The objective of the present study was to evaluate the skin whitening effect of the extracts, Lycii fructus (LF), Dry-L. foilum (DLF) and Fresh-L. folium (FLF). Tyrosinase inhibition activities was 44% in DLF ethanol extracts at a $500{\mu}g/mL$. When the tyrosinase activities in B16F10 m...
The objective of the present study was to evaluate the skin whitening effect of the extracts, Lycii fructus (LF), Dry-L. foilum (DLF) and Fresh-L. folium (FLF). Tyrosinase inhibition activities was 44% in DLF ethanol extracts at a $500{\mu}g/mL$. When the tyrosinase activities in B16F10 murine melanoma cell were tested, the activities in DLF ethanol extracts was 14% at a $50{\mu}g/mL$ concentration. The protein expression of microphthalmia-associated transcription factor, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), TRP-2, and tyrosinase, which are all melanin related factors, showed that LF, DLF and FLF extracts inhibited the protein bio-synthesis in B16F10 melanoma cell. Especially the DLF extract showed greater decrease of protein expressions. Results indicate that the DLF extract tested in the present study had skin whitening activity and can be used as a function a ingredients for food and cosmetic compositions.
The objective of the present study was to evaluate the skin whitening effect of the extracts, Lycii fructus (LF), Dry-L. foilum (DLF) and Fresh-L. folium (FLF). Tyrosinase inhibition activities was 44% in DLF ethanol extracts at a $500{\mu}g/mL$. When the tyrosinase activities in B16F10 murine melanoma cell were tested, the activities in DLF ethanol extracts was 14% at a $50{\mu}g/mL$ concentration. The protein expression of microphthalmia-associated transcription factor, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), TRP-2, and tyrosinase, which are all melanin related factors, showed that LF, DLF and FLF extracts inhibited the protein bio-synthesis in B16F10 melanoma cell. Especially the DLF extract showed greater decrease of protein expressions. Results indicate that the DLF extract tested in the present study had skin whitening activity and can be used as a function a ingredients for food and cosmetic compositions.
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문제 정의
구기엽에 함유되어 있는 rutin은 최초로 메밀에서 분리되었으며 rutin의 주요 효능은 혈압억제, 혈당과 혈청 콜레스테롤 저하로 성인병 예방에 좋다고 알려져 있고 그 외 성분으로 rutin과 유사한 flavonoid계 화합물들이 지질대사 조절 능과 항산화 활성이 강하다[Kim 등, 2008; Ahn과 Cho, 2011]. 따라서 본 연구에서는 피부흑화를 억제하여 미백효과를 얻을 수 있는 물질을 탐색하던 중 민간에서 한약재로 사용되어 지고 있는 구기자, 구기엽에서 미백효과를 가지는 물질이 있음을 확인하였고, 또한 제철 생구기엽의 활성이 건조된 구기엽에 비해 효능이 있는지 확인하고 화장품 마케팅 자료 및 기능성 화장품으로서의 산업화 가능성을 검토하기 위하여 두 가지를 추출하여 비교하였다.
제안 방법
10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 MITF (Santacruz, 1:1000), TRP-1 (Santacruz, 1:1000), TRP-2 (Santacruz, 1:1000), tyrosinase (Santacruz, 1:1000), β-actin (Santacruz 1:1000) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST 로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG horse radish peroxidase (HRP), bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다.
10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 MITF (Santacruz, 1:1000), TRP-1 (Santacruz, 1:1000), TRP-2 (Santacruz, 1:1000), tyrosinase (Santacruz, 1:1000), β-actin (Santacruz 1:1000) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST 로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG horse radish peroxidase (HRP), bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 암실에서 enhanced chemiluminescence (ECL) (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, England)용액으로 반응시키고, LAS 4000 chemiluminescence detection system (Fuji, Tokyo, Japan)을 이용하여 밴드를 확인하여 density를 측정하였다.
Melanoma (B16F10) 세포에 시료용액의 여러 농도(1, 10, 100, 1000 µg/mL) 또는 양성 대조군을 1시간 전처리한 후 LPS (1 µg/mL)를 처리하고 24시간 배양하였다.
Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해율 측정.
Tyrosinase 저해활성 측정.
구기자, 건조 구기엽, 생구기엽 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 추출물을 농도 별로 50 µg/mL 처리 한 후 24시간 뒤에 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase protein 발현을 western blotting으로 확인하였다.
미백 관련 mechanism인 MITF, TRP1, TRP2, tyrosinase활성을 보기 위하여 melanoma cell인 B16F10 cell suspension을 100 mm culture dish에 각 well당 2×104 cells/mL cell로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다.
배지를 제거한 후 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 추출물을 각각 50 µg/mL로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 또 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다.
본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. Melanoma (B16F10) 세포에 시료용액의 여러 농도(1, 10, 100, 1000 µg/mL) 또는 양성 대조군을 1시간 전처리한 후 LPS (1 µg/mL)를 처리하고 24시간 배양하였다.
folium, FLF)은 충남 구기자 농업시험장에서 구입하여 분쇄 후 사용하였다. 열수 추출물의 경우, 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 100 g에 10배 양의 증류수를 가하여 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였고, 시료의 에탄올 추출은 시료 중량의 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출 하였다. 각 추출물들은 원심분리 및 여과, 농축 후 동결 건조하여 냉동실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.
본 실험에서 사용한 구기자(L. fructus, LF), 건조구기엽(Dry-L. foilum, DLF), 생구기엽(Fresh-L. folium, FLF)은 충남 구기자 농업시험장에서 구입하여 분쇄 후 사용하였다. 열수 추출물의 경우, 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 100 g에 10배 양의 증류수를 가하여 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였고, 시료의 에탄올 추출은 시료 중량의 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출 하였다.
세포배양을 위해 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 hyclone 및 haema cytometer (Marienfeld, Germany)에서 구입하여 사용하였으며, microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), TRP-2, tyrosinase primary antibody 와 mouse-anti-goat, rabbit-anti-mouse 등 secondary antibody는 Santacruz (Santacruz, CA)에서 구입하였다.
이론/모형
Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등[1986]의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
세포 생존율 측정은 Carmichael 등[1987]의 방법에 따라 측정하였다. 세포주 melanoma (B16F10)를 96 well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.
피부 멜라노마 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등[1985]의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 100 mm culture dish에 1×106 cell/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.
성능/효과
Han 등[1999]이 보고한 전통 메주에서 분리한 단독균으로 제조한 메주 추출물의 혈액암세포에 대한 억제능을 보았을 때 21종의 추출물 중에서 가장 높은 저해능이 0.5 mg/mL의 농도에서 58.0%를 나타내는 것으로 보아, 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 추출물은 B16F10 cell에서 높은 생존율을 가지는 것을 확인 하였으며, 이하 모든 세포실험에서 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 추출물의 농도 설정은 50µg/mL로 진행 하였다.
생구기엽 에탄올 추출물의 경우 5%의 저해율을 나타내었으며, 대조군인 알부틴의 경우 50 µg/mL의 농도에서 10% 저해효과를 나타내었다. 결과적으로 건조구기엽 에탄올 추출물이 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해함으로 멜라닌 합성을 억제한 것으로 생각되어 진다.
생구기엽 에탄올 추출물의 경우 5%의 저해율을 나타내었으며, 대조군인 알부틴의 경우 50 µg/mL의 농도에서 10% 저해효과를 나타내었다. 결과적으로 건조구기엽 에탄올 추출물이 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해함으로 멜라닌 합성을 억제한 것으로 생각되어 진다.
Tyrosinase 저해활성 측정결과 건조구기엽 에탄올추출물 500 µg/mL에서 44%의 저해활성을 나타내었으며, melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해율 측정결과 건조구기엽 에탄올 추출물 50 µg/mL에서 14%의 저해효과를 나타내었다. 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 추출물을 처리한 B16F10군에서는 tyrosinase protein의 발현이 처리하지 않은 군보다 감소하였다. 특히, 건조구기엽 추출물의 경우 tyrosinase의 단백질 발현량을 많이 저해하였다.
구기자, 건조구기엽, 생구기엽 추출물의 melanoma 세포에서의 melanin 생합성 저해효과를 측정한 결과, 구기자 물 추출물의 경우 50 µg/mL에서 32.0%의 tyrosinase 활성 저해 효과를 나타내었으며, 건조구기엽 에탄올 추출물의 경우 50 µg/mL에서 40%의 tyrosinase 활성 저해 효과를 나타내었다.
구기자, 건조구기엽, 생구기엽의 경우 100 µg/mL 이하에서 약간의 세포독성은 나타났지만, 그 수치가 미비해 구기자, 건조구기엽, 생구기엽 추출물의 영향을 적게 받는 것으로 나타났다.
먼저 구기자의 tyrosinase 저해활성은 열수추출물 1,000 µg/mL에서 30.8%의 저해활성을 나타내었으며, 건조구기엽과 생구기엽의 에탄올추출물은 각각 46.2와 42.0%의 저해활성을 나타내 건조구기엽 에탄올추출물의 활성이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
또한 MITF의 억제는 tyrosinase의 발현 억제를 통하여 melanin 생성을 억제 할 수 있으며, MITF의 발현이 억제되면 색소 생성이 억제 될 수 있다. 본 실험에서도 건조구기엽 추출물이 대조군에 비하여 농도 별로 MITF 발현을 감소시킴을 확인할 수 있었다. 이상의 결과, 건조구기엽 추출물은 멜라닌 합성에 직접적으로 관여하는 효소인 tyrosinase 및 TRP-1, TRP-2의 발현을 억제하고 melanocyte 세포 수준에서의 활성을 억제하여 melanin 합성을 억제하는 것으로 나타났다.
본 실험에서도 건조구기엽 추출물이 대조군에 비하여 농도 별로 MITF 발현을 감소시킴을 확인할 수 있었다. 이상의 결과, 건조구기엽 추출물은 멜라닌 합성에 직접적으로 관여하는 효소인 tyrosinase 및 TRP-1, TRP-2의 발현을 억제하고 melanocyte 세포 수준에서의 활성을 억제하여 melanin 합성을 억제하는 것으로 나타났다.
7~10에서 보는 바와 같이 추출물을 처리 하지 않은 B16F10군에서는 각 전사인자의 단백질 발현이 증가하였지만, 구기자 추출물을 50 µg/mL을 처리한 B16F10군에서는 tyrosinase protein의 발현이 처리하지 않은 군보다 감소하였다. 특히, 건조구기엽 추출물의 경우 tyrosinase의 단백질 발현량이 80% 가까이 저해되었으며, TRP-1은 42%의 저해율을 나타내었고, TRP-2는 22% 저해율을 나타내었다. 또한 MITF의 경우 건조구기엽 물 추출물의 경우 27% 저해율을, 건조구기엽 에탄올 추출물의 경우 57%의 저해율을 나타내었다.
후속연구
특히, 건조구기엽 추출물의 경우 tyrosinase의 단백질 발현량을 많이 저해하였다. 결과적으로 건조구기엽 추출물의 미백활성이 가장 우수하였으며, 식품 및 화장품의 기능성 소재로 이용이 가능할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
구기자나무의 뿌리를 무엇이라 하는가?
구기자나무(Lycium chinense Miller)는 가지과(Solanaceae)에 속하는 낙엽덩굴성 관목으로 온대, 아열대 지역에 분포하고 있으며 우리나라를 비롯하여 중국 동북부, 대만, 일본 등지에서 재배 및 자생되고 있다. 그 뿌리를 지골피, 잎은 구기엽, 어린 순은 천정초, 열매를 구기자(Lycii fructus)라 한다. 동의보감에서 구기자는 자양, 강장, 보혈, 지갈, 보정기 등에 효능이 있는 것으로 기술되어 있으며, 본초강목에는 구기자를 복용하면 근골을 단단하게 하며 몸이 가벼워져 늙지 않고 더위와 추위를 타지 않으며 독성이 없고 염증, 갈증을 수반하는 당뇨병이나 신경이 마비되는 질병에 좋다고 기록되어 있다[Park 등, 2005;2006].
멜라닌은 어디서 어떻게 합성되는가?
자외선이나 환경오염 그 밖의 요인의 자극에 대해 피부세포는 방어 기전으로 포유동물의 표피 기저층에 존재하는 melanocyte의 melanosome에서 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 피부표피의 기저층에 위치한 멜라노사이트 내 소기관인 멜라노좀에서 tyrosine이 tyrosinase효소에 의해 합성된다. 잘 알려진 효소로는 tyrosinase외에도 tyrosinase related protein-1 (TRP-1)과 dopachrome tautomerase (DCT)등이 있다.
본초강목에서는 구기자에 어떤 효능이 있다고 기록했는가?
그 뿌리를 지골피, 잎은 구기엽, 어린 순은 천정초, 열매를 구기자(Lycii fructus)라 한다. 동의보감에서 구기자는 자양, 강장, 보혈, 지갈, 보정기 등에 효능이 있는 것으로 기술되어 있으며, 본초강목에는 구기자를 복용하면 근골을 단단하게 하며 몸이 가벼워져 늙지 않고 더위와 추위를 타지 않으며 독성이 없고 염증, 갈증을 수반하는 당뇨병이나 신경이 마비되는 질병에 좋다고 기록되어 있다[Park 등, 2005;2006]. 구기자에는 vetaine과 rutin과 같은 기능성 성분이 다량 함유되어 있고, 항암효과, 면역증진, 간 기능 개선효과, 혈중 콜레스테롤 저하 등의 효능이 있다고 알려져 있으며, 구기자의 성분으로 열매에는 carotenoid, cholin, meliscic acid, zeaxanthin, physalien (dipalmityl-zeaxanthin), betaine, β-sitosterol, vitamin B1과 불포화 지방산이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다[Park 등, 2002; Lee 등, 2008].
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