모를 효율적으로 분해할 수 있었는데, 배양 4일 후 feather shaft를 제외한 모든 성분을 분해할 수 있었으며, 배양 8일 후 feather shaft까지 분해할 수 있었다. Fig.
후속연구
- 25 g을 나타내었다. Fig. 7은 수확한 각 고추의 생육 정도를 관찰한 것으로, 우모 분해산물은 뚜렷한 고추 생육촉진 효과가 있는 것으로 판단되었으나 향후 고농도의 우모를 이용하여 생산된 우모 분해산물이 고추 및 다른 작물의 생육에 미치는 영향을 검토해야 할 필요성이 있었다.
- D1 (Yamamura 등, 2002) 및 Chrysosproium georgiae (El-Naghy 등, 1998)에 의한 keratinase 생산은 탄소원을 추가로 공급할 경우, 저해되는 것으로 보고되었다. 그러나 본 연구 결과는 일부 탄수화물의 추가 공급에 의하여 keratinase 생산이 증가되는 현상을 나타내었으므로 Rozs 등(2001)이 지적한 바와 같이 일반적인 효소 조절 시스템의 변화가 있는 것으로 판단되며, 이에 대한 계속적인 연구가 필요함을 알 수 있었다.
- 또한 우모 분해산물은 고추의 생육을 증가시켰다. 따라서 K9 균주는 우모 폐기물의 영양적 가치 향상뿐만 아니라 천연비료 개발에도 이용될 수 있을 것으로 기대되었다.
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