사철쑥(Artemisia capillaris T.) 추출물의 항산화 활성 및 H2O2로 산화적 스트레스를 유도한 조골세포의 활성과 분화에 미치는 영향
Antioxidaitve and Differentiation Effects of Artemisia capillaris T. Extract on Hydrogen Peroxide-induced Oxidative Damage of MC3T3-E1 Osteoblast Cells
본 연구에서는 사철쑥 추출물의 항산화 효과 및 $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석하여 산화적 스트레스에 대한 사철쑥추출물의 조골세포 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서의 이용가능성에 대해 확인하였다. 항산화 능력을 알아보기 위해 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능을 측정하였다. 그 결과 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 각각 90.19${\pm}$2.03 mg/g 과 11.10${\pm}$0.38 mg/g으로 나타났고 DPPH와 ABTS radical 50% 소거 활성의 농도는 105.80${\pm}$4.27와 251.48${\pm}$14.00 ${\mu}g$/mL였다. 이를 바탕으로 사철쑥은 항산화 기능을 하는 페놀 및 플라보노이드를 가지고 있으며 항산화 활성이 있으므로 조골세포에서 산화적 스트레스에 대해 보호효과를 가질 것이라 기대되었다. 산화적 스트레스 상황에서 사철쑥 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향은 MTT assay를 통해 분화에 미치는 영향은 분화 지표인 ALP 활성, 석회화를 측정하여 알아보았다. 그 결과 사철쑥 추출물은 산화적 스트레스로 인해 감소된 세포의 증식률을 유의적으로 증가시켰고 산화적 스트레스 상황의 분화된 세포의 증식률도 유의적으로 증가시켰다. 분화의 지표인 ALP 활성은 모든 농도에서 활성이 유의적으로 증가하였고 석회화 또한 유의적으로 증가하였다. 증식률 및 두 개의 분화지표인 ALP 활성, 석회화 모두 사철쑥 추출물 200 ${\mu}L$ 농도일 때 가장 높은 활성을 보였다. 사철쑥 추출물이 항산화 활성이 있고 산화적 스트레스 상황의 조골세포의 증식과 분화를 증가시키는 결과로 미루어 볼 때 사철쑥 추출물의 항산화 활성이 산화적 스트레스 상황의 조골세포를 보호하는 역할을 한다고 볼 수 있다. 이상의 연구결과 사철쑥 추출물은 항산화 작용을 통해 $H_2O_2$로 유도된 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화를 촉진하고 손상 및 활성 감소를 억제하여 산화적 스트레스에 대해 보호하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 산화적 스트레스에 대한 조골세포의 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서 사철쑥이 이용가능성이 있다고 사료된다.
본 연구에서는 사철쑥 추출물의 항산화 효과 및 $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석하여 산화적 스트레스에 대한 사철쑥추출물의 조골세포 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서의 이용가능성에 대해 확인하였다. 항산화 능력을 알아보기 위해 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능을 측정하였다. 그 결과 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 각각 90.19${\pm}$2.03 mg/g 과 11.10${\pm}$0.38 mg/g으로 나타났고 DPPH와 ABTS radical 50% 소거 활성의 농도는 105.80${\pm}$4.27와 251.48${\pm}$14.00 ${\mu}g$/mL였다. 이를 바탕으로 사철쑥은 항산화 기능을 하는 페놀 및 플라보노이드를 가지고 있으며 항산화 활성이 있으므로 조골세포에서 산화적 스트레스에 대해 보호효과를 가질 것이라 기대되었다. 산화적 스트레스 상황에서 사철쑥 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향은 MTT assay를 통해 분화에 미치는 영향은 분화 지표인 ALP 활성, 석회화를 측정하여 알아보았다. 그 결과 사철쑥 추출물은 산화적 스트레스로 인해 감소된 세포의 증식률을 유의적으로 증가시켰고 산화적 스트레스 상황의 분화된 세포의 증식률도 유의적으로 증가시켰다. 분화의 지표인 ALP 활성은 모든 농도에서 활성이 유의적으로 증가하였고 석회화 또한 유의적으로 증가하였다. 증식률 및 두 개의 분화지표인 ALP 활성, 석회화 모두 사철쑥 추출물 200 ${\mu}L$ 농도일 때 가장 높은 활성을 보였다. 사철쑥 추출물이 항산화 활성이 있고 산화적 스트레스 상황의 조골세포의 증식과 분화를 증가시키는 결과로 미루어 볼 때 사철쑥 추출물의 항산화 활성이 산화적 스트레스 상황의 조골세포를 보호하는 역할을 한다고 볼 수 있다. 이상의 연구결과 사철쑥 추출물은 항산화 작용을 통해 $H_2O_2$로 유도된 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화를 촉진하고 손상 및 활성 감소를 억제하여 산화적 스트레스에 대해 보호하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 산화적 스트레스에 대한 조골세포의 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서 사철쑥이 이용가능성이 있다고 사료된다.
In this study, the antioxidative activity of Artemisia capillaris T. extract on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells under $H_2O_2$-induced oxidative stress was investigated in order to determine its protective effect against oxidative stress as well as its availability...
In this study, the antioxidative activity of Artemisia capillaris T. extract on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells under $H_2O_2$-induced oxidative stress was investigated in order to determine its protective effect against oxidative stress as well as its availability as an antioxidant material related to treatment of bone diseases. As a result, the total polyphenol content of A. capillaris extract was 90.10 mg/g, whereas the flavonoid content was 4.45 mg/g. A. capillaris extract increased proliferation of MC3T3-E1 cells under $H_2O_2$-induced oxidative stress, and also increased the proliferation of differentiated osteoblast cells under oxidative stress. In addition, two differentiation markers, alkaline phosphatase activity and mineralization level, in A. capillaris extract tended to increase. These results indicate that A. capillaris extract suppresses the damage to osteoblasts caused by oxidative stress, which demonstrates its availability as an antioxidant material for preventing bone diseases.
In this study, the antioxidative activity of Artemisia capillaris T. extract on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells under $H_2O_2$-induced oxidative stress was investigated in order to determine its protective effect against oxidative stress as well as its availability as an antioxidant material related to treatment of bone diseases. As a result, the total polyphenol content of A. capillaris extract was 90.10 mg/g, whereas the flavonoid content was 4.45 mg/g. A. capillaris extract increased proliferation of MC3T3-E1 cells under $H_2O_2$-induced oxidative stress, and also increased the proliferation of differentiated osteoblast cells under oxidative stress. In addition, two differentiation markers, alkaline phosphatase activity and mineralization level, in A. capillaris extract tended to increase. These results indicate that A. capillaris extract suppresses the damage to osteoblasts caused by oxidative stress, which demonstrates its availability as an antioxidant material for preventing bone diseases.
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문제 정의
본 연구에서는 사철쑥 추출물의 항산화 효과 및 H2O2로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석하여 산화적 스트레스에 대한 사철쑥 추출물의 조골세포 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서의 이용가능성에 대해 확인하였다. 항산화 능력을 알아보기 위해 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능을 측정하였다.
사철쑥은 다양한 flavonoids 물질을 가지고 있으며 (10), 항산화 활성(11) 및 소염진통 효과(12), 염증반응 조절 및 superoxide 생성 억제(13), 항암 효과(14) 등이 보고되었다. 본 연구에서는 사철쑥의 항산화 효과 및 H2O2로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 전구세포인 MC3T3-E1 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석하여 산화적 스트레스에 대한 사철쑥 추출물의 보호효과 및 골 질환 예방관련 식품소재로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.
48-well plate에 1×104/well로 세포를 분주하여 1일간 배양하였고, 분화 시 생존율은 10 mM βglycerol phosphate와 50 μg/mL ascorbic acid를 함유한 αMEM배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 10일 동안 분화를 유도하였다.
48-well plate에 MC3T3-E1 세포를 1×104 cell/well 농도로 분주한 후 세포가 90% 포화되면 10 mM β-glycerol phosphate와 50 μg/mL ascorbic acid를 함유한 배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 분화를 유도하고, 15일 후 0, 25, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 사철쑥 추출물을 첨가 후 1시간 뒤 1.25 mM H2O2를 처리한 뒤 48시간 배양하였다.
MC3T3-E1 세포를 24-well plate에 1×104/well로 분주한 후 세포가 90% 포화되게 자라면 10 mM β-glycerol phosphate와 50 μg/mL ascorbic acid를 함유한 α-MEM배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 분화를 유도하였다.
25 mM H2O2를 처리하고 48시간 배양하였다. 배양한 세포는 DPBS로 세척한 후 0.2% Triton X-100을 첨가해 30분간 세포를 용해시킨 뒤 25,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 취하고 SensoLyte ALP kit(Asan Pharm, Seoul, Korea)를 사용하여 ALP 활성을 측정하였다. 단백질량은 상등액 중 5 μL를 96-well plate에 넣은 후 Bradford법으로 단백질을 정량하였다.
분화 유도 10일 후 0, 25, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 사철 쑥 추출물을 첨가하고 1시간 뒤 1.25 mM H2O2를 처리하고 48시간 배양하였다.
분화유도를 위해 10 mM β-glycerol phosphate와 50 μg/mL ascorbic acid를 첨가하여 분화 유도 배지로 사용하였으며, 2~3일 간격으로 배지를 교환해 주었다.
이를 바탕으로 사철쑥은 항산화 기능을 하는 페놀 및 플라보노이드를 가지고 있으며 항산화 활성이 있으므로 조골세포에서 산화적 스트레스에 대해 보호효과를 가질 것이라 기대되었다. 산화적 스트레스 상황에서 사철쑥 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향은 MTT assay를 통해 분화에 미치는 영향은 분화 지표인 ALP 활성, 석회화를 측정하여 알아보았다. 그 결과 사철쑥 추출물은 산화적 스트레스로 인해 감소된 세포의 증식률을 유의적으로 증가시켰고 산화적 스트레스 상황의 분화된 세포의 증식률도 유의적으로 증가시켰다.
2 mM DPPH 100 μL를 혼합하여 30분간 실온에 방치하고 515 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 소거능을 비교하기 위한 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군 대비 자유라디칼 소거활성은 백분율로 나타내고 50% inhibition concentration(IC50)을 구하였다.
소거능을 비교하기 위한 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군 대비 자유라디칼 소거활성은 백분율로 나타내고 50% inhibition concentration(IC50)을 구하였다.
총 플라보노이드 함량(mg/g)은 quercetin (6.25~100 μg/mL)을 이용하여 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
측정된 흡광도는 gallic acid(6.25~100 μg/mL)를 이용하여 표준곡선을 작성하여 총 폴리페놀함량(mg/g)을 계산하였다.
로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석하여 산화적 스트레스에 대한 사철쑥 추출물의 조골세포 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서의 이용가능성에 대해 확인하였다. 항산화 능력을 알아보기 위해 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능을 측정하였다. 그 결과 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 각각 90.
대상 데이터
MC3T3-E1 세포는 10% FBS와 1% 항생제(100 U/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin)를 함유한 α-MEM 배지에 37℃, 5% CO2 조건인 incubator에서 배양하였으며 세포밀도가 90%로 포화되었을 때 계대배양 하면서 실험에 사용하였다.
본 연구에 사용한 MC3T3-E1 세포는 mouse calvaria 유래의 조골세포로서 ATCC CRL-2593(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)을 구입하였다. MC3T3-E1 세포는 10% FBS와 1% 항생제(100 U/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin)를 함유한 α-MEM 배지에 37℃, 5% CO2 조건인 incubator에서 배양하였으며 세포밀도가 90%로 포화되었을 때 계대배양 하면서 실험에 사용하였다.
건조된 사철쑥 시료무게의 10배량(w/v)의 70% methanol을 첨가하여 100℃에서 6시간 동안 환류추출 하였다. 추출액은 여과지(ADVANTEC, 2호)로 여과하여 감압농축기 (EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Ltd, Japan)로 농축 후 동결 건조(Bondiro freeze, Ilshin Lab Co., Ltd., Kyunggi-do, Korea)하였고, 이를 DMSO에 100 mg/mL로 녹여 여과하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
실험 결과는 SPSS 18.0(Statistical Package for the Social Sciences, Spss Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 ANOVA(analysis of variance) test를 하였으며 시료간의 유의성을 Duncan's multiple range test을 이용하여 p<0.01과 p<0.05 유의수준에서 분석하였다.
전자공여능은 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH)을 이용한 방법으로 측정하였다. 농도별로 제조한 추출물 100 μL에 0.
조골세포의 성장 정도와 분화 시 성장속도는 Green 등(16)의 방법에 따라 MTT시약을 사용하여 MTT tetrazolium이 자주색 불용성 formazan으로 환원되는 정도를 570 nm에서 측정함으로써 살아있는 세포의 생존율을 구하는 MTT assay로 측정하였다(2). 48-well plate에 1×104/well로 세포를 분주하여 1일간 배양하였고, 분화 시 생존율은 10 mM βglycerol phosphate와 50 μg/mL ascorbic acid를 함유한 αMEM배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 10일 동안 분화를 유도하였다.
총 폴리페놀 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색으로 발색되는 원리를 이용한 Folin-Denis 방법(15)에 따라 분석하였다. 1 mg/mL로 제조한 추출물 0.
성능/효과
MC3T3-E1 조골세포는 0.5 mM H2O2를 처리함으로써 처리하지 않은 군보다 유의적으로 26% 정도로 증식률이 감소하였고 사철쑥 추출물에 의해 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도에서 H2O2를 처리한 대조군에 비해 유의적으로 증식률이 증가하는 경향을 나타내었다.
산화적 스트레스 상황에서 사철쑥 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향은 MTT assay를 통해 분화에 미치는 영향은 분화 지표인 ALP 활성, 석회화를 측정하여 알아보았다. 그 결과 사철쑥 추출물은 산화적 스트레스로 인해 감소된 세포의 증식률을 유의적으로 증가시켰고 산화적 스트레스 상황의 분화된 세포의 증식률도 유의적으로 증가시켰다. 분화의 지표인 ALP 활성은 모든 농도에서 활성이 유의적으로 증가하였고 석회화 또한 유의적으로 증가하였다.
그 결과 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 각각 90.19±2.03 mg/g과 11.10±0.38 mg/g으로 나타났고 DPPH와 ABTS radical 50% 소거 활성의 농도는 105.80±4.27와 251.48±14.00 μg/mL였다.
분화된 MC3T3-E1 조골세포는 1.25 mM H2O2를 처리함으로써 처리하지 않은 군보다 유의적으로 17% 정도 생존률이 감소하였고 감소된 생존률이 사철쑥 추출물에 의해 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도에서 H2O2를 처리한 대조군에 비해 증식률이 유의적으로 증가하였다.
분화된 MC3T3-E1 조골세포의 ALP 활성은 1.25 mM H2O2를 처리함으로써 처리하지 않은 군보다 유의적으로 45% 정도 활성이 감소하였고 감소된 활성이 사철쑥 추출물에 의해 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도에서 H2O2를 처리한 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다.
4와 같다. 분화된 MC3T3-E1 조골세포의 석회화는 1.25 mM H2O2를 처리함으로써 처리하지 않은 군보다 유의적으로 62% 정도 감소하였다. 사철쑥 200 μg/mL 농도일 때 가장 높은 석회화를 나타냈는데 H2O2를 처리하지 않은 세포군 대비 154%나 증가했다.
그 결과 사철쑥 추출물은 산화적 스트레스로 인해 감소된 세포의 증식률을 유의적으로 증가시켰고 산화적 스트레스 상황의 분화된 세포의 증식률도 유의적으로 증가시켰다. 분화의 지표인 ALP 활성은 모든 농도에서 활성이 유의적으로 증가하였고 석회화 또한 유의적으로 증가하였다. 증식률 및 두 개의 분화지표인 ALP 활성, 석회화 모두 사철쑥 추출물 200 μL 농도일 때 가장 높은 활성을 보였다.
사철쑥 200 μg/mL 농도일 때 가장 높은 석회화를 나타냈는데 H2O2를 처리하지 않은 세포군 대비 154%나 증가했다.
사철쑥 추출물의 총 페놀 함량은 90.19±2.03 mg/g으로 나타났고 총 플라보노이드 함량은 11.10±0.38 mg/g으로 나타났다(Table 1).
사철쑥은 200 μg/mL 농도일 때 가장 높은 활성을 나타냈는데 H2O2를 처리하지 않은 세포군 대비 278% 활성이 증가하였다.
사철쑥 추출물이 항산화 활성이 있고 산화적 스트레스 상황의 조골세포의 증식과 분화를 증가시키는 결과로 미루어 볼 때 사철쑥 추출물의 항산화 활성이 산화적 스트레스 상황의 조골세포를 보호하는 역할을 한다고 볼 수 있다. 이상의 연구결과 사철쑥 추출물은 항산화 작용을 통해 H2O2로 유도된 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화를 촉진하고 손상 및 활성 감소를 억제하여 산화적 스트레스에 대해 보호하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 산화적 스트레스에 대한 조골세포의 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서 사철쑥이 이용가능성이 있다고 사료된다.
분화의 지표인 ALP 활성은 모든 농도에서 활성이 유의적으로 증가하였고 석회화 또한 유의적으로 증가하였다. 증식률 및 두 개의 분화지표인 ALP 활성, 석회화 모두 사철쑥 추출물 200 μL 농도일 때 가장 높은 활성을 보였다. 사철쑥 추출물이 항산화 활성이 있고 산화적 스트레스 상황의 조골세포의 증식과 분화를 증가시키는 결과로 미루어 볼 때 사철쑥 추출물의 항산화 활성이 산화적 스트레스 상황의 조골세포를 보호하는 역할을 한다고 볼 수 있다.
후속연구
이상의 연구결과 사철쑥 추출물은 항산화 작용을 통해 H2O2로 유도된 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 증식 및 분화를 촉진하고 손상 및 활성 감소를 억제하여 산화적 스트레스에 대해 보호하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 산화적 스트레스에 대한 조골세포의 보호효과 및 골 질환 관련 항산화소재로서 사철쑥이 이용가능성이 있다고 사료된다.
00 μg/mL였다. 이를 바탕으로 사철쑥은 항산화 기능을 하는 페놀 및 플라보노이드를 가지고 있으며 항산화 활성이 있으므로 조골세포에서 산화적 스트레스에 대해 보호효과를 가질 것이라 기대되었다. 산화적 스트레스 상황에서 사철쑥 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향은 MTT assay를 통해 분화에 미치는 영향은 분화 지표인 ALP 활성, 석회화를 측정하여 알아보았다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소는 어떻게 형성되는가?
활성산소(reactive oxygen species; ROS)는 산소의 환원 대사물로서 미토콘드리아나 peroxisome 등의 정상세포 내 대사과정이나 세포질 내 효소들의 작용으로 내부로부터 형성되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성되는데, DNA와 단백질 및 지방의 심한 손상을 일으켜 세포의 손상을 가져온다. 세포들은 ROS의 생성 및 축적에 대항하기 위한 항산화 시스템을 가지고 있으나, ROS의 발생이 세포내 항산화능력을 초과하는 경우 산화스트레스에 노출된다.
ROS에 의한 산화스트레스는 어떤 질환의 중요 병인으로 알려져 있는가?
세포들은 ROS의 생성 및 축적에 대항하기 위한 항산화 시스템을 가지고 있으나, ROS의 발생이 세포내 항산화능력을 초과하는 경우 산화스트레스에 노출된다. 산화스트레스는 뇌질환, 심장질환, 동맥경화, 당뇨병, 폐섬유증, 암, 관절염 및 치매 등의 여러 질환과 노화의 중요 병인으로 알려져 있다(1,2).
사철쑥은 왜 사철쑥이라 불리는가?
사철쑥은 우리나라 냇가나 강가의 모래땅에서 자생하는 국화과에 속하는 다년생 초본이다. 겨울철에도 죽지 않고 이듬해 줄기에서 다시 싹이 나온다 하여 사철쑥 또는 애탕쑥이라 불리며, 생약명으로는 인진, 인진호 또는 추호라 불린다(9). 사철쑥은 다양한 flavonoids 물질을 가지고 있으며 (10), 항산화 활성(11) 및 소염진통 효과(12), 염증반응 조절 및 superoxide 생성 억제(13), 항암 효과(14) 등이 보고되었다.
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