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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 오염된 토양을 생물학적 복원기술로 처리하기 위한 기초연구로 PAHs로 오염된 폐광산 지역 토양에서 분리한 박테리아를 이용해 Fluorene에 대한 분해능을 평가하고, 분해과정 중에 나타나는 분해산물 분석을 통해 분해 경로를 도출하였으며, 인위적으로 오염시킨 토양의 Microcosm test를 통해 오염토양 복원에 대한 가능성 및 효율을 관찰하고자 했다.
제안 방법
- (Sodium sulfate)를 첨가한 후에 Dionex 사 기기를 이용하여 ASE(Accelerated Solvent Extraction, Dionex, USA)를 수행하였다. ASE 추출 조건은 Methylene chloride와 Acetone을 1:1로 혼합한 유기용매를 사용하고, 온도는 100℃, 압력은 1,500 psi, Static time은 10분, Flush volume은 60%, Purge time은 60초, Static cycle은 3회 수행하였다. 추출 후에는 추출액을 농축하고 n-hexane으로 용매 치환을 한 다음 Silica gel column을 통해 정제를 하고 유기용매 농축 후에 GC/MS를 통해 정성 및 정량 분석을 실시하였다.
- Fluorene 분해 박테리아 분리를 위해 폐광산 지역에서 PAHs로 오염된 토양을 채취하고, 오염토양 1g을 10 mL MSM(제한배지, Minimal Salts Medium)에 넣고 24시간 동안 항온교반(28℃, 160 rpm)시킨 후, 100 µL를 취하여 10 mg/mL의 Fluorene 을 탄소원으로 첨가한 MSM에 48시간 동안 교반시켜 배양시킨 후(28℃, 160 rpm), 고체의 한천배지에 스프레딩(Spreading) 하여 단일 콜로니가 얻어질 때까지 5회 이상 상기와 같은 조건으로 계대 배양을 실시하였다.
- Fluorene 분해 실험에서 배지 내 감소하는 Fluorene의 농도 변화는 24시간마다 배양기로부터 꺼내어 냉동고에 보관한 12개의 삼각플라스크를 녹이고, 10 mL의 Ethyl acetate로 8회 추출을 하고 그 농축액을 GC/MS로 분석하였다. 위와 같이 추출 및 농축한 시료를 통해 Fluorene의 농도 및 분해산물 분석을 수행하였다.
- Fluorene을 분해할 수 있는 박테리아를 분리하기 위해 PAHs로 오염된 폐광산 지역으로부터 토양을 채취하여 Enrichment culture 및 계대 배양을 통해 단일 콜로니로 분리하여 순수 배양하였다. 분리된 여러 균주 중 Fluorene에 대해 가장 분해 활성이 좋은 균주를 이용해 실험했는데, 그 균주는 진한 노란색을 나타냈고, 점성이 높은 특징을 나타내었다.
- 추출 후에는 추출액을 농축하고 n-hexane으로 용매 치환을 한 다음 Silica gel column을 통해 정제를 하고 유기용매 농축 후에 GC/MS를 통해 정성 및 정량 분석을 실시하였다. GC/MS 분석 조건은 Table 2에 명시하였으며, 해당 물질의 정성 및 정량 분석은 16종의 PAHs 표준물질(Accustandard, New Haven, USA)을 이용하여 비교 분석하였다.
- 채취한 폐광산지역 토양 1 kg을 수조에 넣고 해당 토양에 Fluorene을 100 mg/kg의 농도로 오염시킨 후, Sphingobacterium sp. KM-02 균주를 2 L 삼각플라스크에 10 mg/ml 농도의 Fluorene을 포함하는 200 mL의 배양액을 전 배양을 통해 얻고, 원심분리(12,000 rpm, 15분, 4℃)를 통해 확보된 균주를 20 mM Phosphate buffer로 2회 Pellet washing(12,000 rpm, 15분, 4℃)후, 파장 600 nm의 흡광도 2.0의 농도로 토양에 분산 접종하여 섞어주고 28℃ 항온 배양기에서 composting 실험을 수행하였다. 시간에 따른 토양 내 Fluorene농도의 변화를 관찰하기 위해 균주 접종 당일(0일차)부터 매 5일마다 2 g씩의 Microcosm 토양을 채취해 추출 및 분석을 수행하였다.
- Fluorene을 분해하는 Sphingobacterium sp. KM-02 균주의 토양 내 활성을 관찰하기 위해 Microcosm test를 수행하였다. 채취한 폐광산지역 토양 1 kg을 수조에 넣고 해당 토양에 Fluorene을 100 mg/kg의 농도로 오염시킨 후, Sphingobacterium sp.
- 10 mg/mL의 농도의 Fluorene이 첨가된 MSM에서 Sphingobacterium sp. KM-02를 순수배양 하는 과정 중 Fluorene이 분해되면서 생성된 중간 분해산물 분석을 통해 Fluorene 분해 경로를 확립하였다. GC/MS 분석을 통해 검출한 분해산물의 Mass Spectra는 Fig.
- KM-02에 의한 실제 오염 토양 내에서의 복원 가능성을 제시하기 위해 Fluorene을 100 mg/kg의 농도로 토양을 오염시키고 Sphingobacterium sp. KM-02를 접종하여 Microcosm test를 진행하였다. 실험 결과, 20일 내에 Sphingobacterium sp.
- KM-02 균주가 Fluorene을 탄소 및 에너지원으로 이용하여 성장 가능한지의 여부를 확인하기 위해 10 mg/mL의 농도의 Fluorene이 첨가된 MSM에서 순수 배양하면서 시간에 따른 Sphingobacterium sp. KM-02의 성장률과 Fluorene의 분해능을 측정하였다. Fig.
- 위와 같이 추출 및 농축한 시료를 통해 Fluorene의 농도 및 분해산물 분석을 수행하였다. Microcosm test에서 시간에 따라 토양 내에서 감소하는 Fluorene의 농도는 시료채취 날짜 별로 2 g의 토양을 채취하여 동량의 Na2SO4(Sodium sulfate)를 첨가하고, ASE로 추출한 후에 유기용매 농축하여 GC/MS(HP6890 MSD, Newark, USA)를 통해 정량분석을 실시하였다. Fluorene 농도 및 분해산물 분석을 위한 GC/MS 조건은 Table 2와 같다.
- 3c) 등의 분해 산물이 검출되었다. 검출된 분해산물의 Mass spectra는 해당 표준물질의 Mass spectra와 비교하여 구조를 검증하였다. 이와 같이 검출된 분해 산물들을 기반으로 Fig.
- , 2006)하여 다른 6개의 삼각플라스크에 접종을 하고 동시 배양하였다. 매 24시간마다 배양기로부터 Control(Dead cell) 1개와 Live cell 1개를 꺼내어 냉동고에 보관하고, 실험 종료 후에 동시 분석하였다. 모든 실험은 각각 3회씩 독립적으로 수행하였고, 감소하는 Fluorene양과 분해산물은 GC/MS분석을 통해 정성 및 정량 분석을 수행하였다.
- 1에 맞추어 실시하였다. 모두 12개의 삼각플라스크를 준비하여 분해실험을 위한 6개와 10 mM의 NaN3(sodium azide)를 넣고 70℃에서 열을 가해 Dead cell을 제조(Nam et al., 2006)하여 다른 6개의 삼각플라스크에 접종을 하고 동시 배양하였다. 매 24시간마다 배양기로부터 Control(Dead cell) 1개와 Live cell 1개를 꺼내어 냉동고에 보관하고, 실험 종료 후에 동시 분석하였다.
- 매 24시간마다 배양기로부터 Control(Dead cell) 1개와 Live cell 1개를 꺼내어 냉동고에 보관하고, 실험 종료 후에 동시 분석하였다. 모든 실험은 각각 3회씩 독립적으로 수행하였고, 감소하는 Fluorene양과 분해산물은 GC/MS분석을 통해 정성 및 정량 분석을 수행하였다.
- 6% 감소함을 관찰할 수 있었다(Table 3). 본 Microcosm test에서는 1 kg의 토양을 Fluorene과 혼합하여 Composting을 진행한 결과로 5일 간의 간격을 두고 시료채취를 하였다. Sphingobacterium sp.
- , 2008). 분리된 균의 동정은 16S rDNA 염기서열 분석 및 NCBI의 GenBank와 EMBL등의 Database와 비교를 통해 균주를 동정하였다.
- 본 배양은 전 배양과 같은 조건으로 새로운 멸균 배지에 접종하여 배양했으며, 전 배양에서 얻은 배양액을 원심분리(12,000 rpm, 15분, 4℃)하고 20 mM Phosphate buffer로 pellet washing을 2회 실시한 후, 전 배양과 동일 조건으로 항온 교반 배양했다. 시간에 따른 균주의 성장은 UV-visible spectrophotometer(Biochrom, Cambridge, UK)로 600 nm의 파장에서 측정하였고, 실험 초기의 균주 농도는 흡광도 기준으로 0.1에 맞추어 실시하였다. 모두 12개의 삼각플라스크를 준비하여 분해실험을 위한 6개와 10 mM의 NaN3(sodium azide)를 넣고 70℃에서 열을 가해 Dead cell을 제조(Nam et al.
- 0의 농도로 토양에 분산 접종하여 섞어주고 28℃ 항온 배양기에서 composting 실험을 수행하였다. 시간에 따른 토양 내 Fluorene농도의 변화를 관찰하기 위해 균주 접종 당일(0일차)부터 매 5일마다 2 g씩의 Microcosm 토양을 채취해 추출 및 분석을 수행하였다.
- Fluorene 분해 실험에서 배지 내 감소하는 Fluorene의 농도 변화는 24시간마다 배양기로부터 꺼내어 냉동고에 보관한 12개의 삼각플라스크를 녹이고, 10 mL의 Ethyl acetate로 8회 추출을 하고 그 농축액을 GC/MS로 분석하였다. 위와 같이 추출 및 농축한 시료를 통해 Fluorene의 농도 및 분해산물 분석을 수행하였다. Microcosm test에서 시간에 따라 토양 내에서 감소하는 Fluorene의 농도는 시료채취 날짜 별로 2 g의 토양을 채취하여 동량의 Na2SO4(Sodium sulfate)를 첨가하고, ASE로 추출한 후에 유기용매 농축하여 GC/MS(HP6890 MSD, Newark, USA)를 통해 정량분석을 실시하였다.
- ASE 추출 조건은 Methylene chloride와 Acetone을 1:1로 혼합한 유기용매를 사용하고, 온도는 100℃, 압력은 1,500 psi, Static time은 10분, Flush volume은 60%, Purge time은 60초, Static cycle은 3회 수행하였다. 추출 후에는 추출액을 농축하고 n-hexane으로 용매 치환을 한 다음 Silica gel column을 통해 정제를 하고 유기용매 농축 후에 GC/MS를 통해 정성 및 정량 분석을 실시하였다. GC/MS 분석 조건은 Table 2에 명시하였으며, 해당 물질의 정성 및 정량 분석은 16종의 PAHs 표준물질(Accustandard, New Haven, USA)을 이용하여 비교 분석하였다.
- 폐광산 지역에서 채취한 토양 내 PAHs의 농도 수준을 확인하기 위해 오염 토양을 건조 및 균질화를 시킨 후 2 g을 취하고, 동량의 Na2SO4(Sodium sulfate)를 첨가한 후에 Dionex 사 기기를 이용하여 ASE(Accelerated Solvent Extraction, Dionex, USA)를 수행하였다. ASE 추출 조건은 Methylene chloride와 Acetone을 1:1로 혼합한 유기용매를 사용하고, 온도는 100℃, 압력은 1,500 psi, Static time은 10분, Flush volume은 60%, Purge time은 60초, Static cycle은 3회 수행하였다.
대상 데이터
- 1과 같다. 미국 EPA에서 지정한 우선규제대상 16종의 PAHs 물질을 분석하였는데, Benzo(a)pyrene, Benzo(g,h,l)perylene, Benzo(k)fluornathene, Chrysene, Dibenz(a,h)anthracene, Indeno(1,2,3-cd)pyrene 등 6종의 물질은 검출되지 않았고, Fig. 1에서 나타낸 바와 같이 10종의 물질이 검출되었다. 10종의 PAHs 총 농도는 129.
성능/효과
- 1에서 나타낸 바와 같이 10종의 물질이 검출되었다. 10종의 PAHs 총 농도는 129.0 ng/g이였으며, 농도가 가장 높은 물질은 Fluorene으로 평균 농도가 46.9 ng/g으로 분석되었다. 본 결과에서 Fluorene은 16종 PAHs 중 검출된 10종의 PAHs 총량의 36.
- KM-02를 접종한 Live cell 등으로 구분하여 처리하였다. Control 시험에서는 Fluorene이 휘발되어 감소하는 양을 고려하여 적용하였는데, Test 종료 시점인 20일 경과 후까지 오차 범위에서 분석됨을 확인하였다. Table 3 결과에서 보는 바와 같이, Dead cell을 처리한 시험에서도 처리 시간에 따라 20일 후에 약 25.
- , 2009), 이렇게 토양 입자에 흡착된 Fluorene을 Dead cell에 의해 분비된 유기물질들이 안정화를 시켜 분석 시 모두 탈착되지 않고 감소한 현상으로 나타난 것으로 여겨진다. Dead cell로 처리한 시험의 결과에서 5일 후에 14.9%, 10일 후에 19.7% 등의 감소율이 증가함을 나타내다가 15일 후에는 19.1%로 10일 후 감소율 19.7% 보다 낮은 값을 나타내고 있는 것이 본 균주가 가지고 있는 효소시스템을 포함한 특정 메커니즘이 아닌 제어되지 않는 토양 및 다양한 유기물 입자에의 흡착, 균주의 불균등한 분산 등의 이유로 생각될 수 있다. 그러나, Dead cell에서 보여준 처리 효율과 Live cell을 처리했을 때 나타나는 처리효율 간 20일 경과 후 기준으로 약 40.
- KM-02의 성장률과 Fluorene의 분해능을 측정하였다. Fig. 2에 나타낸 바와 같이 120시간 내에 약 78.4%의 Fluorene이 분해되었으며, 초기 균주의 농도가 600 nm 흡광도 기준으로 0.11에서 120시간 후에 1.02까지 값이 상승하며 균주가 성장하는 것을 관찰하였다. 그러나, 동시에 같은 조건에서 실험한 Sphingobacterium sp.
- KM-02를 순수배양 하는 과정 중 Fluorene이 분해되면서 생성된 중간 분해산물 분석을 통해 Fluorene 분해 경로를 확립하였다. GC/MS 분석을 통해 검출한 분해산물의 Mass Spectra는 Fig. 3과 같으며, 9-fluorenone(Fig. 3a), 4-hydroxy-9-fluorenone(Fig. 3b), 8-hydroxy-3,4-benzocoumarin(Fig. 3c) 등의 분해 산물이 검출되었다. 검출된 분해산물의 Mass spectra는 해당 표준물질의 Mass spectra와 비교하여 구조를 검증하였다.
- Fluorene 분해 활성을 가지는 분리 균주의 동정을 위해 16S rDNA gene을 PCR 로 증폭시켜 Direct sequencing을 실시하여 얻은 약 1,520 bp의 염기서열을 가지고 NCBI의 GenBank와 EMBL등의 Database를 통해 알려진 16S rDNA 염기서열들과 비교 분석한 결과, 해당 균주는 Sphingobacterium sp. GF2B와 가장 유사하여 99.1% 이상의 유사도를 갖는 것으로 확인되었다(GenBank Accession Number, FJ548749). 이상의 16S rDNA 염기서열분석의 결과를 바탕으로 본 균주를 Sphingobacterium sp.
- 실험 결과, 20일 내에 Sphingobacterium sp. KM-02 live cell을 접종한 처리를 기준으로 Fluorene이 65.6% 감소함을 관찰할 수 있었다(Table 3). 본 Microcosm test에서는 1 kg의 토양을 Fluorene과 혼합하여 Composting을 진행한 결과로 5일 간의 간격을 두고 시료채취를 하였다.
- 이는 본 분해 반응이 Sphingobacterium sp. KM-02로부터 생산되는 효소에 의한 반응임을 시사하고 있으며, 본 박테리아 균주는 Fluorene을 탄소원으로 이용해 분해하면서 성장할 수 있음을 확인하였다. Sphingobacterium sp.
- KM-02에 의한 Fluorene 분해 경로를 확립할 수 있었다. 또한, 100 mg/kg의 Fluorene으로 오염시킨 토양에서 Microcosm test를 20일 동안 진행한 결과, 약 65.6%의 Fluorene이 토양 내에서 제거됨을 관찰하였다. 따라서, Sphingobacterium sp.
- 9 ng/g으로 분석되었다. 본 결과에서 Fluorene은 16종 PAHs 중 검출된 10종의 PAHs 총량의 36.36%를 차지하고 있었다. 기존 문헌상에 보고되었던 오염토양 내 Fluorene 농도 수준은 3-180 µg/g으로(Achten and Hofmann, 2009; Mostert et al.
- Fluorene을 분해할 수 있는 박테리아를 분리하기 위해 PAHs로 오염된 폐광산 지역으로부터 토양을 채취하여 Enrichment culture 및 계대 배양을 통해 단일 콜로니로 분리하여 순수 배양하였다. 분리된 여러 균주 중 Fluorene에 대해 가장 분해 활성이 좋은 균주를 이용해 실험했는데, 그 균주는 진한 노란색을 나타냈고, 점성이 높은 특징을 나타내었다. Fluorene 분해 활성을 가지는 분리 균주의 동정을 위해 16S rDNA gene을 PCR 로 증폭시켜 Direct sequencing을 실시하여 얻은 약 1,520 bp의 염기서열을 가지고 NCBI의 GenBank와 EMBL등의 Database를 통해 알려진 16S rDNA 염기서열들과 비교 분석한 결과, 해당 균주는 Sphingobacterium sp.
후속연구
- 따라서, Sphingobacterium sp. KM-02는 Fluorene 등의 PAHs로 오염된 환경 매체의 생물학적 처리에 유용할 것으로 판단되며, 향후 다양한 환경 시료를 대상으로 하는 연구 결과들이 확보되면 PAHs 오염 환경의 생물 복원에 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
- 실제로 Live cell 처리 시험에서는 시간에 따라 꾸준히 증가하는 처리 효율을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들을 기반으로 처리 효율을 높이기 위해 기존 연구결과들에서 제시된 계면활성제를 이용하거나 반복접종 시행하는 등의 추가 처리를 통해 제거 효율을 높일 수 있을 것으로 판단한다(Nam et al., 2005; Kolomytseva et al., 2009). 상기와 같은 결과들을 바탕으로 실제 Fluorene으로 오염된 토양 및 기타 다양한 환경 매체들을 복원할 때, 본 연구에서 분리 및 이용된 Sphingobacterium sp.
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