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문제 정의
- SCAR marker 개발은 특정 품종에만 나타나는 특이 band를 DNA marker로 개발하는 것으로 실험에 사용하지 않았던 다른 품종에서 동일한 band가 나타나는 경우도 발생할 수 있기 때문에 본 연구에서는 공시품종수를 느타리버섯류 (Pleurotus spp.) 81품종으로 하여 실험오차를 줄이고자 하였다. Table 3은 18품종에 대한 RAPD 분석에서 원형 느타리 특이 band를 보이는 Operon primer OPO-05 (5´- CCCAGTCACT-3´)로부터 제작된 SCAR primer로 느타리 81품종에 대해 PCR 분석한 결과이다.
- 본 연구에서는 RAPD에서 특이적인 다형성 band를 cloning 한 후 SCAR marker로의 전환기법을 이용하여 SCAR primer를 제작하여 느타리 품종을 구분할 수 있는 확실한 표지인자를 찾는 것이 필요할 것으로 생각되었다. 따라서 본 연구에서는 느타리 품종 가운데 상품화율이 높아 소비성이 좋으며 많이 재배되어 왔던 원형느타리 품종을 감별할 수 있는 특이 marker를 개발할 목적으로 10염기의 Operon primer set을 이용하여 RAPD를 수행하고, 특이 band를 찾아 SCAR 표지인자로 전환하는 실험을 수행하였다.
- 본 연구에서는 RAPD에서 특이적인 다형성 band를 cloning 한 후 SCAR marker로의 전환기법을 이용하여 SCAR primer를 제작하여 느타리 품종을 구분할 수 있는 확실한 표지인자를 찾는 것이 필요할 것으로 생각되었다. 따라서 본 연구에서는 느타리 품종 가운데 상품화율이 높아 소비성이 좋으며 많이 재배되어 왔던 원형느타리 품종을 감별할 수 있는 특이 marker를 개발할 목적으로 10염기의 Operon primer set을 이용하여 RAPD를 수행하고, 특이 band를 찾아 SCAR 표지인자로 전환하는 실험을 수행하였다.
제안 방법
- Annealing 단계는 55℃에서 1분간 실행하였으며, extension은 72℃에서 2분간 실시하고 총 35 cycle을 반응하였으며, final extension은 72℃에서 10분간 실시하였다. Annealing 온도와 cycle 수는 PCR band 상태에 따라 조건을 다르게 하여 수행하였다. marker의 명확성의 여부는 PCR product size에서 나타나는 특이 band의 유무로 결정할 수 있었다.
- Bioneer PCR Premix (Bioneer, Korea)에 genomic DNA 100 ng과 primer 10 pmole, 그리고 DDW를 첨가하여 전체 20 µl의 혼합액을 제조하였다.
- DNA는 TOYOBO사의 Mag Extractor (Plant DNA purification kit, Osaka, Japan)를 이용하여 TOYOBO사에서 제공하는 방법에 따라 실시하였으며, 최종적으로 부피는 100 µl가 되도록 용출액을 사용하여 bead에서 DNA를 추출하였다.
- Operon primer로 PCR을 수행한 후 전기영동하여 UV transilluminator에서 품종 특이 band 여부와 사이즈를 확인한 뒤 원형 품종만의 특이 DNA band를 Gel extraction kit (Takara, Japan)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, PCR 산물의 cloning 방법은 다음과 같다. Elution한 각 DNA를 pGEM- T easy vector system (Promega, USA)을 이용하여 ligation 하였다. 먼저 1 µl DNA와 1 µl pGEM- T easy vector, 1 µl T4 DNA ligase 그리고 5 µl T4 Rapid 2× buffer, 2 µl 3차 멸균수를 첨가하여 4℃에서 14시간 반응시켰다.
- Operon primer로 PCR을 수행한 후 전기영동하여 UV transilluminator에서 품종 특이 band 여부와 사이즈를 확인한 뒤 원형 품종만의 특이 DNA band를 Gel extraction kit (Takara, Japan)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, PCR 산물의 cloning 방법은 다음과 같다. Elution한 각 DNA를 pGEM- T easy vector system (Promega, USA)을 이용하여 ligation 하였다.
- PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Genet Bio PCR Premix kit (Genet Bio, Korea)를 이용하여, Premix kit에 genomic DNA 50 ng 2 µl, primer 100 ng 1 µl, DDW 7 µl를 첨가하였다. PCR 증폭반응은 ABI PCR SYSTEM 9700을 사용하였고, 첫 번째 단계인 predenaturation은 94℃에서 5분 1 cycle, 두 번째 단계에선 denaturation 94℃ 1분, annealing 35℃ 1분, extension 72℃ 2분으로 총 40 cycles 수행하고, 세 번째 단계인 post-extension은 72℃에서 10분간 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1× TAE (40 mM Tris; pH 8.
- PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Genet Bio PCR Premix kit (Genet Bio, Korea)를 이용하여, Premix kit에 genomic DNA 50 ng 2 µl, primer 100 ng 1 µl, DDW 7 µl를 첨가하였다.
- SCAR marker 개발을 위한 primer 제작은 Primer 3 (Whitehead Institute/MT center) program을 사용하여 GC 함량이 40~60%이고, annealing 온도가 약 55℃가 되도록 20~22 mer forward와 reverse primer를 design 하였으며, primer 합성은 (주) 바이오니아에 의뢰하였다. 특이 band를 기초로 하여 만들어진 각각의 primer가 SCAR marker로 이용이 가능한지 확인하기 위해 genomic DNA로부터 PCR을 수행하여 얻은 증폭산물의 SCAR marker로의 활용여부를 확인하였다.
- 균주번호 2180을 포함한 총4개 품종에서 1436 bp 부위와 1428 bp 부위에 나타난 PCR band의 염기서열을 확인하여 품종간 차이를 비교하였다. 2180, 2183, 2725, 2016 품종의 특이 band DNA 염기서열을 분석한 결과는 Fig.
- , 2006). 따라서 이러한 문제의 해결책으로 RAPD 분석결과에서 생성된 특이 band들을 cloning과 sequencing 과정을 거쳐 새로운 Sequenced Characterized Amplified Region (SCAR) primer를 제작하여 특정 DNA단편을 재현성 있게 증폭하는 SCAR marker가 개발되었다. RAPD는 우성유전자가 발현된다는 성질과 실험의 민감성 때문에 실용화 문제에 제한이 있으나, 우성인 RAPD marker의 공우성 SCAR로의 전환은 F2 집단에 대한 분석에 많은 도움을 주어 gene mapping 등에 유용하게 이용될 수 있다(Paran and Michelmore, 1993).
- 이전에 서 등(2008)이 URP primer (Seoulin, Korea) 12종류로 실험한 결과를 바탕으로 원형 품종과 같은 band 양상을 보인 품종을 제외시키고, marker 개발을 위하여 dendrogram상의 각 group에서 고르게 총 18품종을 선정하여 Operon primer에 대한 RAPD 분석을 수행하였다. 또한 개발한 SCAR 마커를 느타리버섯류 81 품종에 대해 적용하였다 (Table 1).
- 원형 품종 특이적인 DNA fragment는 1535 bp의 염기로 구성되어 있었다. 본 연구에서 primer를 합성한 방법은 RAPD 분석에서 원형느타리 품종에서 특이적으로 생산된 PCR 산물의 염기서열정보를 기초로 하여 RAPD primer 염기서열 부분을 함께 넣어 20~22 bp를 SCAR PCR을 위한 새로운 primer로 합성하였는데, 즉 10 bp의 RAPD primer에 안쪽에서 끝으로 10 bp 내지 12 bp의 염기를 추가하여 제작하였다(Fig. 2).
- 분리된 plasmid에서 cloning이 정확하게 되었는지 확인하기 위해 제한효소인 EcoRⅠ을 이용하여 분리된 plasmid DNA 1 µl, 1U EcoRI (TOYOBO Biochemicals, Osaka, Japan), 10× buffer 2 µl, 멸균수 6 µl와 혼합하여 전체 양을 10 µl로 하여 37℃에서 1~2시간 반응시킨 후 1.5% agarose gel에서 전기 영동하여 cloning이 되었음을 확인하였다.
- 원형 품종의 특이 band가 SCAR marker로 개발될 수 있는 band인가를 확인하기 위하여 이들 특이 단편들을 PCR 단편의 cloning이 가능한 pGEM- T easy vector에 cloning 하였다. 분리된 plasmid에서 cloning이 정확하게 되었는지 확인하기 위해 제한효소인 EcoRⅠ을 이용하여 분리된 plasmid DNA 1 µl, 1U EcoRI (TOYOBO Biochemicals, Osaka, Japan), 10× buffer 2 µl, 멸균수 6 µl와 혼합하여 전체 양을 10 µl로 하여 37℃에서 1~2시간 반응시킨 후 1.
- 2072, 2016 품종은 double band를 나타낸 품종들로서, 2016의 경우 갓의 모양은 깔때기형으로 다발 형성이 잘되고 갓의 색깔은 연황색이나 고온에서는 점차 백색에 가까워지는 특성이 있다. 위 7가지 품종을 대상으로 Operon primer로 PCR하여 band pattern 을 조사하였다(Fig. 5). 2180, 2183, 2595 품종은 6가지 primer로 PCR한 결과 모두 같은 band 양상을 보였으며, 2240과 2725는 원형 품종과 band pattern이 매우 유사하지만 OPI-13과 OPH-04에서 약간 다른 band pattern이 관찰되었다.
- 유전자가 삽입된 transformant를 선별하기 위해서 100 µg/ml의 ampicillin (Sigma Co., USA), 100 µl isopropylthio-D-galactoside (IPTG, 100 mM, Promega, USA)와 20 µl 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal, 50 µg/ml, Sigma Co., USA)가 첨가된 LB배지 (10 g bacto trypton/L, 5 g bacto yeast extract 10 g/L, bacto agar 15 g/L)에 도말하였다.
- 이전에 서 등(2008)이 URP primer (Seoulin, Korea) 12종류로 실험한 결과를 바탕으로 원형 품종과 같은 band 양상을 보인 품종을 제외시키고, marker 개발을 위하여 dendrogram상의 각 group에서 고르게 총 18품종을 선정하여 Operon primer에 대한 RAPD 분석을 수행하였다. 또한 개발한 SCAR 마커를 느타리버섯류 81 품종에 대해 적용하였다 (Table 1).
- 증폭된 PCR 산물은 1× TAE (40 mM Tris; pH 8.0, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA) 완충용액에서 1.5%의 agarose gel로 전기영동한 후 ethidium bromide (Sigma, USA) 용액으로 염색하여 UV transilluminator상에서 나타나는 DNA band pattern을 확인하였다.
- SCAR marker 개발을 위한 primer 제작은 Primer 3 (Whitehead Institute/MT center) program을 사용하여 GC 함량이 40~60%이고, annealing 온도가 약 55℃가 되도록 20~22 mer forward와 reverse primer를 design 하였으며, primer 합성은 (주) 바이오니아에 의뢰하였다. 특이 band를 기초로 하여 만들어진 각각의 primer가 SCAR marker로 이용이 가능한지 확인하기 위해 genomic DNA로부터 PCR을 수행하여 얻은 증폭산물의 SCAR marker로의 활용여부를 확인하였다. Bioneer PCR Premix (Bioneer, Korea)에 genomic DNA 100 ng과 primer 10 pmole, 그리고 DDW를 첨가하여 전체 20 µl의 혼합액을 제조하였다.
- marker의 명확성의 여부는 PCR product size에서 나타나는 특이 band의 유무로 결정할 수 있었다. 특이적인 단편에 대한 각각의 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 설치되어 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)에서 BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool-N)과 BLASTX (Basic Local Alignment Search Tool X)로 상동성 검색을 실시하였다.
대상 데이터
- Operon primer (10 mer)는 OPAX 20개, OPB 18개, OPI 20개, OPF 20개, OPD 20개, OPA 16개, OPH 17개, OPG 20개, OPJ 20개, OPC 19개, OPE 20개 그리고 OPO 18개로 총 228개를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다. PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Genet Bio PCR Premix kit (Genet Bio, Korea)를 이용하여, Premix kit에 genomic DNA 50 ng 2 µl, primer 100 ng 1 µl, DDW 7 µl를 첨가하였다.
- 1). 실험에 사용된 Operon primer (Operon Tecnologies, INC.) 228개 중에서 원형 품종에서만 특이적으로 나타나는 PCR 산물이 19개 관찰되었다. 원형느타리 품종만의 특이한 band를 가지는 primer는 OPAX-13, OPD-02, OPI-13, OPH-04, OPH-07, OPB-16, OPH-09, OPH-11, OPH-16, OPH-15, OPG-09, OPJ-03, OPJ-07, OPH-20, OPE-05, OPE-11, OPF-09, OPF-19 및 OPO-05였다.
이론/모형
- SCAR marker로 PCR하여 생성된 특이 band들에 대한 염기서열을 밝혀낸 후 이를 토대로 EMBL EBI (European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2)에서 온라인으로 제공하는 CLUSTALW (version 2.05) program을 이용하여 multiple sequence alignment를 수행하였다.
성능/효과
- 5). 2180, 2183, 2595 품종은 6가지 primer로 PCR한 결과 모두 같은 band 양상을 보였으며, 2240과 2725는 원형 품종과 band pattern이 매우 유사하지만 OPI-13과 OPH-04에서 약간 다른 band pattern이 관찰되었다. 이 결과는 이전에 서 등(2008)이 보고한 URP-PCR 분석결과와 일치하였다.
- BLASTN 검색결과 2180 clone (120 bits) nucleotide sequence 는 역전사효소를 coding하는 나도가둑송이버섯인 Tricholoma bakamatsutake의 pol gene과 68% 상동성(E value 2e−23) 을 보였다.
- 품종은 gap도 다른 품종들과 비교하여 많은 편이었고, 2180 품종의 아미노산과 hypothetical protein의 아미노산 서열이 일치하는 정도를 나타내는 identity 값은 50%를 나타내어 다른 품종들보다 상동성이 적었다. Positive는 아미노산 서열간의 유사성 정도를 나타내는데, 2180 품종은 hypothetical protein과 65%의 유사성을 보였고, Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와는 69%의 유사성을 보여 다른 품종들이 이들 2개의 아미노산 서열과 70% 이상의 유사성을 보인 것보다 상동성 정도가 낮았다 (data not shown). 본 연구에서는 ‘S-OPO5’ SCAR PCR 산물을 대상으로 염기서열 분석을 한 결과 1436 bp 부근에서 단일 band를 보인 품종들은 nucleotide sequence도 99% 상동성을 보여 매우 유사하였으며 UPGMA 분석결과 명확하게 동일 분류군으로 분류되었다.
- 따라서 ‘SOPO5’ marker는 원형 유사품종을 구분하는데 이용할 수 있으며, 품종간에 특이성 지표로 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
- ‘S-OPO5’ primer로 PCR한 후 균주번호 2180, 2183, 2725, 2016의 특이 band를 sequencing하여 이 결과로 NCBI에서 제공하는 BLASTN program을 이용하여 등록되어 있는 nucleotide와의 일치성을 분석하였으나 일치되는 보고를 찾을 수 없었다. 따라서 BLASTX program을 이용하여 단백질 아미노산서열 수준에서 상동성 검색을 한 결과를 보면 2183, 2725, 2016 품종들의 단백질은 재먹물버섯인 Coprinus cinereus의 hypothetical protein, 송이속에 속하는 Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와 72% 이상의 유사성을 보였다. 그러나 2180 품종은 Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와 334개의 아미노산중 232개가 일치하여 69%의 유사성을 나타내 다른 품종들과 차이를 보였다.
- 또한, 아미노산 염기서열 분석에서는 Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와 52% 상동성(E value 1e−115)을 나타냈으며, Coprinopsis cinerea의 conserved hypothetical protein과 54%의 상동성(E value 1e−109)을 보였다.
- 본 연구에서 원형 품종 특이 marker로 개발한 ‘S-OPO5’ primer는 품종의 유전적 특성과 생태형이 비슷하며, 품종육성에 이용된 교배 모본의 계보가 유사한 품종들간에 나타난 band인 것으로 분석되었다.
- 본 연구에서 제작한´S-OPO5´ marker (F: 5´CCAGTCACTGCTTGACTACTG-3´, R: 5´-GGAATTCGATTCCCAGTCAC-3´)는다양한느타리 품종에서 1436 bp, 1428 bp 그리고 450 bp 부분에서 band가나타났다.
- 본 연구에서는 ‘S-OPO5’ SCAR PCR 산물을 대상으로 염기서열 분석을 한 결과 1436 bp 부근에서 단일 band를 보인 품종들은 nucleotide sequence도 99% 상동성을 보여 매우 유사하였으며 UPGMA 분석결과 명확하게 동일 분류군으로 분류되었다.
- 4는 제작한 'S-OPO5' primer로 PCR한 결과 공통된 같은 band를 보인 균주들의 자실체 형태를 비교한 사진이다. 사진에서 보는 바와 같이 7품종의 갓 색깔은 밝은 회색으로 거의 비슷한 색깔을 나타내었고, 갓 형태를 보면 2072, 2016을 제외한 5품종에서 모두 깔때기와 우산형의 중간형인 반구형으로 갓이 둥근 모양을 보였다. 2072, 2016 품종은 double band를 나타낸 품종들로서, 2016의 경우 갓의 모양은 깔때기형으로 다발 형성이 잘되고 갓의 색깔은 연황색이나 고온에서는 점차 백색에 가까워지는 특성이 있다.
- 이러한 품종육성 경위로 볼 때 2016 품종이 2180과 같은 위치에서 band가 나타난 것은 2016이 2180의 교배모본이므로 유사한 유전형질이 있기 때문인 것으로 판단되며, Paran과 Michelmore (1993)가 dominant RAPD locus를 codominant SCAR locus로 전환하는 것이 가능하며, RAPD 다형성은 primer가 인식하는 부위의 불일치로 생성되므로, 길이가 상대적으로 더 긴 SCAR primer를 사용함으로써 원래 양친 모두의 증폭산물을 얻을 수 있다고 보고한 내용과 일치한다. 실제로, 2016 품종의 PCR 산물에서 원형 품종과 같은 위치에서 나타난 band의 DNA 염기서열을 분석한 결과 99%의 상동성을 보였다.
- 이들 원형 유사품종들의 SCAR PCR 산물을 대상으로 염기서열 분석을 한 결과 nucleotide 염기서열은 NCBI database에서 상동성이 있는 유전자를 찾을 수 없었으며, 이들 5품종간의 nucleotide sequence는 99% 상동성을 보여 매우 유사하였다. 아미노산 서열을 분석한 결과는 NCBI database내에 존재하는 모든 유전자들 중 송이속에 속하는 Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와 가장 상동성이 높은 것으로 나타났다.
- 원형 품종 특이적인 SCAR marker로 개발한 ‘S-OPO5’ primer는 1436 bp 부분에서 원형 유사품종인 2183, 2240, 2595, 2725 품종에서만 특이적으로 단일 band를 보였다.
- 원형 품종 특이 marker로 제작한 것이 ‘S-OPO5’ primer 이다. 이 marker를 사용하여 PCR 분석을 하면 약 1436 bp 부분에서 단일 band가 나타나는데 이 band가 나타난 2183, 2240, 2595, 2725 품종들은 형태적 특성이 2180(원형)과 닮았고, nucleotide sequence도 99% 상동성을 보여 이 SCAR marker를 원형느타리와 유사한 품종을 구분하는 marker로 이용할 수 있을 것으로 판단된다. 동일 band를 나타낸 이들 품종의 육성경위나 품종명은 종균배양소에서 동일품종인 것을 다르게 명칭하였거나 2180 품종을 조직배양한 것으로 추측된다.
- 본 연구에서는 ‘S-OPO5’ SCAR PCR 산물을 대상으로 염기서열 분석을 한 결과 1436 bp 부근에서 단일 band를 보인 품종들은 nucleotide sequence도 99% 상동성을 보여 매우 유사하였으며 UPGMA 분석결과 명확하게 동일 분류군으로 분류되었다. 이들 nucleotide 염기서열은 NCBI database 에서 상동성이 있는 유전자를 찾을 수 없었으며, 아미노산 서열을 분석한 결과 NCBI database내에 존재하는 모든 유전자들 중 송이 속에 속하는 Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase (Accession no. AB036886.1)와 가장 상동성이 높은 것으로 나타났다(data not shown).
- 원형 품종 특이적인 SCAR marker로 개발한 ‘S-OPO5’ primer는 1436 bp 부분에서 원형 유사품종인 2183, 2240, 2595, 2725 품종에서만 특이적으로 단일 band를 보였다. 이들 원형 유사품종들의 SCAR PCR 산물을 대상으로 염기서열 분석을 한 결과 nucleotide 염기서열은 NCBI database에서 상동성이 있는 유전자를 찾을 수 없었으며, 이들 5품종간의 nucleotide sequence는 99% 상동성을 보여 매우 유사하였다. 아미노산 서열을 분석한 결과는 NCBI database내에 존재하는 모든 유전자들 중 송이속에 속하는 Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와 가장 상동성이 높은 것으로 나타났다.
- 그러나 2180 품종은 Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와 334개의 아미노산중 232개가 일치하여 69%의 유사성을 나타내 다른 품종들과 차이를 보였다. 품종은 gap도 다른 품종들과 비교하여 많은 편이었고, 2180 품종의 아미노산과 hypothetical protein의 아미노산 서열이 일치하는 정도를 나타내는 identity 값은 50%를 나타내어 다른 품종들보다 상동성이 적었다. Positive는 아미노산 서열간의 유사성 정도를 나타내는데, 2180 품종은 hypothetical protein과 65%의 유사성을 보였고, Tricholoma bakamatsutake의 reverse transcriptase와는 69%의 유사성을 보여 다른 품종들이 이들 2개의 아미노산 서열과 70% 이상의 유사성을 보인 것보다 상동성 정도가 낮았다 (data not shown).
후속연구
- 그렇기 때문에 유전적, 생화학적 방법들에 의한 분류가 요구되고 있다. 따라서 버섯 품종의구분을명확히할수있는분자 marker를 개발하는 것이 버섯 품종유통의 혼선을 피할 수 있으며, 버섯 품종육종에서도 큰 도움이 되리라 생각한다.
- 본 연구에서는 느타리 품종 중 원형느타리를 구분할 수 있는 marker를 개발하여 유사품종을 구분할 수 있는 기준을 제시하였으며, 이는 품종 판별을 위하여 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
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