선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 현대인들의 식습관이 서구화 되어가면서 발생하는 각종 성인병 중 특히 심혈관계 질환이나 혈전증 등과 같은 질병에 대한 치료 및 예방을 위해, 본 연구에서는 우리나라 전통발효식품인 간장에서 혈전용해 효소를 생산하는 균주를 분리동정하였다.
제안 방법
- 16S rDNA 유전자 염기서열 분석은 Universal PCR primer 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')로 합성하여 분리균의 16S rDNA 유전자 단편을 PCR로 증폭시켰다.
- Astrup과 Mullertz 방법[1]을 변형하여 5 mL 인산완충용액(10 mM, pH 7.8, 0.15 M NaCl)에 fibrinogen을 0.3%가 되도록 용해시키고 1% agarose 용액을 동량 첨가하여 혼합하였다. 여기에 thrombin(100 NHI/mL)을 100 µL 첨가하여 실온에서 고화시키고 지름 5 mm 정도의 구멍을 뚫은 후, 배양액 30 µL를 분주하여 37oC에서 18시간 반응시켜 fibrin plate 용해 면적을 측정하였으며 대조구는 정제된 혈전용해효소인 plasmin(1.
- NaCl 농도에 따른 균체의 생육 및 효소활성을 측정하기 위해, LB배지의 NaCl 농도를 각각 1%, 3%, 5%, 7% 및 10%로 조정하였다. 그리고 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 30oC에서 24시간 진탕 배양하여 spectrophotometer로 탁도(OD660)를 측정하여 NaCl 농도에 따른 균체의 성장과 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 현대인들의 식습관이 서구화 되어가면서 발생하는 각종 성인병 중 특히 심혈관계 질환이나 혈전증 등과 같은 질병에 대한 치료 및 예방을 위해, 본 연구에서는 우리나라 전통발효식품인 간장에서 혈전용해 효소를 생산하는 균주를 분리동정하였다. 그리고 선발된 균주의 혈전용해 효소 생산의 최적조건 확립과 혈전용해 효소의 특성을 규명 하였다.
- NaCl 농도에 따른 균체의 생육 및 효소활성을 측정하기 위해, LB배지의 NaCl 농도를 각각 1%, 3%, 5%, 7% 및 10%로 조정하였다. 그리고 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 30oC에서 24시간 진탕 배양하여 spectrophotometer로 탁도(OD660)를 측정하여 NaCl 농도에 따른 균체의 성장과 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 8로 조정하였다. 그리고 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 30oC에서 24시간 진탕 배양한 후, 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 5%)에 100 µL 도말하여 30oC에서 24시간 배양하였다. 배양된 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차 선별한 다음, 단백질 분해능과 혈전분해능을 갖는 균주를 분리하기 위해 2차 선별을 수행하였다. R2A broth에 1% skim milk와 1.
- 배양시 온도 변화에 따른 혈전용해 효소활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 선발균 YJ11-21을 5% 접종하여 각각 30oC, 37oC 및 45oC에서 24시간 진탕 배양한 후, 생육도와 효소활성을 측정하였다(Fig. 8). Fig.
- 배양액 초기 pH 변화에 따른 균체의 생육 및 효소활성을 측정하기 위하여 LB배지의 pH를 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 각각 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 조정하였다. 제조된 배지에 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 30oC에서 24시간 진탕 배양한 후, spectrophotometer로 탁도(OD660)를 측정하여 균체의 생육정도와 fibrin plate assay로 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 배지의 초발 pH 변화가 혈전용해 효소 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 pH를 4~10으로 조정하여 선발균의 생육도와 혈전용해효소활성을 측정하였다(Fig. 7). 그 결과, 배양배지의 pH 5~10까지 안정한 효소활성을 보였다.
- 분리 선발한 혈전용해 효소활성을 가지는 균주 YJ11-21를 LB배지에 5% 농도로 접종하여 30oC에서 72시간 동안 진탕 배양하면서 경시적으로(4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72시간) 배양액을 취하여 spectrophotometer로 탁도(OD660)를 측정하여 균체의 성장을 측정하고 fibrin plate assay로 혈전용해 효소활성을 측정하여 배양시간의 영향을 조사하였다.
- 선발된 균주 B. licheniformis YJ11-21은 대두발효 식품인 재래간장에서 분리하였고, 효소생산이 염의 농도에 영향을 받을 것으로 예상되어 NaCl 농도에 따른 혈전용해 효소활성과 균주의 생육도를 측정하였다(Fig. 6). 그 결과, 1% NaCl을 첨가한 배지에서 가장 높은 혈전용해 효소활성이 나타났으며 3% NaCl 첨가 배지에서 분리 균주의 생장률이 가장 높았다.
- 2% plant agar 첨가하여 만든 skim milk plate와 fibrin plate에 분리균을 접종한 후, clear zone을 생성하는 균주를 선발하였으며 대조구로는 Bacillus subtilis KACC 10114(농촌진흥청 한국농업미생물보존센터)를 사용하였다. 선발된 균주를 LB배지(bacto tryptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%, pH 6.8)에 30oC에서 24시간 배양한 후, 10,000 rpm, 4oC에서10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 그 상징액을 조효소액으로 하여 혈전용해 효소활성을 측정하였다. 각 실험의 효소활성은 3회 측정하여 평균값으로 표기하였다.
- 수집한 간장 시료(10 g)을 0.85% NaCl용액으로 현탁하여 R2A agar 배지(yeast extract 0.05%, proteose peptone no. 3 0.05%, casamino acids 0.05%, dextrose 0.05%, soluble starch 0.05%, sodium pyruvate 0.03%, dipotassium phosphate 0.03%, magnesium sulfate 0.005%, agar 1.5%)에 100 µL 도말하여 30oC에서 24시간 배양하였다.
- 여기에 thrombin(100 NHI/mL)을 100 µL 첨가하여 실온에서 고화시키고 지름 5 mm 정도의 구멍을 뚫은 후, 배양액 30 µL를 분주하여 37oC에서 18시간 반응시켜 fibrin plate 용해 면적을 측정하였으며 대조구는 정제된 혈전용해효소인 plasmin(1.0 units/mL)을 사용하여 다음의 식으로 혈전 용해능을 계산하였다.
- 온도 변화가 혈전용해 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, LB배지에 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 각각 30oC, 37oC 및 45oC에서 24시간 진탕 배양하여 spectrophotometer로 탁도(OD660)를 측정하여 균체의 성장과 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 배양액 초기 pH 변화에 따른 균체의 생육 및 효소활성을 측정하기 위하여 LB배지의 pH를 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 각각 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 조정하였다. 제조된 배지에 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 30oC에서 24시간 진탕 배양한 후, spectrophotometer로 탁도(OD660)를 측정하여 균체의 생육정도와 fibrin plate assay로 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 질소원의 종류에 따른 선발균의 혈전용해 효소활성을 측정하였다(Fig. 5). 혈전용해 활성은 yeast extract를 사용하였을 때 가장 높게 나타났다.
- 질소원의 종류에 따른 효소활성을 측정하기 위해, LB배지에 질소원으로 첨가된 1%의 tryptone과 동일농도의 peptone, yeast extract, malt extract, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, casein으로 대체하고 배양액의 pH를 6.8로 조정하였다. 그리고 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 30oC에서 24시간 진탕 배양한 후, 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 탄소원의 종류에 따른 선발균의 혈전용해 효소활성을 측정하였다(Fig. 4). 사용한 탄소원에 대한 혈전용해 활성을 조사한 결과, glucose를 사용하였을 때 가장 높았다.
- 탄소원의 종류에 따른 효소활성을 측정하기 위해, LB배지에 각 탄소원(glucose, maltose, lactose, galactose, sucrose)을 2% 농도로 첨가하고 배양액의 초기 pH를 6.8로 조정하였다. 그리고 전배양된 YJ11-21 배양액을 각각 5% 접종하여 30oC에서 24시간 진탕 배양한 후, 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 배양된 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차 선별한 다음, 단백질 분해능과 혈전분해능을 갖는 균주를 분리하기 위해 2차 선별을 수행하였다. R2A broth에 1% skim milk와 1.2% plant agar 첨가하여 만든 skim milk plate와 fibrin plate에 분리균을 접종한 후, clear zone을 생성하는 균주를 선발하였으며 대조구로는 Bacillus subtilis KACC 10114(농촌진흥청 한국농업미생물보존센터)를 사용하였다. 선발된 균주를 LB배지(bacto tryptone 1%, yeast extract 0.
- 전통 장류인 된장이나 간장은 발효과정에서 미생물이 생산하는 다양한 효소에 의해 콩에 함유된 단백질, 다당류, 이소플라본, 지질 등이 소화되기 쉬운 형태의 아미노산, 유리당, 이소플라본 아글리콘, 지방산 등으로 분해되며, 이 과정 중에 항산화 및 혈전용해 기능을 갖는 2차 대사산물이 생성된다[23, 24, 31]. 경기도 양주시에서 수집한 간장 시료에서 분리한 균을 skim milk plate와 fibrin plate에 접종하여clear zone을 형성하는 균주를 1차 분리하였다. 1차 분리된 균주 중에서 혈전용해 효소활성이 우수한 YJ11-21균주를 선발하였으며, 표준균주(B.
- 본 실험에 사용한 균원시료는 경기도 양주시 일대에서 시판 중인 재래식 간장을 수집하여 사용하였다. 분석에 사용한 시약은 Sigma aldrich(Sigma, ST.
- 본 실험에 사용한 균원시료는 경기도 양주시 일대에서 시판 중인 재래식 간장을 수집하여 사용하였다. 분석에 사용한 시약은 Sigma aldrich(Sigma, ST. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 8)에 30oC에서 24시간 배양한 후, 10,000 rpm, 4oC에서10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 그 상징액을 조효소액으로 하여 혈전용해 효소활성을 측정하였다. 각 실험의 효소활성은 3회 측정하여 평균값으로 표기하였다.
이론/모형
- 16S rDNA 유전자 염기서열 분석은 Universal PCR primer 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')로 합성하여 분리균의 16S rDNA 유전자 단편을 PCR로 증폭시켰다. PCR산물의 염기서열은 Solutions for Generic Technologies(Solgent) 사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. Phylogenetic tree 작성은 Lasergene사의 DNASTAR pro software(SeqMan Pro)와 The National Center for Biotechnology Information(NCBI, http://www.
- PCR산물의 염기서열은 Solutions for Generic Technologies(Solgent) 사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. Phylogenetic tree 작성은 Lasergene사의 DNASTAR pro software(SeqMan Pro)와 The National Center for Biotechnology Information(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced blast search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고된 유사균주와의 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, MEGA v4.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model과 neighbor-joining method[25]에 의해 계통도를 작성하였다.
성능/효과
- 경기도 양주시에서 수집한 간장 시료에서 분리한 균을 skim milk plate와 fibrin plate에 접종하여clear zone을 형성하는 균주를 1차 분리하였다. 1차 분리된 균주 중에서 혈전용해 효소활성이 우수한 YJ11-21균주를 선발하였으며, 표준균주(B. subtilis KACC 10114)와 비교한 결과 단백질 분해능은 표준균주와 유사하였으나(Fig. 1) 표준균주는 혈전용해 활성을 나타나지 않은 반면에 분리균 YJ11-21은 높은 혈전용해활성을 나타냈다.
- 로 나타났다. YJ11-21 균주의 계통학적 유연관계는 16S rDNA 유전자의 염기서열을 기초로 Bacillus 속(genus)의 표준 종들과의 similarity를 조사한 결과, Fig. 2와 같이 B. licheniformis와 높은 유사성(98%)를 나타냈다. 그리고 이 균주를 B.
- 6). 그 결과, 1% NaCl을 첨가한 배지에서 가장 높은 혈전용해 효소활성이 나타났으며 3% NaCl 첨가 배지에서 분리 균주의 생장률이 가장 높았다. 그리고 10% NaCl 농도에서도 높은 혈전용해 효소활성이 나타내고 있어 본 균주는 내염성균으로 추정된다.
- 7). 그 결과, 배양배지의 pH 5~10까지 안정한 효소활성을 보였다. 그리고 pH 9에서 가장 높은 혈전용해 효소활성과 균주의 생장률이 나타났다.
- 그 결과, 배양배지의 pH 5~10까지 안정한 효소활성을 보였다. 그리고 pH 9에서 가장 높은 혈전용해 효소활성과 균주의 생장률이 나타났다. 이상의 결과에서 보는 바와 같이 YJ11-21균주는 알칼리성 조건에서 최고의 생장률과 높은 효소활성을 나타내지만 분비하는 효소가 알칼리성인지 알기 위해서는 효소의 pH 안정성 실험이 추가로 필요할 것으로 생각된다.
- 균주의 생육은 배양 초기부터 서서히 증가하기 시작하여 배양 60시간에 최대성장을 나타내었다. 배양초기에 높은 혈전용해 효소활성이 나타났고 배양 8시간에 최대활성이 나타났으며 균주의 성장과 관계없이 유도기부터 정지기까지 배양기간 동안 일정한 효소활성이 유지되었다. 이는 혈전용해 효소가 세포 밖으로 분비되는 효소이기 때문에 균주의 성장이 끝나고 정지기에 들어서도 일정한 농도로 유지가 되는 것으로 추정된다.
- 4). 사용한 탄소원에 대한 혈전용해 활성을 조사한 결과, glucose를 사용하였을 때 가장 높았다. Ok[21] 등이 된장에서 분리한 Bacillus sp.
후속연구
- 그리고 pH 9에서 가장 높은 혈전용해 효소활성과 균주의 생장률이 나타났다. 이상의 결과에서 보는 바와 같이 YJ11-21균주는 알칼리성 조건에서 최고의 생장률과 높은 효소활성을 나타내지만 분비하는 효소가 알칼리성인지 알기 위해서는 효소의 pH 안정성 실험이 추가로 필요할 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.