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문제 정의
- 따라서 본 연구는 유기 농산물을 생산하기 위하여 혈분을 이용하여 제조한 액비에 대해 발효과정에서 나타나는 화학성분과 미생물상의 변화를 알아보기 위하여 본 시험을 수행하였다.
- 본 실험에서는 유기재배 농가에서 사용되고 있는 액비의 특성을 과학적으로 구명하고자 발효기간 동안 액비의 화학성, 미생물상의 변화, 그리고 액비 처리가 무 생육에 미치는 효과를 조사하였다. 액비의 pH는 발효가 진행됨에 따라 7.
제안 방법
- 발아력 검정은 무 종자를 대상으로 petri dish에 여과지를 깔고 종자 30립씩을 치상하였다. 70일간 발효시킨 액비를 농도별로 희석하여 6 ml씩 분주 한 후 온도 25℃ 습도 60%로 조절된 배양기(Sanyo MIR 253)내 치상 후 7일째 뿌리와 줄기의 생장상태를 조사하였다.
- PCR 증폭산물은 BioRad Dcode System(Bio-Rad Laboratories, USA)으로 denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)를 수행하여 분석하였다. Denaturing gradient gel은 8%의 polyacrylamide에 urea와 formamide 변성제를 40%에서 70%까지 농도구배가 연속적으로 형성되도록 첨가하여 제작하였다. 이와 같이 제작된 겔에 PCR 증폭산물 20 μl를 loading하여 1×TAE 완충용액(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.
- PCR 반응물의 조성은 1×반응용액 (100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 500 μg ml-1 BSA, pH 8.3), 200 μM dNTPs, 0.1 μM primer, 그리고 2.5 U Taq polymerase를 첨가하여 총 50 μl의 혼합물을 만들고, DNA 양이 100 ng이 되도록 첨가한 후 반응을 진행시켰다.
- 최종 PCR 산물은 1% agarose gel에서 EtBr로 염색하여 band를 확인 한 후 사용하였다. PCR 증폭산물은 BioRad Dcode System(Bio-Rad Laboratories, USA)으로 denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)를 수행하여 분석하였다. Denaturing gradient gel은 8%의 polyacrylamide에 urea와 formamide 변성제를 40%에서 70%까지 농도구배가 연속적으로 형성되도록 첨가하여 제작하였다.
- 평판 배지에 적정 희석액을 접종 도말하고 표면의 수분이 완전히 제거된 후 28℃에서 3~5일간 배양하였다(서, 1997). 각 시료당 미생물 계수는 3개의 petri dish에 나타난 colony를 각각 계수한 평균값을 생균수(colony forming unit)로 계산하였다. 액비에서 분리한 세균의 동정을 위해서는 단일 콜로니를 무작위로 취하여 순수 분리한 후 제조사의 표준방법에 따라 지방산을 추출한 후 Hewlett-Packard Gas chromatography(model 6890)와 Sherlock Microbial Identification System software(Microbial ID, Inc.
- 발아력 검정은 무 종자를 대상으로 petri dish에 여과지를 깔고 종자 30립씩을 치상하였다. 70일간 발효시킨 액비를 농도별로 희석하여 6 ml씩 분주 한 후 온도 25℃ 습도 60%로 조절된 배양기(Sanyo MIR 253)내 치상 후 7일째 뿌리와 줄기의 생장상태를 조사하였다.
- 액비내 호기성 세균은 YG배지, Bacillus 속은 희석액을 80℃에서 20분간 가열하여 체세포를 사멸시킨 후 호기성 세균 계수에 사용한 YG배지를 이용하여 계수하였다. 평판 배지에 적정 희석액을 접종 도말하고 표면의 수분이 완전히 제거된 후 28℃에서 3~5일간 배양하였다(서, 1997).
- 액비로부터 total genomic DNA를 추출하기 위하여 FastDNA spin kit (MPbio)를 이용하였다. 추출한 DNA는 16S rDNA의 V3 영역의 염기서열을 증폭하기 위하여 40bp의 GC clamp가 포함된 GC341F와 518R을 사용하여 PCR을 수행하였다(Muyzer 등, 1993).
- 각 시료당 미생물 계수는 3개의 petri dish에 나타난 colony를 각각 계수한 평균값을 생균수(colony forming unit)로 계산하였다. 액비에서 분리한 세균의 동정을 위해서는 단일 콜로니를 무작위로 취하여 순수 분리한 후 제조사의 표준방법에 따라 지방산을 추출한 후 Hewlett-Packard Gas chromatography(model 6890)와 Sherlock Microbial Identification System software(Microbial ID, Inc., Newark, Del, USA)를 이용하여 동정하였다.
- 액비는 유기농 배 재배(성환, 충남) 농가에서 2009년 5월 22일 제조하여 제조 당일, 발효 30일, 70일에 액비를 채취하였다. 액비제조 방법은 600ℓ 고무통에 물 480ℓ를 채우고 혈분 140㎏, 당밀 40ℓ, 부엽토(과수원 주변 채취) 10ℓ를 차례로 첨가하여 잘 저은 후 노지에서 발효시켜 사용하였다.
- 이와 같이 제작된 겔에 PCR 증폭산물 20 μl를 loading하여 1×TAE 완충용액(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 60℃, 60 V로 16시간 동안 전기영동 하였다.
- 0)에서 60℃, 60 V로 16시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 EtBr을 사용하여 염색한 후 Image analyzer (Bio-Rad Laboratories, USA)로 확인하였다.
- 액비의 화학성 분석은 농촌진흥청 식물체 및 토양화학 분석법(2000)에 준하여 하였다. 제조된 액비의 pH와 전기전도도는 pH/EC meter(HI 9932, Hanna)로 측정하였고, 유효인산 함량은 spectrophotometer(Cintra 40, GBC Sciencetific Equipment, Ltd), 치환성 양이온, 미량원소는 ICP(Integra XL Dual, Sciencetific Equipment, Ltd), 탄소와 질소함량 측정은 원소분석기(US/Vario Max CN, Elementar Analyse system GmbH)를 이용하여 분석하였다.
- 액비로부터 total genomic DNA를 추출하기 위하여 FastDNA spin kit (MPbio)를 이용하였다. 추출한 DNA는 16S rDNA의 V3 영역의 염기서열을 증폭하기 위하여 40bp의 GC clamp가 포함된 GC341F와 518R을 사용하여 PCR을 수행하였다(Muyzer 등, 1993). PCR 반응물의 조성은 1×반응용액 (100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 1.
대상 데이터
- 액비는 유기농 배 재배(성환, 충남) 농가에서 2009년 5월 22일 제조하여 제조 당일, 발효 30일, 70일에 액비를 채취하였다. 액비제조 방법은 600ℓ 고무통에 물 480ℓ를 채우고 혈분 140㎏, 당밀 40ℓ, 부엽토(과수원 주변 채취) 10ℓ를 차례로 첨가하여 잘 저은 후 노지에서 발효시켜 사용하였다.
이론/모형
- 액비의 화학성 분석은 농촌진흥청 식물체 및 토양화학 분석법(2000)에 준하여 하였다. 제조된 액비의 pH와 전기전도도는 pH/EC meter(HI 9932, Hanna)로 측정하였고, 유효인산 함량은 spectrophotometer(Cintra 40, GBC Sciencetific Equipment, Ltd), 치환성 양이온, 미량원소는 ICP(Integra XL Dual, Sciencetific Equipment, Ltd), 탄소와 질소함량 측정은 원소분석기(US/Vario Max CN, Elementar Analyse system GmbH)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 1과 같다. DGGE profile에서는 겔상에서 다른 이동도를 나타내는 다양한 밴드들을 관찰할 수 있었고 액비 제조 시에 존재하던 많은 밴드들이 발효가 진행될수록 현저하게 줄어드는 것을 확인하였다. 이는 초기에는 다양한 미생물들이 존재하지만 발효가 진행될수록 특정한 세균만이 액비 내에 존재할 수 있다는 것을 의미한다.
- 액비 제조 직후 Bacillus속이 25%, 발효 30일째는 Bacillus 속이 65%, PaeniBacillus 속이 5%, VirgiBacillus 20%, 발효 70일째는 Bacillus 속이 47%, GeoBacillus 속이 5%, PaeniBacillus 속이 28%, VirgiBacillus 속이 13%이였으며, 발효가 진행될수록 Bacillus 유사속들이 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 Enterococcus, Rhodococcus는 제조 시에만 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이처럼 액비 제조 시 다양한 미생물이 존재하는 부엽토를 첨가하지만 발효가 진행될수록 Bacillus 유사속들이 우점하는 것을 알 수 있었다.
- 발효기간 동안 액비로부터 분리한 세균을 MIDI-FAME profiles을 이용하여 속 수준까지 동정한 결과는 Table 3과 같다. 액비 제조 직후 Bacillus속이 25%, 발효 30일째는 Bacillus 속이 65%, PaeniBacillus 속이 5%, VirgiBacillus 20%, 발효 70일째는 Bacillus 속이 47%, GeoBacillus 속이 5%, PaeniBacillus 속이 28%, VirgiBacillus 속이 13%이였으며, 발효가 진행될수록 Bacillus 유사속들이 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 Enterococcus, Rhodococcus는 제조 시에만 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 뿌리 생장은 500배 처리 시 99 mm 로 대조구보다 80% 증가하였다. 액비 처리는 줄기 생육보다는 뿌리 발달을 촉진하였으며 그 효과는 농도에 따라 차이가 있음을 확인하였다.
- 2×103 cfu/ml로 발효가 진행됨에 따라 증가하는 경향을 보였다. 액비로부터 분리한 세균은 지방산 분석을 통한 동정 결과, 발효가 진행될수록 Bacillus 유사속들이 액비내 우점하는 것을 알 수 있었으며 DGGE profile을 통해 발효과정 동안 액비내 미생물 군집의 변화를 확인하였다. 액비처리에 의한 무 유묘 생육을 살펴본 결과, 줄기보다는 뿌리 발달을 촉진하였다.
- 또한 Enterococcus, Rhodococcus는 제조 시에만 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이처럼 액비 제조 시 다양한 미생물이 존재하는 부엽토를 첨가하지만 발효가 진행될수록 Bacillus 유사속들이 우점하는 것을 알 수 있었다.
- 70일간의 발효과정을 거친 액비를 100배, 500배, 1000배 희석하여 무 종자 발아와 유묘 생육에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 4와 같으며, 원액 처리시 무 종자의 발아가 전혀 되지 않았다(데이타 미제시). 줄기 신장은 대조구 21 mm에 비하여 100배 처리시 43% 증가하였으며 500배, 1000배 처리에도 다소 증가하였다. 뿌리 생장은 500배 처리 시 99 mm 로 대조구보다 80% 증가하였다.
후속연구
- DGGE 분석은 많은 샘플에서 전체적인 미생물 종의 수 그리고 양적 변화를 하나의 gel상에서 관찰할 수 있다는 장점이 있다(이, 2006; Kim 등, 2005). 또한 특이적인 밴드의 경우에는 밴드로부터 직접 DNA를 회수한 후 sequencing을 통해 종을 확인할 수 있기 때문에 추후 액비군집의 DGGE profile로부터 밴드를 회수하여 염기서열 분석을 한 결과와 위의 MIDI분석 결과를 비교하는 것이 액비의 발효기간 동안 미생물 군집의 변화를 정확하게 파악할 수 있을 것으로 사료된다.
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