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문제 정의
- 한편 은행 종실과 은행 외종피를 이용한 항균활성 비교 연구가 없으며, 특히 은행 외종피는 비식용부위로 고약한 냄새와 알레지 증상을 야기하기 때문에 대부분 폐기를 한다. 따라서 본 연구에서는 폐기되는 은행 외종피의 항균활성을 검색하여 항균제, 천연 보존료로써의 이용가치를 알아보고자, 식중독세균에 대하여 은행잎, 종실 및 외종피의 용매별 추출물에 대한 항균효과를 조사하였다.
가설 설정
- 1)ND: not detected.
- 2)ND: not detected.
제안 방법
- 5 McFarland 표준 탁도(Cells×106/mL)가 되게 희석하여 균일하게 도말한 후, 직경 8 mm의 멸균된 paper disc(Advantec, Tokyo, Japan)에 농도별 추출물을 50 μL씩 흡수시킨 후 추출용매를 완전히 제거하여 평판배지 위에 올려놓았다. 37℃ 항온기에서 24시간 배양한 후 형성된 paper disc 주변의 투명환(clear zone)의 직경(mm)을 Caliper(Mitutoty, Tokyo, Japan)로 측정하여 항균력을 검토하였으며, 첨가된 용매자체의 항균력을 배제하기 위하여 추출 용매만 paper disc에 첨가하여 대조구를 만들어 비교하였다.
- 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액의 O.D. 값을 600 nm에서 Quartz cell(10 mm×10 mm×45 mm, Whatman, Clifton, NJ, USA)을 사용하여 UV spectrophotometer(Genesys 6, Thermo electron Co., Boston, MA, USA)로 균의 생육억제효과를 측정하였으며, blank 실험은 각 세균 배양용 액체배지에 시료만 첨가여 균 증식이 나타나지 않은 농도를 MIC로 결정하였다.
- 대수기까지 증식된 미생물 배양액을 원심분리(5,000×g, 30 min)하여 상징액을 제거하여 균체를 회수한 후, 다시 균체에 0.85% 멸균생리식염수 소량을 넣고 현탁하여 원심분리 후 균체를 회수하는 과정을 3～4회 반복하였다.
- 미리 조제된 Mueller Hinton Agar(MHA) 평판배지에 활성화된 각 세균 배양액을 0.5 McFarland 표준 탁도(Cells×106/mL)가 되게 희석하여 균일하게 도말한 후, 직경 8 mm의 멸균된 paper disc(Advantec, Tokyo, Japan)에 농도별 추출물을 50 μL씩 흡수시킨 후 추출용매를 완전히 제거하여 평판배지 위에 올려놓았다.
- 은행잎과 은행 외종피 추출물에 의한 미생물의 형태변화를 관찰하기 위해서 각각의 균주를 2,000 μg/mL의 농도로 은행잎과 은행 외종피 methanol 추출물의 chloroform 용매 분획물을 처리한 것과 무처리한 대조구를 대수기까지 배양하여 전자현미경으로 관찰한 결과는 Fig. 1, 2와 같다.
- 은행잎과 은행외종피의 methanol 추출물에서 항균활성이 양호한 결과를 보였기에 이들의 추출물을 n-hexane chloroform, ethyl acetate 및 butanol을 사용하여 순차적으로 계통 분획·추출하여 추출물과 물 층을 얻고, 이들을 감압농축한 후 동결건조 하여 분획 추출물을 얻었다.
- 은행잎과 은행외종피의 methanol 추출물에서 항균활성이 양호한 결과를 보였기에 이들의 추출물을 n-hexane chloroform, ethyl acetate 및 butanol을 사용하여 순차적으로 계통 분획·추출하여 추출물과 물 층을 얻고, 이들을 감압농축한 후 동결건조 하여 분획 추출물을 얻었다. 이때 분획추출물의 수율은 시료 추출물의 고형분 함량계산과 같은 방법으로, 분획 추출물 1 mL을 취하여 105oC에서 건조한 후 증발 잔사량으로 계산하여 추출수율을 조사하였다.
- 천연 항균 소재를 탐색하기 위한 목적으로 은행잎, 은행 종실 그리고 은행 외종피를 methanol, ethanol, water 추출물을 얻은 후 8종의 세균에 대하여 항균효과를 검색하였다. 은행잎, 은행 외종피의 methanol 추출물과 ethanol 추출물에서는 항균활성이 검색된 반면, 은행잎과 은행 외종피의 물추출물, 은행 종실의 모든 추출물에서는 항균활성이 검색되지 않았다.
- 회수된 균체에 0.05 M phosphate buffer를 첨가하여 희석하고 0.45μm membrane filter로 균체를 여과, 고정하고 5% glutaldehyde 용액에 균체를 고정한 membrane filter를 12시간 침지한 후 멸균수로 1분간 세척하고, 30%, 60%, 90% ethanol에 약 10초간 차례로 침지하여 탈수한 다음, 다시 isoamyl acetate에 약 30분간 담구어 건조시킨 membrane filter를 stub에 고정한 뒤 ion spotter(E-1010, Hitachi, Tokyo, Japan)에서 60초간(Au＋Pd) 코팅한 것을 주사전자현미경(SEM, S-3500N, Hitachi) 관찰시료로 하였으며, 관찰에 사용된 주사전자현미경의 분석조건은 vaccum 15KV, magnification ×10,000 그리고 Au＋Pd, 60 sec, 10 μm로 coating(ion spotter, E-1010, Hitachi) 하여 검경하였다(13).
대상 데이터
- Methanol 추출물의 조제는 은행잎 분말, 은행 종실 분말, 조분쇄된 은행 외종피에 각각 99.0% methanol을 1:10(w/w)의 비율로 가하여 실온에서 5시간 교반하여 1차 추출액을 얻었으며, 잔사는 3회 반복하여 추출액을 얻었다. 추출액은 감압여과(직경 0.
- 실험에 사용된 은행나무 잎(Ginkgo biloba L. leaves, GBL), 은행(Ginkgo biloba seed, GBS), 은행 외종피(Ginkgo biloba outer seedcoat, GBO)는 2008년 10월에 한경대학교 부설농장에서 채취하였다. 은행잎은 열풍건조 후 분쇄기(M20, IKA, Staufen, Germany)로 분쇄하여 50 mesh로 분말화한 것을 사용하였고, 은행 외종피는 동결건조 후 분쇄기로 조분쇄한 것을 사용하였으며, 은행 종실은 동결건조 후 분쇄기로 분쇄하여 50 mesh로 분말화 한 것을 사용하였다.
- 항균 활성 검색에 사용된 균은 Bacillus cereus KCCM 40935(MHA, 37℃), Bacillus subtilis KCCM 11315(MHA, 37℃), Listeria monocytogenes KCCM 40307(BHI, 37℃), Staphylococcus aureus ATCC 6538(TSA, 37℃) 등 Gram positive bacteria 4종과 Escherichia coli KCCM 11234(TSA, 37oC), Klebsiella pneumoniae KCCM 40890(MHA, 37℃), Salmonella Typhimurium KCCM 11862(MHA, 37℃), Yersinia enterocolitica KCCM 41657(MHA, 37℃) 등 Gram negative bacteria 4종을 선택하여 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받아 활성화시켜 사용하였다.
데이터처리
- 1)Any means in the column followed by the different superscripts are significantly different (n=3, p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 실험결과는 SAS package(release 8.01)를 이용하여 평균±표준편차로 표시하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p< 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 검정하였다(14).
이론/모형
- 최소저해농도는 액체배지희석법(12)으로 측정하였다. 9.
- 항균활성 검색은 한천배지확산법(11)으로 측정하였다. 미리 조제된 Mueller Hinton Agar(MHA) 평판배지에 활성화된 각 세균 배양액을 0.
성능/효과
- Ethyl acetate 분획물은 E. coli를 제외한 모든 균주에서 1000 μg/mL 이하에서 항균력을 나타내지 않았고, chloroform 분획물이 B. cereus에 대하여 62.5 μg/mL의 농도로 가장 낮은 MIC를 보였다.
- 은행잎의 경우 물 추출 수율이 31%로 가장 좋았으며, 은행 외종피의 경우 methanol 추출 수율이 67%로 가장 높았고, 은행 종실의 경우 17%로 물 추출 수율이 가장 높았다. 각 용매별 추출 수율을 보면 은행 외종피의 용매별 추출 수율이 가장 높았는데 methanol 추출물 67%, ethanol 추출물 17%, 물 추출물 58%의 수율을 보였다.
- 또한 은행잎과 은행 외종피의 methanol 추출물 용매분획물의 최소저해농도(MIC)를 측정한 결과, 각각의 chloroform 분획에서 가장 낮은 MIC 값을 보였으며, 특히 은행 외종피의 chloroform 분획물은 B. cereus에 대해 62.5 μg/mL로 본 실험 내에서 가장 낮은 MIC를 보였다.
- 은행잎, 은행 외종피의 methanol 추출물 모두 hexane, chloroform, ethyl acetate 분획추출물에서 강한 항균활성을 보였으나 butanol과 water 분획추출물에서는 항균활성이 검색되지 않았다. 용매별 시료 추출물의 항균검색 결과와 마찬가지로 E. coli에 대한 항균력은 검색되지 않았으며, 나머지 7종 균주에 대한 항균력 검색 결과, 은행 외종피 methanol 추출물의 chloroform 분획물에서 가장 우수한 항균력을 보였다. 은행잎과 은행 외종피 methanol 추출물의 용매분획물 모두 chloroform 분획추출물에서 높은 항균효과를 보였다.
- 은행 외종피 methanol 추출물의 용매분획물 MIC 측정 결과 hexane 분획물은 MIC가 검색되지 않은 E. coli를 제외한 다른 균에 대하여 500 μg/mL 이하의 농도에서는 항균력을 보이지 않았다.
- cereus에서 강한 항균효과를 보였다. 은행 외종피의 경우 methanol 추출물은 B. cereus, S. aureus, B. subtilis, L. monocytogenes 균에, ethanol 추출물은 B. cereus, S. aureus, B. subtilis, K. pneumoniae 균에서 강한 항균활성을 보였다. E.
- 은행잎과 은행 외종피의 methanol 추출물로부터 극성별 용매 분획하여 얻은 각각의 분획추출물(500 μg/mL)로 항균 활성을 검색한 결과는 Table 4와 같다. 은행잎, 은행 외종피의 methanol 추출물 모두 hexane, chloroform, ethyl acetate 분획추출물에서 강한 항균활성을 보였으나 butanol과 water 분획추출물에서는 항균활성이 검색되지 않았다. 용매별 시료 추출물의 항균검색 결과와 마찬가지로 E.
- 조제한 용매별 시료 추출물을 0.5 mg/disc의 동일 농도 조건으로 항균활성을 검색한 결과 은행잎, 은행 외종피의 methanol 추출물과 ethanol 추출물에서는 항균활성이 검색된 반면, 은행잎과 은행 외종피의 물 추출물, 은행 종실의 모든 추출물에서는 항균활성이 검색되지 않았다. 은행잎의 경우 모든 균에 있어 methanol 추출물이 ethanol 추출물보다 강한 항균활성을 나타났으며, methanol 추출물은 K.
- 5 μg/mL로 본 실험 내에서 가장 낮은 MIC를 보였다. 은행잎과 은행 외종피 methanol 추출물의 chloroform 분획물(2,000 μg/mL)을 각 균주의 생육배지에 첨가하여 배양한 결과 세포가 팽윤되거나 일부 세포벽이 완전히 파괴된 형태를 관찰할 수 있었다.
- coli에 대한 항균력은 검색되지 않았으며, 나머지 7종 균주에 대한 항균력 검색 결과, 은행 외종피 methanol 추출물의 chloroform 분획물에서 가장 우수한 항균력을 보였다. 은행잎과 은행 외종피 methanol 추출물의 용매분획물 모두 chloroform 분획추출물에서 높은 항균효과를 보였다. Sung(8)은 은행잎 methanol 추출물의 butanol 용매분획추출물에서 4종의 식중독세균(E.
- 항균활성이 우수하였던 은행잎과 은행잎 외종피 methanol 추출물을 용매별로 분획추출 한 결과는 Table 3과 같다. 은행잎의 chloroform과 ethyl acetate의 수율은 각각 6.12%, 3.45%로 나타났으며, 은행 외종피 methanol 추출물의 chloroform과 ethyl acetate의 분획물 추출수율은 1.75%, 2.45%로 10% 미만의 수율을 나타낸 반면, 은행잎 methanol 추출물의 n-hexane과 water 분획추출물의 수율은 각각 30.59%, 40.30%로 30% 이상의 수율을 보였으며, 은행 외종피의 경우 methanol 추출물의 hexane 분획추출물의 수율은 약 30%, water 분획추출물의 수율은 약 60%로 가장 높은 수율을 나타냈다.
- 은행잎과 은행 외종피의 methanol 추출물의 용매분획물의 MIC를 측정한 결과는 Table 5와 같다. 은행잎의 methanol 추출물의 용매분획물의 경우 가장 우수한 항균효과를 보였던 chloroform 층에서 가장 낮은 MIC 값을 보였으며, butanol과 water 분획추출물은 한천배지확산법 측정 결과와 마찬가지로 항균력을 보이지 않았다. 특히 B.
- 은행잎, 은행 종실 및 은행 외종피를 methanol, ethanol, 물을 용매로 하여 각각 추출한 수율은 Table 1과 같다. 은행잎의 methanol, ethanol, 물 추출 수율은 각각 약 23%, 15%, 31%이었고, 은행 외종피의 methanol, ethanol, 물 추출 수율은 약 67%, 17%, 58%로 나타났고, 은행 종실의 methanol ethanol, 물 추출 수율은 각각 약 7%, 4%, 17%로 나타났다. 은행잎 methanol 추출 수율 결과는 탈지하지 않은 은행잎 methanol 추출 수율이 24.
- 5 mg/disc의 동일 농도 조건으로 항균활성을 검색한 결과 은행잎, 은행 외종피의 methanol 추출물과 ethanol 추출물에서는 항균활성이 검색된 반면, 은행잎과 은행 외종피의 물 추출물, 은행 종실의 모든 추출물에서는 항균활성이 검색되지 않았다. 은행잎의 경우 모든 균에 있어 methanol 추출물이 ethanol 추출물보다 강한 항균활성을 나타났으며, methanol 추출물은 K. pneumoniae와 B. cereus에서 강한 항균효과를 보였다. 은행 외종피의 경우 methanol 추출물은 B.
- 은행잎, 은행 외종피의 methanol 추출물과 ethanol 추출물에서는 항균활성이 검색된 반면, 은행잎과 은행 외종피의 물추출물, 은행 종실의 모든 추출물에서는 항균활성이 검색되지 않았다. 은행잎의 경우 모든 균에 있어 methanol 추출물이 ethanol 추출물보다 강한 항균활성을 나타냈으며, methanol 추출물은 K. pneumoniae와 B. cereus에서 강한 항균효과를 보였다. 은행 외종피의 경우 methanol 추출물은 B.
- 35%라고 보고한 Sung(8)의 연구결과와 유사하였다. 은행잎의 경우 물 추출 수율이 31%로 가장 좋았으며, 은행 외종피의 경우 methanol 추출 수율이 67%로 가장 높았고, 은행 종실의 경우 17%로 물 추출 수율이 가장 높았다. 각 용매별 추출 수율을 보면 은행 외종피의 용매별 추출 수율이 가장 높았는데 methanol 추출물 67%, ethanol 추출물 17%, 물 추출물 58%의 수율을 보였다.
- 용매별 시료 추출물의 한천배지 확산법에 의한 항균활성 은행잎, 은행 종실, 은행 외종피에 대한 용매별 추출물의 항균활성 검색 결과는 Table 2와 같다. 조제한 용매별 시료 추출물을 0.5 mg/disc의 동일 농도 조건으로 항균활성을 검색한 결과 은행잎, 은행 외종피의 methanol 추출물과 ethanol 추출물에서는 항균활성이 검색된 반면, 은행잎과 은행 외종피의 물 추출물, 은행 종실의 모든 추출물에서는 항균활성이 검색되지 않았다. 은행잎의 경우 모든 균에 있어 methanol 추출물이 ethanol 추출물보다 강한 항균활성을 나타났으며, methanol 추출물은 K.
- pneumoniae 균에서 강한 항균활성을 보였다. 항균성이 우수했던 은행잎과 은행 외종피의 methanol 추출물을 용매별로 순차 분획하여 항균효과를 검색한 결과 각각의 균주에 대해 hexane, chloroform, ethyl acetate 분획추출물에서 항균효과가 검색되었으며, 특히 은행 외종피의 chloroform 분획추출물에서 우수한 항균효과를 보였다. 또한 은행잎과 은행 외종피의 methanol 추출물 용매분획물의 최소저해농도(MIC)를 측정한 결과, 각각의 chloroform 분획에서 가장 낮은 MIC 값을 보였으며, 특히 은행 외종피의 chloroform 분획물은 B.
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