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문제 정의
- 이러한 미생물을 이용한 생물적 방제는 일년생 작물이나 고추, 오이, 상추 등 엽채류에서는 많은 연구가 진행되고 있으나 다년생 목본류인 감귤을 대상으로 한 연구는 미비한 실정이다(Cho 등, 2007; Kim, 2002). 따라서 본 연구는 제주 친환경 농가에서 큰 문제가 되고 있는 감 더뎅이병을 식물근권에서 분리한 세균을 통하여 방제할 수 있는 방안을 마련하고자 실시하였다.
제안 방법
- 3. Fluorescence microscope observation of infection structures on the citrus leaves untreated (A), pre-treated with suspension of rhizobacterial strains (B: THJ609-3, C: MRL 408-3, D: TRH 423-3) or treated with fungicide (E: Imibenconazol) at 1 day, 5 days, 10 days after inoculation with Elsinoe fawcettii. Abb.
- 3 mM의 dNTP 1 µl, 10 pmol의 primer 각 1 µl, 10 × Buffer 4 µl, 5 unit/ µl의 Taq DNA polymerase(iNtRON Co, Daejeon, Korea)를 1 µl의 volume 으로 넣고 멸균수로 반응액의 부피를 최종 40 µl가 되게 하였다. PCR 증폭 조건은 PCR Thermal Cycler Dice TP600(TaKaRa, Japan)을 사용하여 96℃에서 2분간 처리후, 94℃에서 30초, 55.9℃에서 30초, 72.0℃에서 30초의 조건에서 30회 반복하였다. 마지막 cycle에서는 72.
- 각각의 식물근권세균에서 유래된 total DNA에서 rDNA의 ITS(Internal Transcribe Spaces) 염기서열을 universal primer 38r: 5'-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3'와 72f:5'-TGC GGC TGG ATC TCC TT-3'(Martin-Laurnet 등, 2001)를 이용하여 동정하였다.
-
감귤 더뎅이병균 접종 후 형광현미경 관찰.
- 감귤 더뎅이병균에 대한 항균 효과가 있는 식물근권세균 THJ 609-3, MRL 408-3, TRH 423-3이 감귤 잎에 방제효과가 있는지 알아보기 위하여 각각의 균주를 TSA배지에 28℃ 항온기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양한 배지에 멸균수를 10 ml를 넣고 백금이로 세균을 긁어 현탁액을 만든 후 UVvisible spectrophotometer(Varian, AU/CARY 50 Conc, Victoria, Austalia)를 이용하여 2.
- 감귤 더뎅이병균에 대해 억제력이 있는 식물근권세균 THJ 609-3, MRL 408-3과 TRH 423-3을 ITS 38F와 72R의 primer를 이용하여 rDNA의 특정유전자를 증폭하여 동정하였다. 증폭된 유전자의 염기서역 분석을 AB program에 의해 진행하여 THJ 609-3, MRL 408-3과 TRH 423-3은 각각 320 bp, 660 bp, 538 bp의 sequence를 확인하였다(Fig.
- 농가의 약제 살포 방법을 고려하여 식물근권세균을 식물에 분무했을 때의 직접적인 효과를 알아보기 위해 감귤 더뎅이병균에 대해 항균 효과가 있는 식물근권세균 THJ 609-3, MRL 408-3과 TRH 423-3을 각각 감귤 잎에 전 처리한 후 감귤 더뎅이병균 현탁액을 접종하였다.
- 7 × 107 cfu/ml) 300 µl을 PDA배지에 도말한 후 27℃항온기에 24시간 배양한 후 미리 tryptic soy agar(TSA)배지에서 28℃에서 2일간 배양한 식물근권세균이 포함된 블록(직경 8 mm)을 배지의 중앙에 치상하여 27℃에서 5일간 배양하였다. 대조구는 식물근권세균이 포함되지 않은 TSA배지 블록을 치상하였다. 항균 효과의 유무는 배지 중앙에 형성된 감귤 더뎅이병균의 생장 저지원의 직경을 측정함으로써 평가하였고 실험당 각각 6개 plate씩 분리된 3반복의 실험을 수행하였다.
- 더뎅이병균 접종은 감귤식물체의 잎에 이슬이 맺힐 정도로 분무 접종하였고 접종 후 상대습도가 90−99%, 온도 27±1℃가 유지되는 dew chamber에서 24시간 동안 놓았다가 온도 27±1℃, 습도 70−80%를 유지하는 식물배양실로 옮겨 접종 14일이 지난 후 감귤 더뎅이병균에 의해 감염된 병반수를 조사하였다.
- 현탁액은 감귤나무 신 초에 이슬이 맺히는 정도로 분무 접종한 후 감귤 더뎅이 병균을 접종하기 전까지 상온에서 1시간 동안 자연 건조시켰다. 또한 감귤 더뎅이병에 대한 식물근권세균의 억제 효과를 평가하기 위하여 일반적으로 농가에서 사용하는 감귤 더뎅이병균 살균제인 Imibenconazole(확시란, 동방아그로)를 농약사용지침서에 따라 관행농도로 살포하였고 무처리 식물체는 식물근권세균 현탁액 대신 멸균수를 분무하였다.
- 묘목을 상토(뚝심이)와 일반 토양을 1:2의 비율로 섞인 토양을 포함한 화분(직경 30 cm)에 옮겨 심은 후 주간 25±1℃, 야간 18±1℃로 항온을 유지하는 유리 온실에서 생육시켰으며 실험에는 가지에서 20−25일 동안 자란 신초를 이용하였다.
- 배양한 배지에 멸균수를 10 ml를 넣고 백금이로 세균을 긁어 현탁액을 만든 후 UVvisible spectrophotometer(Varian, AU/CARY 50 Conc, Victoria, Austalia)를 이용하여 2.1 × 106 cfu/ml의 농도가 되도록 조절하고 tween 20을 총부피의 0.01%가 되도록 첨가하여 세균현탁액을 조제하였다.
- 잎 조직을 1% 물한천 배지(WA)에 치상하여 27℃에서 3일간 배양한 후 잎 조직 주변에 자라는 균사를 감자한천배지(PDA)에 재배양하였다. 분리한 균의 균사를 현미경 상에서 확인한 후 감귤더뎅이병균으로 동정하였다.
- 선발된 식물근권세균이 감귤 더뎅이병균에 대한 직접적인 항균 효과를 알아보기 위하여 감귤 더뎅이병균 현탁액(4.7 × 107 cfu/ml) 300 µl을 PDA배지에 도말한 후 27℃항온기에 24시간 배양한 후 미리 tryptic soy agar(TSA)배지에서 28℃에서 2일간 배양한 식물근권세균이 포함된 블록(직경 8 mm)을 배지의 중앙에 치상하여 27℃에서 5일간 배양하였다.
- 식물근권 세균 THJ 609-3, MRL 408-3과 TRH 423-3을 전 접종한 감귤 식물에서 감귤 더뎅이병 진전 억제 기작을 살펴보기 위해 병원균 접종 후 시간 별로 잎 표면의 병원균 포자수, 발아율 및 식물체의 괴저수를 조사하였다.
- 염색된 잎 조직들은 필터 05(BP 400-440, FT 460, LP 470)가 설치된 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 감귤 더뎅이병균의 포자수와 포자의 발아율 및 식물조직의 괴저반응 수를 세어 집계하였다. 실험은 각각 처리된 식물체에서 신초당 1조각씩 총 4개 조각을 관찰하였으며 실험은 총 3번의 반복 실험을 하였다.
- 더뎅이병균 접종은 감귤식물체의 잎에 이슬이 맺힐 정도로 분무 접종하였고 접종 후 상대습도가 90−99%, 온도 27±1℃가 유지되는 dew chamber에서 24시간 동안 놓았다가 온도 27±1℃, 습도 70−80%를 유지하는 식물배양실로 옮겨 접종 14일이 지난 후 감귤 더뎅이병균에 의해 감염된 병반수를 조사하였다. 실험은 일회 처리당 3개 식물체를 사용하여 실시하였으며 총 3회 실험을 반복하여 시행하였다.
- 05% (w/v) uvitex 2B(diethanol, polyscience)에서 20분 동안 염색하였고 PBS로 10분 동안 3번 세척하였다. 염색된 잎 조직들은 필터 05(BP 400-440, FT 460, LP 470)가 설치된 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 감귤 더뎅이병균의 포자수와 포자의 발아율 및 식물조직의 괴저반응 수를 세어 집계하였다. 실험은 각각 처리된 식물체에서 신초당 1조각씩 총 4개 조각을 관찰하였으며 실험은 총 3번의 반복 실험을 하였다.
- 살균한 조직을10분간 3회 살균수로 세척한 후 70% ethanol에 30초간 다시 살균하고 멸균된 filter paper(직경 90 mm)로 수분을 제거하였다. 잎 조직을 1% 물한천 배지(WA)에 치상하여 27℃에서 3일간 배양한 후 잎 조직 주변에 자라는 균사를 감자한천배지(PDA)에 재배양하였다. 분리한 균의 균사를 현미경 상에서 확인한 후 감귤더뎅이병균으로 동정하였다.
- 감귤 더뎅이병균에 대해 억제력이 있는 식물근권세균 THJ 609-3, MRL 408-3과 TRH 423-3을 ITS 38F와 72R의 primer를 이용하여 rDNA의 특정유전자를 증폭하여 동정하였다. 증폭된 유전자의 염기서역 분석을 AB program에 의해 진행하여 THJ 609-3, MRL 408-3과 TRH 423-3은 각각 320 bp, 660 bp, 538 bp의 sequence를 확인하였다(Fig. 4).
- 채집한 잎은 살균된 면도날을 이용하여 병반 주변을 3.0 × 3.0 mm의 크기로 잘라 1%의 sodium hypochlorite solution으로 30초간 표면살균 하였다.
- 대조구는 식물근권세균이 포함되지 않은 TSA배지 블록을 치상하였다. 항균 효과의 유무는 배지 중앙에 형성된 감귤 더뎅이병균의 생장 저지원의 직경을 측정함으로써 평가하였고 실험당 각각 6개 plate씩 분리된 3반복의 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 제주대학교 식물병리학실험실에서 2003년−2007년간 제주도 한라산 중심으로 산간지역, 중산간 지역, 해안지역에서 자생하는 1년생 식물체를 채집하여 Lee 등.(2003)이 제시한 실험 방법으로 식물근권세균 총 215개를 분리하였고 그 중 식물병에 저항성 유도 또는 항균 효과가 입증된 세균을 10개를 선발하여 본 실험에 이용하였다.
- DNA sequence는 Genetic Analyzer(Applied Biosystems 3130xl, CA)에 의해 시행 후 Applied Biosystems(AB, version 1.0)을 이용하여 분석하였고 분석된 자료는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지의 Basic Local Alignment Search Tool(Blast; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 동정하였다.
- 감귤 더뎅이병균을 분리하기 위해 제주특별자치도 서귀포시 위치한 농촌진흥청 국립원예특작과학원 감귤시험장 시험포장에서 육안으로 감귤 더뎅이병에 감염된 잎을 채집하였다. 채집한 잎은 살균된 면도날을 이용하여 병반 주변을 3.
- 본 실험에 사용한 감귤나무는 탱자 뿌리에 접붙인 온주밀감(품종: 궁천)으로 노지에서 3년간 생장한 묘목을 사용하였다. 묘목을 상토(뚝심이)와 일반 토양을 1:2의 비율로 섞인 토양을 포함한 화분(직경 30 cm)에 옮겨 심은 후 주간 25±1℃, 야간 18±1℃로 항온을 유지하는 유리 온실에서 생육시켰으며 실험에는 가지에서 20−25일 동안 자란 신초를 이용하였다.
데이터처리
- 선발된 식물근권세균에 의해 형성된 감귤 더뎅이병균 생장저지원 직경, 감귤 더뎅이병균 접종 후 감귤식물체에 형성된 병반수, 형광현미경 관찰을 통한 감귤 더뎅이병균의 포자수, 발아율, 식물 조직의 괴저반응 수의 분산분석과 처리평균 사이의 비교를 위하여 Duncan 검정을 SAS Institute, version 8.02(Statistical Anaysis System)을 이용 분석하였다.
이론/모형
- 0℃에서 2분 동안 처리하였다. DNA 증폭 유무를 1% agarose gel에 Ethidium Bromide(EtBr)를 넣어 염색한 후 UV에서 확인하고 DNA elution은 NucleoSpinkits(Macherey-Nagel, Germany)에 기술된 방법대로 수행하였다.
- 식물 근권세균의 총DNA는 DNA추출 키트 DNeasy Blood & Tissue Kit 56 (QIAGEN™, Germany)에 기술된 방법에 따라 추출하였다.
- 식물근권 세균에 의한 감귤 더뎅이병의 감염율 억제 기작을 알아보기 위하여 선발된 식물근권세균을 선 처리한 후 감귤 더뎅이병균을 접종한 잎을 1일, 5일, 10일 후에 채취하여 Jeun 등(2000)이 제시한 형광염색방법을 따라 시행하였다. 채집한 잎은 멸균된 면도날을 이용하여 7.
성능/효과
- MRL 408-3을 처리한 잎에서도 접종 후 1일째 대조구과 별다른 차이가 없는 반면 근권세균이 포자 주변에 있는 것이 확인하였다. 접종 후 5일째는 발아관이 조금 형성되고 주변에 근권세균이 계속 접촉 되어있는 것을 확인하였으며 접종 후 10일째는 괴저가 형성되었고 대조구에 비해 진하게 나타나지 않았으며 그 수는 현저히 적게 나타났다(Fig.
- NCBI의 Gen Bank에 등록된 균주들의 database에 대해 분석된 균주들의 DNA의염기서열을 각각 비교한 결과 THJ 609-3(NCBI NO. CP000949.1)은 Pseudomonas putida로 동정되었고, MRL 408-3(NCBI NO. EF552064.1)과 TRH 423-3(NCBI NO. EF522070.1)은 Burkholderia gladioli로 동정되었다.
- 3C). TRH 423-3을 처리한 잎도 MRL 408-3의 경우와 동일하게 접종 1일째는 포자 주변에 근권세균이 있는 것이 확인되었으며, 접종 후 5일째는 발아관이 조금 형성된 발아관 주변에 처리된 근권세균이 포자 주변으로 접촉해 있는 것을 확인하였다. 접종 후 10일째는 괴저형성이 대조구에 비해 약하게 나타났으며 그 수도 적게 나타났다(Fig.
- 감귤 더뎅이병균에 직접적인 항균효과가 있는 근권세균 P. putida THJ 609-3, B. gladioli MRL 408-3과 TRH 423-3가 감귤 더뎅이병 억제 효과가 있는지 알아보기 위해 알아본 결과 P. pudia THJ 609-3의 병진전 억제효과는 무처리구에 비해 약 50%의 억제 효과를 보인 반면 B. gladioli MRL 408-3과 TRH 423-3은 모두 70%의 억제효과를 나타냈다(Fig. 2, Table 2). 이는 근권세균의 직접적인 항균 활성과는 대조적인 결과로, P.
- 감귤 잎에 무처리한 control에서의 병 진전은 접종 5일 째부터 육안으로 감귤 잎 윗면에 전체적으로 흑갈색의 작은 반점이 생기며 약하게 돌출되어 나타나는 것을 확인하였다. 접종 7일째 부터는 작은 반점이 커지면서 황갈색의 병반으로 변하며 5일째 보다 돌출 된 부분이 좀 더 두드러졌으며, 접종 14일째 부터 병징이 진행됨에 따라 병반부위에 돌기는 단단하게 조금 더 돌출되고 병반이 진하게 형성되었다.
- 괴저 현상은 모든 처리구에서 접종 후 1일째에는 괴저가 나타나지 않았고, 접종 후 5일째 괴저가 발견되었고 10일째에는 모든 처리구에서 증가하였다(Table 5). 무처리구에서는 접종 후 5일째와 10일째 각각 16.
- 근권세균을 처리한 감귤 잎에 감귤 더뎅이병균을 접종하여 침입기작을 형광현미경을 이용하여 관찰하였더니 근권세균의 항균 작용뿐 아니라 기주 식물체와의 상호 관계가 병억제에 관여된다는 것을 알 수 있었다. 즉, P.
- 농약인 Imibenconazole을 처리한 잎은 접종 후 1일째부터 포자수가 현저하게 감소하여 160여개로 조사되었으며 접종 후 5일째 및 10일째까지 비슷한 포자수를 유지하였다. 농약을 처리한 잎에서의 포자수는 근권세균을 처리한 잎에 비해 포자수가 감소하여 병진전을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다(Table 3).
- 농약인 Imibenconazole을 처리한 잎은 접종 후 1일째부터 포자수가 현저하게 감소하여 160여개로 조사되었으며 접종 후 5일째 및 10일째까지 비슷한 포자수를 유지하였다. 농약을 처리한 잎에서의 포자수는 근권세균을 처리한 잎에 비해 포자수가 감소하여 병진전을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다(Table 3).
- 한편 인공배지를 이용한 in vitro 실험에서 농약인 Imibenconazole을 관용 농도로 처리한 결과 감귤 더뎅이 병균이 거의 자라지 못했다(결과 미제시). 또한 이를 잎에 처리하였을 때 병원균 포자수가 가장 낮게 조사되었고 포자 발아율 억제도 매우 낮았다(Table 3, 4). 따라서 이는 근권세균의 경우와는 다르게 직접적인 살균작용에 의해서 병 억제가 되는 것으로 여겨진다.
- 마찬 가지로 MRL 408-3과 TRL 423-3를 선 접종한 감귤 잎에서도 더뎅이병의 병반 수가 감소되었는데 두 근 권세균 모두 THJ 609-3을 처리한 식물보다 병 억제 능력이 높았다. 병 진전은 접종 6일째는 돌기가 형성되지 않았지만 접종 7일째에 흑갈색의 작은 반점과 돌기가 약하게 형성되었으며 대조구에 비해 30%정도로 적게 나타났다.
- 무처리한 대조구에서의 접종 후 1일째 감귤 잎의 표면을 염색 후 감귤 더뎅이병균의 포자가 대략 10개 이상으로 뭉쳐져 있었으며 포자에 2−3개 정도 발아관이 조금씩 형성 되었으며 접종 후 5일째에서는 포자에서 발아관이 길게 형성되어 나타났고, 그 주변으로 괴저현상이 나타나기 시작했다.
- 무처리한 잎에서 조사된 포자수는 접종 후 1일째, 5일째, 10일째 약 1,000−1,200개로 측정된 반면 THJ 609-3을 처리한 잎에서는 약 630−670개로 측정되어 대조구에 비해 약 40%가 감소된 것으로 확인되었으며, MRL 408-3과 TRH 423-3을 처리한 잎에서 접종 후 1일째와 5일째에 포자수가 더욱 감소하여 340−360개였으며 접종 후 10일째는 270여개로 감소하였다.
- 반면 식물근권세균 THJ 609-3를 전 접종한 감귤 잎에서의 병 진전은 대조구보다 하루 늦은 접종 6일째 감귤 잎에 흑갈색의 작은 반점이 발생했으며, 전체적으로 작은 반점이 형성되었던 대조구에 비해 50% 정도 적게 나타났다. 접종 8일째부터는 반점이 황갈색의 병반이 형성되었고 돌기도 6일째에 비해 조금 더 도드라졌으며, 접종 14일째에는 형성된 병반이 진하게 변하였고 병반수 측정 결과는 평균 16.
- 본 연구에서 선발된 근권세균 P. putida THJ 609-3, B. gladioli MRL 408-3과 TRH 423-3은 감귤 더뎅이병균과 대치 배양 시 저지원을 형성하여 직접적인 항균효과가 있음을 확인하였다(Fig. 1, Table 1). 이와 유사하게 식물병원균에 대한 직접적인 항균효과가 있는 미생물에 대해서는 많은 보고가 있으며(Kang 등, 2005; Lee 와 Jeun, 2005), 항균 작용은 미생물에서 분비되는 항생물질에 의해 나타나는데 Pseudomonas속에 속하는 미생물에서는 2,4- diacetyphloroglucinol, pyoluteorin, pyrrolnitrin 등의 항생물질이 분비된다고 보고되었다(Raaijmakers 등, 1997).
- 선발된 10개의 식물근권세균의 감귤 더뎅이병균에 항균 효과를 알아보기 위해 PDA배지를 얹어 놓은 근권세균 중 THJ 609-3, MRL 408-3과 TRH 423-3을 치상한 배지에서 식물근권세균 주위에 저지원이 형성되었으며 이는 감귤 더뎅이병균에 대한 직접적인 항균 작용이 있다는 것을 의미한다(Fig. 1). 특히, 식물근권세균 THJ 609-3에 의해 형성된 저지원 직경은 평균 62.
- 1C, 1D, Table 1). 선발된 나머지 7개 식물근권세균은 저지원을 형성하지 않아 감귤 더뎅이병균에 대한 직접적인 항균 효과가 없는 것으로 나타났다(결과 미제시).
- 1B, Table 1). 식물근권세균 MRL 408-3과 TRH 423-3은 각각 47.1 및 48.3 mm의 크기 저지원을 형성하여 감귤 더뎅이 병균의 성장을 뚜렷하게 억제하였다(Fig. 1C, 1D, Table 1). 선발된 나머지 7개 식물근권세균은 저지원을 형성하지 않아 감귤 더뎅이병균에 대한 직접적인 항균 효과가 없는 것으로 나타났다(결과 미제시).
- 식물근권세균 처리구인 THJ 609-3을 처리한 잎의 접종 후 1일째 현미경 관찰은 대조구와 큰 차이가 없었고, 접종 5일째도 발아관이 뚜렷하고 길게 형성되며 약하게 괴저현상이 생기는 것을 확인하였다. 그러나 접종 후 10일 째는 괴저현상이 나타났지만 대조구 보다는 약하게 형성되었다(Fig.
- 이들 결과를 통해서 근궤세균에 의한 병 억제력은 농약에서와는 다르게 근권세균의 직접적인 항균활성에 전적으로 의존하지 않고 기주식물을 포함한 환경 요인에 의해 큰 영향을 받는다고 제시할 수 있다. 또한 감귤 더뎅이병의 생물학적 방제에 대한 연구가 거의 전무한 실정에서 본 연구를 토대로 최근 증가하고 있는 친환경 농가를 대상으로 농약을 대체할 수 있는 방제 수단을 개발하는데 유용하게 이용할 수 있을 것이라 기대할 수 있다.
- 1, 2). 이를 통해 근권세균에 의한 감귤 더뎅이병 억제 기작은 근권세균의 자체 항균 활성 외에도 다른 요인이 관여되어 있다는 것을 알 수 있었다.
- gladioli MRL 408-3과 TRH 423-3을 처리한 잎에서의 포자수 보다 2배 정도 많이 관찰되었다(Table 3). 인공 배지를 이용한 in vitro 실험에서 P. putida THJ 609-3이 감귤 더뎅이병균에 대한 직접적인 항균 활성이 높았더라도, 감귤 잎 표면에서는 다른 두 근권세균인보다 병원균의 포자수를 감소시키지 못하고 오히려 B. gladioli MRL 408-3과 TRH 423-3에 의한 포자수 감소가 높은 것으로 나타났으며 이는 높은 병 방제가의 원인이 된 것으로 생각된다(Table 2, 3).
- 잎 표면에서 더뎅이병균의 발아율은 무처리한 잎에서 접종 후 1일째 5.8%로 가장 높았으며 THJ 609-3을 처리한 잎에서 2.5%의 발아율로 무처리에 비해 50% 정도 감소하였다(Table 4). 한편 병 억제가 효과가 뛰어났던 MRL 408-3 및 TRH423-3을 처리한 잎에서는 발아율이 모두 1.
- 반면 식물근권세균 THJ 609-3를 전 접종한 감귤 잎에서의 병 진전은 대조구보다 하루 늦은 접종 6일째 감귤 잎에 흑갈색의 작은 반점이 발생했으며, 전체적으로 작은 반점이 형성되었던 대조구에 비해 50% 정도 적게 나타났다. 접종 8일째부터는 반점이 황갈색의 병반이 형성되었고 돌기도 6일째에 비해 조금 더 도드라졌으며, 접종 14일째에는 형성된 병반이 진하게 변하였고 병반수 측정 결과는 평균 16.5개로 나타났다(Fig. 2B, Table 2).
- MRL 408-3을 처리한 잎에서도 접종 후 1일째 대조구과 별다른 차이가 없는 반면 근권세균이 포자 주변에 있는 것이 확인하였다. 접종 후 5일째는 발아관이 조금 형성되고 주변에 근권세균이 계속 접촉 되어있는 것을 확인하였으며 접종 후 10일째는 괴저가 형성되었고 대조구에 비해 진하게 나타나지 않았으며 그 수는 현저히 적게 나타났다(Fig. 3C). TRH 423-3을 처리한 잎도 MRL 408-3의 경우와 동일하게 접종 1일째는 포자 주변에 근권세균이 있는 것이 확인되었으며, 접종 후 5일째는 발아관이 조금 형성된 발아관 주변에 처리된 근권세균이 포자 주변으로 접촉해 있는 것을 확인하였다.
- 근권세균을 처리한 감귤 잎에 감귤 더뎅이병균을 접종하여 침입기작을 형광현미경을 이용하여 관찰하였더니 근권세균의 항균 작용뿐 아니라 기주 식물체와의 상호 관계가 병억제에 관여된다는 것을 알 수 있었다. 즉, P. putida THJ 609-3을 처리한 잎에서 감귤더뎅이병균의 포자수가 다른 두 근권세균인 B. gladioli MRL 408-3과 TRH 423-3을 처리한 잎에서의 포자수 보다 2배 정도 많이 관찰되었다(Table 3). 인공 배지를 이용한 in vitro 실험에서 P.
- 특히 주목할만한 것은 현미경상에서 관찰된 괴저 수가 육안으로 관찰된 처리 간 병반 수 차이와 유사하게 나타났다(Table 2, 5). 즉, 농약 Imibenconazole을 처리한 잎에서 육안으로 관찰한 병반 수가 가장 적은 것(Table 2)과 마찬가지로 현미경 상에서 관찰한 괴저 수도 가장 적었다(Table 5). 이는 근권세균인 MRL 408-3 및 TRH423-3을 처리한 잎에서도 마찬가지 결과가 관찰되었다(Table 2, 5).
- 1). 특히, 식물근권세균 THJ 609-3에 의해 형성된 저지원 직경은 평균 62.1 mm로 가장 넓게 나타났으며 감귤 더뎅이 병균은 배지 가장자리에서만 생장할 수 있었다(Fig. 1B, Table 1). 식물근권세균 MRL 408-3과 TRH 423-3은 각각 47.
- 0%로 농약인 Imibenconazole을 처리한 잎에서의 발아율과 비슷하였다(Table 4). 하지만 접종 후 10일째 더뎅이병균의 발아율은 병 억제 효과와는 무관하게 농약을 처리한 잎에서 가장 높은 21.8%였고 병억제 효과가 높았던 근권세균 MRL 408-3 및 TRH423-3을 처리한 잎에서도 무처리한 잎에 비해 높은 발아율을 나타냈다(Table 4).
- 5%의 발아율로 무처리에 비해 50% 정도 감소하였다(Table 4). 한편 병 억제가 효과가 뛰어났던 MRL 408-3 및 TRH423-3을 처리한 잎에서는 발아율이 모두 1.0%로 농약인 Imibenconazole을 처리한 잎에서의 발아율과 비슷하였다(Table 4). 하지만 접종 후 10일째 더뎅이병균의 발아율은 병 억제 효과와는 무관하게 농약을 처리한 잎에서 가장 높은 21.
- 한편 식물근권세균의 병 억제 효과를 시판 농약과 비교하기 위하여 Imibenconazole을 같은 방법으로 처리한 감귤 잎에서는 접종 7일째에 감귤 나무의 10개 신초 중 2−3개의 잎에서 감귤 더뎅이병균의 돌기와 그 위에 흑갈색의 작은 반점이 1−2개 정도 형성되어 대조구에 비해 병진전이 뚜렷하게 억제되었다.
후속연구
- 이들 결과를 통해서 근궤세균에 의한 병 억제력은 농약에서와는 다르게 근권세균의 직접적인 항균활성에 전적으로 의존하지 않고 기주식물을 포함한 환경 요인에 의해 큰 영향을 받는다고 제시할 수 있다. 또한 감귤 더뎅이병의 생물학적 방제에 대한 연구가 거의 전무한 실정에서 본 연구를 토대로 최근 증가하고 있는 친환경 농가를 대상으로 농약을 대체할 수 있는 방제 수단을 개발하는데 유용하게 이용할 수 있을 것이라 기대할 수 있다.
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