AKE의 농도별 처리가 인체 유방암 세포 MDA-MB-231의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포 화학적인 방법인 MTT 분석, 이중 핵 염색법(Hoechst 33342/EtBr staining), FACS를 통하여 세포사멸을 관찰하였다. MTT 분석 결과, 150 ${\mu}g$/mL 처리 군에서 대조군에 대비하여 약 50%의 세포사멸을 나타내었으며 세포사멸이 농도 의존적으로 증가되었고(p<0.05), 이중 핵 염색법을 이용하여 세포사의 구분 결과 능동적 세포예정사인 apoptosis가 농도 의존적으로 급격히 증가하였으며(p<0.05), 특히 150 ${\mu}g$/mL 처리군에서 현저한 증가율을 나타내었다. 보다 더 명확한 세포사멸을 확인하기 위하여 FACS를 이용한 apoptosis 측정 결과, 처리군 간 크게 차이를 보이며 농도 의존적으로 증가되었다. 세포사멸관련 mRNA 유전자 발현을 관찰한 결과, 세포사멸 억제 유전자 Bcl-2는 처리농도가 증가할수록 유의적 증가를 보였으며(p<0.05), 세포사멸 유도 유전자 Bax는 유의적 감소를 나타내었다(p<0.05). 세포사멸의 지표인 Bcl-2/Bax의 비율은 농도 의존적인 감소를 나타내었으며(p<0.05), 세포사멸유도의 마지막 단계의 실행자인 caspase-3의 활성도 첨가 농도 의존적으로 증가하여 세포사멸을 유도하는 것으로 확인되었다(p<0.05). 결론적으로, AKE는 유방암 세포 MDA-MB-231의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타나 신선초의 항암효과의 가능성을 제시해주었다. 향후 in vivo 실험에서도 신선초의 항암효과에 대한 심층적 연구가 이뤄져야 할 것으로 사료된다.
AKE의 농도별 처리가 인체 유방암 세포 MDA-MB-231의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포 화학적인 방법인 MTT 분석, 이중 핵 염색법(Hoechst 33342/EtBr staining), FACS를 통하여 세포사멸을 관찰하였다. MTT 분석 결과, 150 ${\mu}g$/mL 처리 군에서 대조군에 대비하여 약 50%의 세포사멸을 나타내었으며 세포사멸이 농도 의존적으로 증가되었고(p<0.05), 이중 핵 염색법을 이용하여 세포사의 구분 결과 능동적 세포예정사인 apoptosis가 농도 의존적으로 급격히 증가하였으며(p<0.05), 특히 150 ${\mu}g$/mL 처리군에서 현저한 증가율을 나타내었다. 보다 더 명확한 세포사멸을 확인하기 위하여 FACS를 이용한 apoptosis 측정 결과, 처리군 간 크게 차이를 보이며 농도 의존적으로 증가되었다. 세포사멸관련 mRNA 유전자 발현을 관찰한 결과, 세포사멸 억제 유전자 Bcl-2는 처리농도가 증가할수록 유의적 증가를 보였으며(p<0.05), 세포사멸 유도 유전자 Bax는 유의적 감소를 나타내었다(p<0.05). 세포사멸의 지표인 Bcl-2/Bax의 비율은 농도 의존적인 감소를 나타내었으며(p<0.05), 세포사멸유도의 마지막 단계의 실행자인 caspase-3의 활성도 첨가 농도 의존적으로 증가하여 세포사멸을 유도하는 것으로 확인되었다(p<0.05). 결론적으로, AKE는 유방암 세포 MDA-MB-231의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타나 신선초의 항암효과의 가능성을 제시해주었다. 향후 in vivo 실험에서도 신선초의 항암효과에 대한 심층적 연구가 이뤄져야 할 것으로 사료된다.
We investigated the effect of Angelica keiskei ethanol (AKE) extract on cell death in MDA-MB-231 human breast cancer cells. MDA-MB-231 cells were cultured in the presence 125, 150 and 175 ${\mu}g$/mL concentrations of AKE for 24 hours. MTT assays demonstrated that mitochondrial dehydrogen...
We investigated the effect of Angelica keiskei ethanol (AKE) extract on cell death in MDA-MB-231 human breast cancer cells. MDA-MB-231 cells were cultured in the presence 125, 150 and 175 ${\mu}g$/mL concentrations of AKE for 24 hours. MTT assays demonstrated that mitochondrial dehydrogenase activities decreased in a dose-dependent manner in MDA-MB-231 cells (p<0.05). In contrast, the proportion of dual staining with Hoechst 33342/ethidium bromide(EtBr) for cell death increased in a dose-dependent manner in MDA-MB-231 cells (p<0.05). In particular, the levels of cell death caused by apoptotic program showed marked increases in the 150 and 175 ${\mu}g$/mL AKE groups, as revealed by flow cytometry. An apoptotic suppressor gene, Bcl-2, significantly decreased at the transcript level (p<0.05). The expression levels of proapoptotic genes, both Bax and caspase 3 significantly increased (p<0.05). Furthermore, the ratio of Bcl-2/Bax mRNA which is considered to be an important indicator of apoptosis, significantly decreased in a dose-dependent manner (p<0.05). These results taken together indicate that, the AKE extract used in this study induces cell death in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
We investigated the effect of Angelica keiskei ethanol (AKE) extract on cell death in MDA-MB-231 human breast cancer cells. MDA-MB-231 cells were cultured in the presence 125, 150 and 175 ${\mu}g$/mL concentrations of AKE for 24 hours. MTT assays demonstrated that mitochondrial dehydrogenase activities decreased in a dose-dependent manner in MDA-MB-231 cells (p<0.05). In contrast, the proportion of dual staining with Hoechst 33342/ethidium bromide(EtBr) for cell death increased in a dose-dependent manner in MDA-MB-231 cells (p<0.05). In particular, the levels of cell death caused by apoptotic program showed marked increases in the 150 and 175 ${\mu}g$/mL AKE groups, as revealed by flow cytometry. An apoptotic suppressor gene, Bcl-2, significantly decreased at the transcript level (p<0.05). The expression levels of proapoptotic genes, both Bax and caspase 3 significantly increased (p<0.05). Furthermore, the ratio of Bcl-2/Bax mRNA which is considered to be an important indicator of apoptosis, significantly decreased in a dose-dependent manner (p<0.05). These results taken together indicate that, the AKE extract used in this study induces cell death in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
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가설 설정
The effect of Angelica keiskei extract (AKE) on cell death by apoptosis or non-apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells. A: Morphological changes in MDA-MB-231 cells induced by AKE. B: To quantitative analysis of cells death by apoptosis or non-apoptosis in MDA-MB-231 cells, MDA-MB231 cells strained with Hoechst 33342＋ethidium bromide.
제안 방법
농도로 seeding하였으며, 6시간 후 신선초추출물(Angelica keiskei extract, AKE)을 0～500 μg/mL까지 다양한 농도로 처리하였다. 24시간 처리 후 세포 형태학적 모양변화 관찰 및 각 처리군 별 cell counting을 이용한 half maximal inhibitory concentration(IC50)을 측정하였다. 이를 통하여 세포 수 감소와 형태학적 모양이 대조군과 비교하여 현저하게 변화되는 농도를 기준으로 그 이상과 이하의 농도인 100, 125, 150, 175 및 200 μg/mL로 좁혀 정하였고, 이 농도로 세포활성을 측정하였다.
37℃ incubator에서 40분 반응시킨 후 현미경 명시야 DIC fillter에서 사진 촬영하여 mitochondrial dehydrogenase 활성 정도를 시각화하였으며, 2시간 반응시킨 후에는 50 μL의 dimethyl sulfoxide(DMSO, Welgene)를 첨가, 보라색 formazan을 용해시켜 ELISA reader(Spectra max, Vienna, MD, USA)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
AKE 125, 150, 175 μg/mL을 24시간 처리 후, Hoechst 33342를 PBS에 희석하여 만든 20 μg/mL의 혼합염색액을 첨가, 15분 동안 실온에서 light-shield로 배양하였다.
그 결과, 최종적인 AKE 처리농도는 세포 수의 감소, 세포의 형태학적 모양을 고려하여 125 μg/mL와 큰 차이가 없었던 100 μg/mL, 세포활성 측정 결과에서 세포 독성을 크게 나타내었던 200 μg/mL 처리농도는 제외하고, 125, 150, 175 μg/mL로 결정하였다. AKE 처리군에 대한 대조군(Control)으로는 MDA-MB-231 세포의 배양액인 DMEM을 사용하였으며, 추출물 첨가에 따른 효과가 추출물의 용매인 70% EtOH 처리와 독립적인지 확인하기 위하여 예비실험을 한 결과 대조군에 비교하여 큰 차이를 나타내지 않았다.
AKE 처리에 따른 MDA-MB-231 세포막의 투과성여부 확인과 apoptosis 또는 necrosis를 구분하기 위하여 DNA특이 형광 염료를 이용하였으며, 막 투과성이 있는 Hoechst 33322와 막 투과성이 없는 EtBr 핵산-특이 형광염료의 이중 염색법으로 Comes 등(20)과 Hoshino 등(21)의 방법을 수정하여 적용하였다.
AKE 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 사멸을 알아보기 위하여, 살아있는 세포의 mitochondrial dehydrogenase 작용을 확인할 수 있는 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 분석을 이용하였다.
AKE 처리에 따른 유방암 세포 MDA-MB-231의 mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 세포사멸관련 유전자인 Bcl-2, Bax, caspase-3을 통해 세포사멸효과를 확인하였으며, 대조군으로는 hosue keeping gene인 GAPDH를 이용하여 비교하였다.
2 μL의 Taq DNA polymerase(Promega)를 넣어준 후, total volume 50 μL에 맞추기 위해서 멸균한 증류수를 첨가하였다. Denaturation 반응은 95℃에서 3분 동안 시켰으며 94℃에서 30초, 55, 58℃(primer마다 annealing 온도가 다르다)에서 30초, 72℃에서 1분 동안 35 cycles을 반응시킨 후, 72℃에서 10분 동안 post extension(Table 1) 시킨 후에 1.0% agarose(cat No.50004, BMA, Washington, DC, USA) gel(1X Tris-acetate-EDTA butter, 1.0% agar, 1 mg/mL EtBr)에서 20분 동안 100 voltage에서 전기영동을 한 후 image analyzer(Gel doc XR+, Bio-Rad)로 관찰하였다. 세포관련 유전자의 발현 정도를 수치화하기 위하여 Image J 프로그램(NIH, Bethesda, MD, USA; http://rsb.
Apoptosis된 세포 내 DNA를 염색해 주는 PI(Sigma) dye를 AKE가 24시간 지속 처리된 세포에 2 μg/mL 농도로 첨가한 후 37℃ incubator에 10분 방치하였다. PBS 세척을 2회 반복하였고, trypsin-EDTA로 세포를 모은 후 10,000 rpm에서 2분간 원심분리 하여 최종 남은 세포 pellett을 single cell을 만들어 분석하였다. 모든 sample은 분석할 때까지 ice에 저장하였으며, flow cytometer(Cell Lab QuantaTM SC, Beckman, Chicago, IL, USA)의 FL-3 filter에서 apoptosis된 세포를 측정하였다.
PCR sample의 총 부피는 50 μL로 2 μL의 RT산물, 5 μL의 10X buffer, 5 μL의 dNTP, 3 μL의 25 mM MgCl2, 10 pmol/uL의 sense와 antisense primer pair(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 각각 1 μL씩 넣어주고 0.2 μL의 Taq DNA polymerase(Promega)를 넣어준 후, total volume 50 μL에 맞추기 위해서 멸균한 증류수를 첨가하였다.
The effect of Angelica keiskei extract (AKE) treatment on the apoptosis and early apoptosis in human breast cancer MDA-MB-231 cells. To estimate obvious apoptosis, after 24 hr incubation with AKE, apoptosis and early apoptosis detected by flow cytometry using PI staining. The letter M1 in the graph represents cells stained by PI.
이어서 EtBr 혼합염색액을 동일한 농도로 첨가하여 5분간 배양한 후, 즉시 형광현미경으로 각 처리군 별 3곳을 무작위로 선정하여 촬영하였다. 각 영상의 Hoechst 33322 염색된 세포 및 명시야 세포수를 총세포수로, EtBr로 염색된 핵이지만 온전한 핵은 non-viable cells(NVN)로, EtBr로 염색된 핵이지만 응축되고 절편화된 핵은 non-viable cells with apoptotic nuclei(NVA)로 계상하여, 각 처리군별 총세포수, NVN수, NVA수를 구하였고, Comes 등(20)이 보고한 formula를 이용하여 세포사멸 및 세포괴사를 구분하여 구하였으며, 이들의 합을 세포사로 구하여 그 분석 결과를 정성적, 정량적으로 각각 표시하였다. 모든 실험분석은 3개의 반복 군을 설정하였고, 각 군에서 400개 이상의 세포를 계상하여 그 비율을 구하였다.
PBS 세척을 2회 반복하였고, trypsin-EDTA로 세포를 모은 후 10,000 rpm에서 2분간 원심분리 하여 최종 남은 세포 pellett을 single cell을 만들어 분석하였다. 모든 sample은 분석할 때까지 ice에 저장하였으며, flow cytometer(Cell Lab QuantaTM SC, Beckman, Chicago, IL, USA)의 FL-3 filter에서 apoptosis된 세포를 측정하였다.
각 영상의 Hoechst 33322 염색된 세포 및 명시야 세포수를 총세포수로, EtBr로 염색된 핵이지만 온전한 핵은 non-viable cells(NVN)로, EtBr로 염색된 핵이지만 응축되고 절편화된 핵은 non-viable cells with apoptotic nuclei(NVA)로 계상하여, 각 처리군별 총세포수, NVN수, NVA수를 구하였고, Comes 등(20)이 보고한 formula를 이용하여 세포사멸 및 세포괴사를 구분하여 구하였으며, 이들의 합을 세포사로 구하여 그 분석 결과를 정성적, 정량적으로 각각 표시하였다. 모든 실험분석은 3개의 반복 군을 설정하였고, 각 군에서 400개 이상의 세포를 계상하여 그 비율을 구하였다.
분리된 total RNA로부터 표적 유전자의 mRNA를 역전사 시켜 cDNA를 합성하고, Bcl-2, Bax, caspase 3을 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR sample의 총 부피는 50 μL로 2 μL의 RT산물, 5 μL의 10X buffer, 5 μL의 dNTP, 3 μL의 25 mM MgCl2, 10 pmol/uL의 sense와 antisense primer pair(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 각각 1 μL씩 넣어주고 0.
사멸유도에 관여하는 유전자의 발현을 관찰하기 위해 AKE를 농도별로 처리한 MDA-MB-231 세포로부터 total RNA를 분리하였다.
세포 분석을 위한 시료 첨가 농도를 결정하기 위하여, MDA-MB-231 세포를 96 well plate에 1×104 농도로 seeding하였으며, 6시간 후 신선초추출물(Angelica keiskei extract, AKE)을 0～500 μg/mL까지 다양한 농도로 처리하였다.
0% agar, 1 mg/mL EtBr)에서 20분 동안 100 voltage에서 전기영동을 한 후 image analyzer(Gel doc XR+, Bio-Rad)로 관찰하였다. 세포관련 유전자의 발현 정도를 수치화하기 위하여 Image J 프로그램(NIH, Bethesda, MD, USA; http://rsb.info.nih.gov/ij/)을 이용하였으며, 세포사멸유전자의 대조군으로 사용되는 GAPDH 수치에 대한 각각의 유전자의 상대적인 비율(%)을 결정하였고, Bcl-2와 Bax는 세포사멸지수인 Bcl-2/Bax의 비율을 산출하였다. 이를 SPSS program을 이용하여 유의성을 검증하였다.
세포사멸이 일어나고 있는 핵의 상태를 보다 명확하게 조사하기 위하여 EtBr(red)와 Hoechst 33342(blue) 이중염색을 이용하여 apoptotic 세포와 non-apoptotic 세포를 구별하였다. Hoechst 33342/EtBr 이중염색을 통한 핵 구별 원리는 살아있는 세포일 경우 Hoechst 염색액이 침투하여 정상적인 핵을 가지며 선명한 파란색을 나타내고, apoptotic 세포들은 염색질 농축 등 apoptotic body가 존재하면서 파란색과 빨간색을 동시에 보인다.
이를 통하여 세포 수 감소와 형태학적 모양이 대조군과 비교하여 현저하게 변화되는 농도를 기준으로 그 이상과 이하의 농도인 100, 125, 150, 175 및 200 μg/mL로 좁혀 정하였고, 이 농도로 세포활성을 측정하였다.
AKE 125, 150, 175 μg/mL을 24시간 처리 후, Hoechst 33342를 PBS에 희석하여 만든 20 μg/mL의 혼합염색액을 첨가, 15분 동안 실온에서 light-shield로 배양하였다. 이어서 EtBr 혼합염색액을 동일한 농도로 첨가하여 5분간 배양한 후, 즉시 형광현미경으로 각 처리군 별 3곳을 무작위로 선정하여 촬영하였다. 각 영상의 Hoechst 33322 염색된 세포 및 명시야 세포수를 총세포수로, EtBr로 염색된 핵이지만 온전한 핵은 non-viable cells(NVN)로, EtBr로 염색된 핵이지만 응축되고 절편화된 핵은 non-viable cells with apoptotic nuclei(NVA)로 계상하여, 각 처리군별 총세포수, NVN수, NVA수를 구하였고, Comes 등(20)이 보고한 formula를 이용하여 세포사멸 및 세포괴사를 구분하여 구하였으며, 이들의 합을 세포사로 구하여 그 분석 결과를 정성적, 정량적으로 각각 표시하였다.
이에 본 연구는 ethanol/water 추출물에 포함된 다양한 생리활성물질들의 복합물이 식이용으로 이용되었을 경우, 저독성 용매 및 수용성 성분들이 극대화된 AKE가 유방암세포 MDA-MB-231에 미치는 영향을 추출물 처리농도에 따라 세포의 사멸에 미치는 영향을 핵 염색법, flow cytometry를 통하여 확인하였고, 세포사멸과 관련된 유전자 Bcl-2, Bax, caspase 3의 mRNA 발현을 RT-PCR을 통해 확인하여 신선초의 항유방암 효과 가능성을 확인하였다.
37℃ incubator에서 40분 반응시킨 후 현미경 명시야 DIC fillter에서 사진 촬영하여 mitochondrial dehydrogenase 활성 정도를 시각화하였으며, 2시간 반응시킨 후에는 50 μL의 dimethyl sulfoxide(DMSO, Welgene)를 첨가, 보라색 formazan을 용해시켜 ELISA reader(Spectra max, Vienna, MD, USA)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 결과를 정상대조군을 100%로 하여 세포생존율을 백분율(%)로 비교하여 나타내었고 흡광도를 50%로 감소시킬 수 있는 시료의 농도(IC50)를 산출하였다.
대상 데이터
신선초는 2009년도에 충북 청양군 청양읍 백전리에서 수확하여 그늘에 건조시킨 것을 경동시장으로부터 구입하여 제분공정을 통해 분말화시켰다.
인체 유방암 MDA-MB-231세포(한국세포주은행)는 10% fetal bovin serum(FBS; PAA, Exton, PA, USA), 1% penicillin-streptomysin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 넣은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, high glucose, Welgene, Daegu, Korea)을 혼합하여 만든 배양액에 2×105 cell/mL의 세포농도로 계대하였고 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다.
데이터처리
각각의 실험은 독립적으로 3번 이상 실시하였으며, 얻어진 결과는 평균과 표준편차 또는 %로 표시하였다. 실험군 간의 유의성 차이는 SPSS program(IBM, Seoul, Korea)을 이용하여 ANOVA 분석 후 Duncan's multiple range test로 p<0.
실험군 간의 유의성 차이는 SPSS program(IBM, Seoul, Korea)을 이용하여 ANOVA 분석 후 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.
gov/ij/)을 이용하였으며, 세포사멸유전자의 대조군으로 사용되는 GAPDH 수치에 대한 각각의 유전자의 상대적인 비율(%)을 결정하였고, Bcl-2와 Bax는 세포사멸지수인 Bcl-2/Bax의 비율을 산출하였다. 이를 SPSS program을 이용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
AKE 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 apoptosis를 보다 더 확실하게 확인하기 위하여 FACS의 방법을 이용하였다. Apoptosis된 세포 내 DNA를 염색해 주는 PI(Sigma) dye를 AKE가 24시간 지속 처리된 세포에 2 μg/mL 농도로 첨가한 후 37℃ incubator에 10분 방치하였다.
성능/효과
150 μg/mL 처리 군에서는 대조군 대비 약 50%의 세포사멸을 나타냈으며, 175, 200 μg/mL 처리 군의 경우에는 Fig. 1B의 96 well plate에서 거의 무색이 나타난 것과 같이 세포사멸이 60% 이상으로 나타났다.
AKE 처리에 따른 MDA-MB-231세포의 apoptosis를 보다 확실하게 증명하기 위하여 early apoptosis까지 측정할 수 있는 FACS로 PI의 형광밀도를 분석한 결과, 농도가 증가함에 따라 점차적으로 높은 강도의 형광밀도가 관찰되었다(Fig. 3). 유입된 전체 세포에 대한 PI 양성반응 세포의 비율이 대조군의 경우 3.
AKE를 125, 150, 175 μg/mL를 처리하고 24시간 지속 후 EtBr과 Hoechst 33342 염색혼합액을 첨가하여 형광현미경에서 사진 촬영한 결과, 농도 의존적으로 세포사멸이 관찰되었다(Fig. 2A).
Apoptosis를 유도하는 마지막 단계에서 활성화되는 가장 중요한 실행자인 caspase-3의 mRNA 확인 결과, 모든 AKE 처리군에서 대조군 대비 점차적인 증가율을 보였으며(p<0.05)(Fig. 4A, 4B), 특히 175 μg/mL 처리 농도에서 급격히 증가되었다.
Apoptotic 세포와 non-apoptotic 세포를 구분하고 정량 수치화하기 위하여 살아있는 세포, apoptotic 세포 및 nonapoptotic 세포 수를 기록하여 세포사멸율을 나타낸 결과(Fig. 2B), 유의적으로 세포사멸율이 증가하였으며(p<0.05), 그중 농도 의존적으로 나타난 apoptosis는 150 μg/mL 처리군에서 현저한 증가율을 보이며 전체적으로 큰 증가율을 나타냈다.
그 결과, 최종적인 AKE 처리농도는 세포 수의 감소, 세포의 형태학적 모양을 고려하여 125 μg/mL와 큰 차이가 없었던 100 μg/mL, 세포활성 측정 결과에서 세포 독성을 크게 나타내었던 200 μg/mL 처리농도는 제외하고, 125, 150, 175 μg/mL로 결정하였다.
AKE 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 apoptosis 급격한 증가는 수동적 세포예정사인 necrosis와는 달리 세포 내부의 신호에 따라 여러 단백질 활성의 조절과 유전자의 발현을 통하여 일어나는 능동적인 세포예정사이므로 AKE의 항암효과를 확실히 뒷받침해주는 증거로 볼 수 있다. 그러나 necrosis의 증가도 함께 일어나는 것으로 보아 AKE 처리에 따른 MDA-MB-231 세포사멸에는 AKE의 독성도 작용하는 것으로 판단되어지며, 세포사멸의 증가는 MTT 분석 결과와 유사한 경향을 나타낸 것으로 보아 mitochondrial dehydrogenase의 활성이 감소되면서 연이어 세포사멸이 증가 되는 것으로 사료된다.
대조군에서의 세포는 둥근 모양의 핵을 가지거나 유사분열을 하고 있는 모습을 띄며 선명한 파란색을 나타내어 대부분의 세포가 건강한 것을 확인할 수 있었고, 125 μg/mL 처리 군부터는 변형된 핵의 모양이 관찰되었으며 EtBr 염색 세포가 발견되었다.
세포사멸 촉진 유전자인 Bax의 발현은 AKE 모든 처리 군에서 농도 의존적으로 유의적인 증가가 관찰되어졌으며(p<0.05)(Fig. 4A, 4B), 특히 175 μg/mL 처리 농도에서 급격한 증가를 나타내었다.
세포사멸을 억제, 지연시켜 세포의 생존을 연장시키는 유전자인 Bcl-2의 발현은 AKE 150 μg/mL 처리 군에서부터 대조군 대비 현저한 감소율을 보이며 모든 처리 군에서 농도 의존적으로 유의적인 감소를 나타냈다(p<0.05)(Fig. 4A, 4B).
유입된 전체 세포에 대한 PI 양성반응 세포의 비율이 대조군의 경우 3.14%, 125 μg/mL 처리 군에서는 28.2%, 150 μg/mL에서는 84.75%, 175 μg/mL에서는 96.57%로 처리군 간 크게 차이를 보이며 증가되었다.
이어서 MTT시약 반응 2시간 후, formazan을 용해시켜 흡광도를 측정한 결과, 농도 의존적으로 감소하였으며(p<0.05)(Fig. 1B), 대조군 대비 백분율로 표시하여 나타낸 결과, 100 μg/mL 처리 군에서부터 약 30%의 세포사멸을 나타내며 점진적인 저하를 가져왔다.
이와 같은 결과는 결국 AKE 세포사멸의 증가와 관련되는 것으로 세포사멸의 지표로 사용되는 Bcl-2와 Bax의 비율을 구해본 결과, 큰 유의적인 차이를 보이며 감소하였다(p<0.05)(Fig. 5).
인체 유방암세포 MDA-MB-231에 AKE 100, 125, 150, 175 및 200 μg/mL를 24시간 지속시킨 후 MTT시약 반응 40분 후 그 영상을 촬영한 결과, 대조군은 대부분의 세포에 진한 보라색의 formazan이 형성된 반면, AKE 100, 125 μg/mL 처리 군에서는 대조군에 비해 옅은 보라색을 띄었으며, 일부 효소반응이 나타나지 않은 세포도 발견되었다.
즉, MTT 분석에서 살펴본 바 AKE 처리로 인하여 MDAMB-231 세포의 mitochondrial dehydrogenase 활성이 저하되어 결국 세포사멸의 증가를 가져왔다. Heo 등(22)의 연구에서 신선초와 같은 미나리과인 당귀(Angelica gigas)의 추출물을 유방암 세포 MCF-7에 첨가하였을 때 농도 의존적으로 생존율 감소가 관찰되었으며, Hsu 등(12)의 연구에서는 신선초의 대표적 단일화합물인 chalcone을 유방암세포 MCF7과 MDA-MB-231에 0, 2.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
apoptosis 반응의 원인은?
세포의 죽음은 크게 세포사멸(apoptosis)와 세포괴사(necrosis)로 구분되며, 그중 apoptosis는 세포 내부의 신호에 따른 여러 단백질 활성의 조절과 유전자의 발현을 통하여 일어나는 능동적인 세포예정사로 알려져 있다(4). 방사선이나 열의 충격, 독소, 박테리아나 바이러스에 의한 감염 등에 의한 세포의 손상이나 심한 스트레스로 apoptosis 반응이 나타나며, 그 이상은 다양한 질병을 초래하는데 특히 암과 관련된다.
apoptosis란?
세포의 죽음은 크게 세포사멸(apoptosis)와 세포괴사(necrosis)로 구분되며, 그중 apoptosis는 세포 내부의 신호에 따른 여러 단백질 활성의 조절과 유전자의 발현을 통하여 일어나는 능동적인 세포예정사로 알려져 있다(4). 방사선이나 열의 충격, 독소, 박테리아나 바이러스에 의한 감염 등에 의한 세포의 손상이나 심한 스트레스로 apoptosis 반응이 나타나며, 그 이상은 다양한 질병을 초래하는데 특히 암과 관련된다.
Apoptosis를 유도하는 경로에서 활성화되는 protease 중 caspase의 특징은?
Apoptosis와 관련된 유전자는 Bcl-2 family 중 apoptosis 억제 유전자인 Bcl-2와 이를 유도하는 유전자인 Bax가 존재하여 길항적으로 조절된다. 또한 apoptosis를 유도하는 경로에서 활성화되는 protease 중, caspase가 세포사멸 시 활성화 되는 가장 중요한 실행자로 알려져 있으며, 이 효소의 활성을 통하여 세포사멸 정도를 파악할 수 있다(5,6).
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