도라지 부탄올 추출물의 항산화 및 nitric oxide 생성 저해 효과 Inhibitory Effect of Extracts of Platycodon grandiflorum (the Ballon Flower) on Oxidation and Nitric Oxide Production원문보기
본 연구에서는 도라지 분말을 유기용매로 추출한 후 도라지의 추출물과 분획물들에 의한 세포 내 활성산소종 및 glutathione (GSH)를 측정하여 항산화효과를 검토하였고 NO 생성 저해 효과를 알아보았다. 세포 내 활성산소종 생성억제 실험에서 건조 도라지의 A+M 및 MeOH 추출물과 추출물을 n-hexane, 85% aq. MeOH, n-BuOH, water로 다시 추출하여 얻어진 각각의 분획물들을 농도별로 HT1080 세포에 처리하였을 때 A+M과 MeOH 추출물 모두 측정시간 120분 동안 $500\;{\mu}M$$H_2O_2$만을 처리한 control군에 비해 세포 내 활성산소종을 크게 억제시켰으며, MeOH 추출물에 의한 항산화 효과가 더 높게 나타났다. 또한, 각 분획물들 중 n-BuOH 분획물이 다른 분획물들에 비해 우수한 항산화 활성을 보였다. GSH 농도 측정 실험에서 A+M 및 85% aq. MeOH 분획물를 처리했을 때 GSH 함량이 증가하였다. NO 생성 저해 실험에서는 A+M 및 MeOH 추출물이 0.01 및 0.05 mg/mL의 농도에서 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, A+M 추출물에 의한 저해 효과가 높았다. 각 분획물들은 모두 control보다 낮은 NO 생성량을 나타내었으며, 특히 85% aq. MeOH 및 n-BuOH 분획물은 0.05 mg/mL 농도에서 blank에 가까운 NO 생성 억제율을 나타냈다. 이상의 연구결과로부터 n-BuOH 분획물에 의한 세포 내 활성산소종 생성 억제 효과 및 NO 생성 저해 효과가 우수함을 알 수 있었으며, 향후 분획물의 분리 정제를 통한 새로운 기능성 물질의 개발이 필요할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 도라지 분말을 유기용매로 추출한 후 도라지의 추출물과 분획물들에 의한 세포 내 활성산소종 및 glutathione (GSH)를 측정하여 항산화효과를 검토하였고 NO 생성 저해 효과를 알아보았다. 세포 내 활성산소종 생성억제 실험에서 건조 도라지의 A+M 및 MeOH 추출물과 추출물을 n-hexane, 85% aq. MeOH, n-BuOH, water로 다시 추출하여 얻어진 각각의 분획물들을 농도별로 HT1080 세포에 처리하였을 때 A+M과 MeOH 추출물 모두 측정시간 120분 동안 $500\;{\mu}M$$H_2O_2$만을 처리한 control군에 비해 세포 내 활성산소종을 크게 억제시켰으며, MeOH 추출물에 의한 항산화 효과가 더 높게 나타났다. 또한, 각 분획물들 중 n-BuOH 분획물이 다른 분획물들에 비해 우수한 항산화 활성을 보였다. GSH 농도 측정 실험에서 A+M 및 85% aq. MeOH 분획물를 처리했을 때 GSH 함량이 증가하였다. NO 생성 저해 실험에서는 A+M 및 MeOH 추출물이 0.01 및 0.05 mg/mL의 농도에서 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, A+M 추출물에 의한 저해 효과가 높았다. 각 분획물들은 모두 control보다 낮은 NO 생성량을 나타내었으며, 특히 85% aq. MeOH 및 n-BuOH 분획물은 0.05 mg/mL 농도에서 blank에 가까운 NO 생성 억제율을 나타냈다. 이상의 연구결과로부터 n-BuOH 분획물에 의한 세포 내 활성산소종 생성 억제 효과 및 NO 생성 저해 효과가 우수함을 알 수 있었으며, 향후 분획물의 분리 정제를 통한 새로운 기능성 물질의 개발이 필요할 것으로 사료된다.
We explored the effect of extracts of dried Platycodon grandiflorum on production of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH) and nitric oxide (NO). To determine antioxidant activity in the presence of $H_2O_2$-induced oxidative stress, DCFH-DA (dichlorodihydrofluorescin diacetate...
We explored the effect of extracts of dried Platycodon grandiflorum on production of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH) and nitric oxide (NO). To determine antioxidant activity in the presence of $H_2O_2$-induced oxidative stress, DCFH-DA (dichlorodihydrofluorescin diacetate) assay was employed. Acetone/methylene chloride (A+M) and methanolic (MeOH) extracts of P. grandiflorum reduced intracellular ROS levels. Of the various tested fractions, n-BuOH fraction showed the highest protective effect in terms of lipid peroxide production. Total GSH levels were measured after treatment of HT1080 cells with the A+M and MeOH extracts, and other solvent fractions, at various concentration. The A+M extacts and 85% (v/v) aqueous MeOH fraction significantly increased GSH levels (p<0.05). When lipopolysaccharide (LPS)-induced NO production was evaluated, all tested crude extracts, and fractions thereof, significantly reduced NO production (p<0.05), and the n-BuOH and 85% (v/v) aqueous MeOH fractions (at 0.05 mg/mL) showed the strongest inhibitory effects. The results showed that the n-BuOH fraction inhibited both cellular oxidation and NO production, and this fraction may thus contain valuable active compounds.
We explored the effect of extracts of dried Platycodon grandiflorum on production of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH) and nitric oxide (NO). To determine antioxidant activity in the presence of $H_2O_2$-induced oxidative stress, DCFH-DA (dichlorodihydrofluorescin diacetate) assay was employed. Acetone/methylene chloride (A+M) and methanolic (MeOH) extracts of P. grandiflorum reduced intracellular ROS levels. Of the various tested fractions, n-BuOH fraction showed the highest protective effect in terms of lipid peroxide production. Total GSH levels were measured after treatment of HT1080 cells with the A+M and MeOH extracts, and other solvent fractions, at various concentration. The A+M extacts and 85% (v/v) aqueous MeOH fraction significantly increased GSH levels (p<0.05). When lipopolysaccharide (LPS)-induced NO production was evaluated, all tested crude extracts, and fractions thereof, significantly reduced NO production (p<0.05), and the n-BuOH and 85% (v/v) aqueous MeOH fractions (at 0.05 mg/mL) showed the strongest inhibitory effects. The results showed that the n-BuOH fraction inhibited both cellular oxidation and NO production, and this fraction may thus contain valuable active compounds.
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문제 정의
이에 따라 과잉의 활성산소종의 제거 및 생체 내 항산화 방어 시스템의 증진에 대한 관심이 높아지고 있으며, 약물이 아닌 천연성분에서 그 효능을 찾는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 따라서 본 연구에서는 저온진공건조법으로 도라지를 건조하고, 분말화한 후 유기용매로 추출하여 도라지의 추출물과 분획물들에 의한 세포 내 활성산소종 및 glutathione (GSH)를 측정하여 항산화효과를 검토하고 NO 생성 저해 효과를 알아보고자 한다.
본 연구에서는 도라지 분말을 유기용매로 추출한 후 도라지의 추출물과 분획물들에 의한 세포 내 활성산소종 및 glutathione (GSH)를 측정하여 항산화효과를 검토하였고 NO 생성 저해 효과를 알아보았다. 세포 내 활성산소종 생성 억제 실험에서 건조 도라지의 A+M 및 MeOH 추출물과 추출물을 n-hexane, 85% aq.
활성산소종 형성과 관련된 실험에는 인체 섬유육종세포인 HT1080가 사용되고 있으며(25), 본 연구에서도 HT1080세포를 이용하여 DCFH-DA assay를 통해 건조 도라지의 활성산소종 억제효과를 알아보고자 하였다. Fig.
제안 방법
건조 도라지 추출물이 세포 내의 GSH 함량에 미치는 영향을 측정하기 위하여 thiol-stanining reagent인 mBBr을 이용하여 측정하였다. Fig. 3은 A+M 및 MeOH 추출물을 0.01, 0.05, 0.1 및 0.5 mg/mL의 농도에서 측정하였으며, 120분 동안 30분 간격으로 측정하였다. 측정시간 120분일 때, A+M 추출물(0.
NO의 생성량은 RAW 264.7 세포의 배양액 중에 LPS 자극으로 유도된 NO의 함량을 측정하는 것으로 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 농도에서 건조 도라지 추출물과 분획물을 처리하여 배양한 후, 세포 배양액에 Griess 시약을 반응시켜 확인하였다. 시료는 0.
1% N-(1-naphtyl) etylenediamine : 1% sulfanilamide = 1:1)을 이용하여 microplate reader (VICTOR3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. sodium nitrate를 사용하여 측정된 흡광도로 표준곡선을 작성하여 NO의 농도별 흡광도를 얻었으며, 표준곡선을 실험결과에 적용하여 생성된 NO의 함량을 정량하였다.
건조 도라지 추출물이 세포 내의 GSH 함량에 미치는 영향을 측정하기 위하여 thiol-stanining reagent인 mBBr을 이용하여 측정하였다. Fig.
건조된 도라지 분말(200 g)은 실험 사용 전까지 -70℃의 deep freezer (NF-400SF, Nihon Freezer, Tokyo, Japan)에 냉동 보관되었다가 유기용매 추출을 위하여 acetone:methylene chloride를 1:1 비율로 첨가하여 24시간 방치 한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하여 acetone/methylene chloride 추출물(A+M) (2.
대조군들 (blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 μM H2O2를 처리를 하고, blank군은 500 μM H2O2 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.
배양액을 10% FBS가 함유된 MEM 배지로 교체한 후 준비된 시료를 1시간 동안 전처리하고, NO 생성을 유도하기 위해 lipopolysaccharide (LPS) (1 μg/mL = 1 ppm)를 처리한 후, 48시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
세포내에 축적된 GSH 함량은 HT1080 세포를 이용하여 thiol-staining reagent인 monobromobimane (mBBr)로 측정 하였다(23). 세포는 96-well cell culture plate에 well 당 5×104 cells/mL에서 30분간 배양하였다.
7 세포의 배양액 중에 LPS 자극으로 유도된 NO의 함량을 측정하는 것으로 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 농도에서 건조 도라지 추출물과 분획물을 처리하여 배양한 후, 세포 배양액에 Griess 시약을 반응시켜 확인하였다. 시료는 0.05 및 0.01 mg/mL의 농도로 처리하였으며, 대조군으로는 시료대신 PBS를 사용하여 LPS를 처리 한 control과 시료 및 LPS를 처리하지 않은 blank를 사용하였다. LPS를 처리한 control은 NO의 생성량이 높게 나타났으며, LPS를 처리하지 않은 blank는 NO의 생성량이 상대적으로 매우 낮게 나타났다.
배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.05% trypsin-0.02% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 cell culture flask에 10 mL씩 일정한 수로 분할하여 주입하고, 6～7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
대상 데이터
HT1080 세포와 RAW 264.7 세포는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT, USA)가 함유된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-15AC, SANYO Electric Biomedical Co, Tokyo, Japan)에서 배양하였다.
본 실험에 사용된 도라지(Platycodon grandiflorum)는 부산 엄궁 농산물 시장에서 구입하여 저온진공건조기 (STVD-50, SANYA, Busan, Korea)를 이용하여 상당포화온도 15～25℃, 절대압력 15～40 mmHg에서 24시간 건조시켜 도라지 분말(60 mesh)을 제조하였다.
한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 섬유육종세포(HT1080) 및 마우스 대식세포(RAW 264.7)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT1080 세포와 RAW 264.
최근 도라지의 여러 가지 약리효과를 검증한 결과로 도라지의 소비량이 증가하면서 재배면적이 확대되고 있으며, 특히 도라지를 20년 이상 장기 재배하는 방법이 개발됨에 따라 20년근 이상의 도라지 즉, 다년생 도라지에 대한 각종 연구들이 활발히 진행되고 있다(9, 10). 현재 도라지의 경우 분말, 청, 즙, 환의 가공식품형태로 시중에 유통되고 있으며 분말 형태가 활용도가 높고, 소비자들이 많이 찾는 경향이 있어 본 연구에서도 도라지 분말을 이용하여 실험하였다. 본 연구에서 도라지를 분말화 하기 위해 사용된 저온진공건조기술(11)은 건조과정 중 산소가 거의 차단되어 건조과정 중에 일어날 수 있는 부패와 변질을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 동결 및 열풍건조에 비하여 건조시간이 3-4배 빠르기 때문에 그만큼 생산성도 높아지는 장점이 있다.
데이터처리
실험은 3회 반복 실험하여 Mean ± SEM (Standard Error of Mean)으로 나타내었고, 분석된 실험 데이터는 대조군과각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 t-test를 실시하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
세포 내 활성산소종은 HT1080 세포를 이용하여 2‘,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) assay (22)로 측정하였다.
성능/효과
Fig. 1은 건조도라지 A+M 및 MeOH 추출물을 농도별로 HT1080 세포에 처리하였을 때 나타낸 결과로 첨가농도 0.01 및 0.05 mg/mL 에서 A+M 및 MeOH 추출물 모두 측정시간 120분 동안 500 μM H2O2만을 처리한 control군에 비해 세포 내 활성산소종을 크게 억제시켰으며, MeOH 추출물에 의한 항산화 효과가 높게 나타났다(p<0.05).
01 mg/mL의 농도로 처리하였으며, 대조군으로는 시료대신 PBS를 사용하여 LPS를 처리 한 control과 시료 및 LPS를 처리하지 않은 blank를 사용하였다. LPS를 처리한 control은 NO의 생성량이 높게 나타났으며, LPS를 처리하지 않은 blank는 NO의 생성량이 상대적으로 매우 낮게 나타났다. NO 생성 저해 효과를 확인한 결과, A+M 및 MeOH 추출물은 0.
MeOH, n-BuOH 및 water로 다시 추출 하여 얻어진 각 분획물들에 의한 HT1080 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것으로 n-BuOH 분획물을 첨가농도 0.01 mg/mL로 처리했을 때 높은 항산화 활성을 보였으며 (p<0.05), 다른 분획물들의 항산화 효과는 낮았다.
MeOH, n-BuOH, water로 다시 추출하여 얻어진 각각의 분획물들을 농도별로 HT1080 세포에 처리하였을 때 A+M과 MeOH 추출물 모두 측정시간 120분 동안 500 μM H2O2만을 처리한 control군에 비해 세포내 활성산소종을 크게 억제시켰으며, MeOH 추출물에 의한 항산화 효과가 더 높게 나타났다.
MeOH 분획물를 처리했을 때 GSH 함량이 증가하였다. NO 생성 저해 실험에서는 A+M 및 MeOH 추출물이 0.01 및 0.05 mg/mL의 농도에서 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, A+M 추출물에 의한 저해 효과가 높았다. 각 분획물들은 모두 control보다 낮은 NO 생성량을 나타내었으며, 특히 85% aq.
NO 생성 저해 효과를 확인한 결과, A+M 및 MeOH 추출물은 0.01 및 0.05 mg/mL의 농도에서 NO 생성을 유의적으로 억제하였으며(p<0.05), MeOH 추출물과 비교했을 때 A+M 추출물에 의한 NO 생성 저해 효과가 높았다(Fig. 5).
05), 다른 분획물들의 항산화 효과는 낮았다. 따라서 세포 내 활성산소종 감소에 의한 항산화 효과는 MeOH 추출물과 n-BuOH 분획물에서 높게 나타나는 것을 알 수있었다. Lee 등(25)은 ROS 신호경로를 통한 nuclear factor-κ B (NF-κB) 활성화의 조절을 도라지로부터 유래된 사포닌이 matrixmetalloproteinase (MMP) 활성과 HT-1080 세포 침입억제를 살펴본 결과, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (PMA)에 의해 유도된 ROS 생성이 장생도라지 사포닌의 첨가로 어느 정도 감소되었으며, 이러한 ROS 생성 억제는 NF-κB 활성이 줄어드는 것과 관계가 있을 것이라고 보고하였다.
MeOH, n-BuOH, water로 다시 추출하여 얻어진 각각의 분획물들을 농도별로 HT1080 세포에 처리하였을 때 A+M과 MeOH 추출물 모두 측정시간 120분 동안 500 μM H2O2만을 처리한 control군에 비해 세포내 활성산소종을 크게 억제시켰으며, MeOH 추출물에 의한 항산화 효과가 더 높게 나타났다. 또한, 각 분획물들 중 n-BuOH 분획물이 다른 분획물들에 비해 우수한 항산화 활성을 보였다. GSH 농도 측정 실험에서 A+M 및 85% aq.
측정시간 120분일 때, A+M 추출물(0.1과 0.5 mg/mL 첨가농도)은 GSH 함량을 유의적으로 증가하였으나(p<0.05), MeOH 추출물에 의한 효과는 없었다.
후속연구
또한 항산화 시스템 발현에 미치는 더덕과 도라지 에틸아세테이트 분획물의 영향을 RT-PCR로 알아본 결과 catalase, glucose- 6-phosphate dehydrogenase (G6PD) 그리고 metallothionein (MT)-1A mRNA 수준이 더덕 에틸아세테이트 분획물 처리 후 증가하였고, Mn superoxide dismutase, catalase, G6PD, MT-1A와 MT-2A mRNA 수준은 도라지 에틸아세테이트 분획물 처리 후 증가하였다고 보고하였다. 이상의 연구 결과로부터 n-BuOH 분획물에 의한 세포 내 활성 산소종 생성 억제 효과 및 NO 생성 억제효과가 우수하였으므로 이 분획물에 건조 도라지의 생리활성 물질인 사포닌을 비롯한 아미노산, 섬유소 및 indole 화합물이 함유되어 있을 것으로 기대되며 향후 주요 활성물질 분리 및 이에 의한 생리활성 연구가 진행될 필요가 있다.
05 mg/mL 농도에서 blank에 가까운 NO 생성 억제율을 나타냈다. 이상의 연구결과로부터 n-BuOH 분획물에 의한 세포 내 활성산소종 생성 억제 효과 및 NO 생성 저해 효과가 우수함을 알 수 있었으며, 향후 분획물의 분리 정제를 통한 새로운 기능성 물질의 개발이 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
도라지란?
도라지(Platycodon grandiflorum)는 한국, 일본 및 중국의 산간지방에서 널리 자생하며, 한방에서 약재로 사용되기도 하고, 일반식용으로도 널리 이용되고 있는 산채 식품으로서 triterpenoid계 사포닌, 당질 및 섬유질을 함유하고 있다 (1, 2). 이러한 사포닌은 동물실험에서 진해, 거담작용, 중추 신경 억제작용, 급성 만성염, 항궤양 및 위액분비 억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사 개선작용, 항산화 및 항암효과 등이 있는 것으로 밝혀져 있으며, 생약재로서 도라지가 배합되어 있는 한방 처방 수는 동의보감에 287건, 방약합편에 49건이 수록되어 있을 정도로 다양한 약리작용을 갖고 있다(3-8).
triterpenoid계 사포닌의 효능은 무엇인가?
도라지(Platycodon grandiflorum)는 한국, 일본 및 중국의 산간지방에서 널리 자생하며, 한방에서 약재로 사용되기도 하고, 일반식용으로도 널리 이용되고 있는 산채 식품으로서 triterpenoid계 사포닌, 당질 및 섬유질을 함유하고 있다 (1, 2). 이러한 사포닌은 동물실험에서 진해, 거담작용, 중추 신경 억제작용, 급성 만성염, 항궤양 및 위액분비 억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사 개선작용, 항산화 및 항암효과 등이 있는 것으로 밝혀져 있으며, 생약재로서 도라지가 배합되어 있는 한방 처방 수는 동의보감에 287건, 방약합편에 49건이 수록되어 있을 정도로 다양한 약리작용을 갖고 있다(3-8). 최근 도라지의 여러 가지 약리효과를 검증한 결과로 도라지의 소비량이 증가하면서 재배면적이 확대되고 있으며, 특히 도라지를 20년 이상 장기 재배하는 방법이 개발됨에 따라 20년근 이상의 도라지 즉, 다년생 도라지에 대한 각종 연구들이 활발히 진행되고 있다(9, 10).
활성산소종이란?
현재 노인 인구가 증가하면서 노화를 포함한 각종 성인병 발생의 원인이 되고 있는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 관심이 높아지고 있다. 활성산소종은 산소 라디칼 및 이것으로부터 파생된 여러 가지 산소화합물을 통칭하는 것으로 생체 내에서 산소는 그 화학적 성질로 인하여 환원되어 유리 라디칼(free radical)인 superoxide anion radical (O2-), hydroxyl radical ( · OH)과 같은 oxygen radical 뿐만 아니라 hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen (1O2)과 같은 몇 종류의 non-radical, 그리고 그 외에 피부에 이차적으로 생성된 것(ROO · , RO · , NO · , HOCl 등)을 말한다. 이들 활성산소종에 의한 산화적 스트레스는 체내에서 세포막 손상, DNA 변성, 지질 산화, 단백질 분해 등을 초래하여, 뇌혈관 질환, 암 및 심혈관계 질환 등과 같은 만성질환들의 발생 위험을 증가시킨다(12, 13).
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