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문제 정의
- 본 연구는 농식품의 식중독균 오염 여부를 신속하게 진단할 수 있는 측방유동 면역방법 기반의 간이 진단키트를 개발하기 위하여 수행되었다. 간이 진단키트는 니트로셀룰로오스 막과 항체를 이용하여 제작하였으며, 키트의 검출 성능은 식중독 유발 원인균 중 하나인 Salmonella typhimurium를 이용하여 검증하였다.
제안 방법
- 간이 진단키트 각 구성부에서의 시료 이동과 시약끼리의 반응을 향상시킬 목적으로 수행한 전처리 효과 비교 실험은 살모넬라균이 포함되지 않은 표준인산용액을 이용하여 수행하였다. 비선택적 반응을 최소화하기 위해 실시한 BSA 처리는 살모넬라항체-금입자 결합물이 살모넬라균 이외의 물질이나 키트 표면에 부착되는 것을 효과적으로 차단하는 것으로 나타났다.
- 본 연구는 농식품의 식중독균 오염 여부를 신속하게 진단할 수 있는 측방유동 면역방법 기반의 간이 진단키트를 개발하기 위하여 수행되었다. 간이 진단키트는 니트로셀룰로오스 막과 항체를 이용하여 제작하였으며, 키트의 검출 성능은 식중독 유발 원인균 중 하나인 Salmonella typhimurium를 이용하여 검증하였다.
- 간이 진단키트는 플라스틱 지지막 위에 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드를 붙여서 제작하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 시료 용액이 끊이지 않고 흐를 수 있도록 각각의 끝부분이 서로 3 mm씩 겹치도록 조립하였다.
- 간이 진단키트를 이용한 살모넬라 검출 실험은 살모넬라균을 표준인산용액에 104～107 cfu/ml로 희석시킨 시료를 이용하여 수행하였다. 또한, 간이 진단키트의 살모넬라균 검출 성능 향상을 위하여 키트를 구성하는 시료패드와 결합패드의 전처리에 따른 영향도 107 cfu/ml 농도의 살모넬라균 시료를 이용하여 함께 조사하였다.
- 간이 진단키트를 이용한 살모넬라균 검출은 100 μL의 시료 용액을 시료패드에 주입하는 방식으로 수행하였다.
- 간이 진단키트를 이용한 식중독균 검출 시 시료 및 시약의 원활한 유동을 위하여 각 구성부의 전처리를 수행하고 그 효과를 분석하였다. 시료패드와 결합패드의 전처리는 2% BSA(Bovine serum albumin) 및 10% 자당(Sucrose)이 첨가된 0.
- 간이 진단키트의 살모넬라균 정량분석 가능성은 평면 스캐너(LIDE 200, Canon, Japan)를 이용하여 검출 실험에 사용된 간이 진단키트의 영상을 획득한 다음 색변화가 발생한 검사선의 밝기를 영상처리 프로그램(Image Tool 3.0, The University of Texas, USA)을 이용하여 측정하였다. 밝기 측정은 검사선에서 가장 진한 색변화를 나타내는 부위에 대하여 일정면적의 폄균값을 구하는 방법으로 수행하였다.
- 식중독균이 검출되었을 때 표시를 위해 사용하는 색입자로는 콜로이드 형태의 금입자나 고무입자를 사용하는데 이 연구에서는 살모넬라균 검출 시 색을 나타내는 표시물질로서 나노미터 크기의 금입자를 사용하였다. 금입자와 항체의 결합은 금입자 제조사에서 제공된 결합 방법을 따랐으며, 금입자와 항체의 최적 결합을 위해 반응 버퍼의 적절한 pH 값은 실험을 통해 구명한 다음 이후 검출 실험에 사용하였다.
- 니트로셀룰로오스 막의 검사선과 컨트롤선은 금입자에 결합시킨 항체와 다른 종류의 살모넬라 항체와 뉴트라아비딘을 각각 도포한 다음 37℃에서 1시간 건조하여 형성시켰다. 살모렐라균의 포획을 위한 검사선은 니트로셀룰로오스 막의 가장자리에서 1 cm 되는 위치에 얇고 단단한 종이의 모서리를 이용해 살모넬라 항체를 찍는 방식으로 제작하였다.
- cfu/ml로 희석시킨 시료를 이용하여 수행하였다. 또한, 간이 진단키트의 살모넬라균 검출 성능 향상을 위하여 키트를 구성하는 시료패드와 결합패드의 전처리에 따른 영향도 107 cfu/ml 농도의 살모넬라균 시료를 이용하여 함께 조사하였다. 실제 농식품 시료에 대한 간이 진단키트의 적용 가능성은 닭고기 세척 버퍼에 105～108 cfu/ml의 농도로 접종한 살모넬라균 시료를 이용하여 수행하였다.
- 니트로셀룰로오스 막의 검사선과 컨트롤선은 금입자에 결합시킨 항체와 다른 종류의 살모넬라 항체와 뉴트라아비딘을 각각 도포한 다음 37℃에서 1시간 건조하여 형성시켰다. 살모렐라균의 포획을 위한 검사선은 니트로셀룰로오스 막의 가장자리에서 1 cm 되는 위치에 얇고 단단한 종이의 모서리를 이용해 살모넬라 항체를 찍는 방식으로 제작하였다. 살모넬라 항체는 표준인산버퍼에 용해된 1 mg/mL 농도의 것을 사용하였다.
- 간이 진단키트는 플라스틱 지지막 위에 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드를 붙여서 제작하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 시료 용액이 끊이지 않고 흐를 수 있도록 각각의 끝부분이 서로 3 mm씩 겹치도록 조립하였다. 조립된 키트는 길이 6 cm, 폭 5 mm로 절단하여 냉장 보관한 뒤 이후 실험에 사용하였다.
- 간이 진단키트를 이용한 식중독균 검출 시 시료 및 시약의 원활한 유동을 위하여 각 구성부의 전처리를 수행하고 그 효과를 분석하였다. 시료패드와 결합패드의 전처리는 2% BSA(Bovine serum albumin) 및 10% 자당(Sucrose)이 첨가된 0.2 M 표준인산버퍼(pH 7.4)에 패드를 담가 버퍼용액을 충분히 흡수시킨 다음 37℃에서 4시간 건조시키는 방법으로 수행하였다. 니트로셀룰로오스 막의 전처리는 표준인산버퍼(pH 7.
- 식중독균의 검출 여부 표시를 위한 금입자와 항체의 결합은 버퍼의 pH 값에 크게 영향을 받기 때문에, 금입자와 항체의 최적 결합을 위해 반응 버퍼의 적절한 pH 값을 실험을 통해 구명하였다. 항체-금입자 결합을 위한 최적 pH 선정을 위한 실험 결과는 그림 5와 같이 결합 단계에서 금입자가 항체와 정상적으로 결합할 경우 혼합용액의 색변화가 없었으나, 항체의 농도가 적어 불완전 결합한 금입자는 응집되어 처음의 붉은색에서 짙은 보라색 또는 검은색으로 변하였다.
- 식중독균이 검출되었을 때 표시를 위해 사용하는 색입자로는 콜로이드 형태의 금입자나 고무입자를 사용하는데 이 연구에서는 살모넬라균 검출 시 색을 나타내는 표시물질로서 나노미터 크기의 금입자를 사용하였다. 금입자와 항체의 결합은 금입자 제조사에서 제공된 결합 방법을 따랐으며, 금입자와 항체의 최적 결합을 위해 반응 버퍼의 적절한 pH 값은 실험을 통해 구명한 다음 이후 검출 실험에 사용하였다.
- 또한, 간이 진단키트의 살모넬라균 검출 성능 향상을 위하여 키트를 구성하는 시료패드와 결합패드의 전처리에 따른 영향도 107 cfu/ml 농도의 살모넬라균 시료를 이용하여 함께 조사하였다. 실제 농식품 시료에 대한 간이 진단키트의 적용 가능성은 닭고기 세척 버퍼에 105～108 cfu/ml의 농도로 접종한 살모넬라균 시료를 이용하여 수행하였다. 닭고기 세척 버퍼는 시중에서 구입한 닭 가슴살 부위 25 g을 225 mL의 표준인산버퍼에 넣고 교반하는 방법으로 제조하였다.
- 이후 실험에서는 색변화를 보이지 않은 세 가지 pH 값의 중간값인 pH 6.6을 이용해 항체와 금입자를 결합하는데 사용하였다. 살모넬라균을 이용한 검출 실험에 앞서 pH 6.
- 제작된 간이 진단키트의 살모넬라균 검출 성능은 농도가 다른 살모넬라균(104～107 cfu/mL)이 포함된 표준인산버퍼시료를 이용하여 조사하였다. 준비된 시료 100 μL를 간이 진단키트의 시료패드에 주입하였을 때 시료용액은 모세관 현상에 의해 결합패드로 이동하는 것이 관찰되었다.
대상 데이터
- 검사 결과를 색으로 나타내는 금입자는 40 nm의 직경을 갖는 것(Gold-in-a-box, Bioassay works, USA)을, 이 금입자와 결합되는 살모넬라 항체는 바이오틴이 부착된 것(707, ViroStat, USA)을, 살모넬라 포획을 위한 검사선의 살모넬라 항체는 토끼에서 생성된 다클론항체(20-SR11, Fitzgerald, MA, USA)를 제조사로부터 구입하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 Millipore사(Hi-Flow Plus, MA, USA), 컨트롤선 제작을 위한 뉴트라아비딘은 Pierce사(31000, IL, USA), 그 외 PBS 등의 시약은 Sigma사(MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 실제 농식품 시료에 대한 간이 진단키트의 적용 가능성은 닭고기 세척 버퍼에 105～108 cfu/ml의 농도로 접종한 살모넬라균 시료를 이용하여 수행하였다. 닭고기 세척 버퍼는 시중에서 구입한 닭 가슴살 부위 25 g을 225 mL의 표준인산버퍼에 넣고 교반하는 방법으로 제조하였다.
- 살모렐라균의 포획을 위한 검사선은 니트로셀룰로오스 막의 가장자리에서 1 cm 되는 위치에 얇고 단단한 종이의 모서리를 이용해 살모넬라 항체를 찍는 방식으로 제작하였다. 살모넬라 항체는 표준인산버퍼에 용해된 1 mg/mL 농도의 것을 사용하였다. 컨트롤선은 표준인산버퍼 용액에 1 mg/mL 농도로 용해시킨 뉴트라아비딘 용액을 검사선에서 흡수패드 쪽으로 5 mm 떨어진 위치에 도포하여 제작하였다.
- 식중독균 검출 실험은 가장 많은 식중독 사고를 일으키는 원인균인 살모넬라균을 대상으로 하여 수행하였다. 살모넬라균주는 생명공학연구원 유전자은행 KCTC(Korea Collection for Type Cultures, Korea)에서 분양받은 Salmonella typhimurium KCTC 12401(S. typhimurium)을 사용하였으며, 세균 군락을 Brain Heart Infusion(BHI)(Difco, USA) 배지에 계대 배양하여 이용하였다. 살모넬라 균수는 표준인산버퍼를 사용하여 단계적으로 희석 한 후 XLD4 agar(Difco, USA) 배지를 사용하여 표준평판법으로 측정하였다.
- 검사 결과를 색으로 나타내는 금입자는 40 nm의 직경을 갖는 것(Gold-in-a-box, Bioassay works, USA)을, 이 금입자와 결합되는 살모넬라 항체는 바이오틴이 부착된 것(707, ViroStat, USA)을, 살모넬라 포획을 위한 검사선의 살모넬라 항체는 토끼에서 생성된 다클론항체(20-SR11, Fitzgerald, MA, USA)를 제조사로부터 구입하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 Millipore사(Hi-Flow Plus, MA, USA), 컨트롤선 제작을 위한 뉴트라아비딘은 Pierce사(31000, IL, USA), 그 외 PBS 등의 시약은 Sigma사(MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 식중독균 검출 실험은 가장 많은 식중독 사고를 일으키는 원인균인 살모넬라균을 대상으로 하여 수행하였다. 살모넬라균주는 생명공학연구원 유전자은행 KCTC(Korea Collection for Type Cultures, Korea)에서 분양받은 Salmonella typhimurium KCTC 12401(S.
데이터처리
- 간이 진단키트를 이용한 살모넬라균 검출한계는 살모넬라균이 접종되지 않은 시료로 측정한 기준신호의 3반복 측정값으로부터 표준편차를 구하고, 이 표준편차의 3배수를 기준신호 값에서 빼준 값보다 작은 밝기 신호값을 갖는 세균 농도로 정하였다.
이론/모형
- 0, The University of Texas, USA)을 이용하여 측정하였다. 밝기 측정은 검사선에서 가장 진한 색변화를 나타내는 부위에 대하여 일정면적의 폄균값을 구하는 방법으로 수행하였다.
- typhimurium)을 사용하였으며, 세균 군락을 Brain Heart Infusion(BHI)(Difco, USA) 배지에 계대 배양하여 이용하였다. 살모넬라 균수는 표준인산버퍼를 사용하여 단계적으로 희석 한 후 XLD4 agar(Difco, USA) 배지를 사용하여 표준평판법으로 측정하였다. 배양 시 조건은 액체배양의 경우 37℃에서 18～24시간 동안, 평판배양의 경우 37℃에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
- (1) 금입자와 항체의 최적 결합을 위한 반응 버퍼의 적절한 pH 값은 6.6인 것으로 조사되었다.
- (2) 시료패드와 결합패드에 실시한 2% BSA 및 10% 자당을 이용한 전처리는 살모넬라항체-금입자의 비선택적 반응을 방지하고 니트로셀룰로오스 막을 통한 이동 특성을 향상시키는 것으로 나타났다.
- (3) 표준인산버퍼에 대한 살모넬라균 검출 실험결과 간이진단키트를 이용하여 10분 이내에 시료의 살모넬라균을 검출할 수 있었으며, 검출한계는 106 cfu/mL였다.
- (4) 닭고기 시료에 대한 간이 진단키트의 살모넬라균 검출한계는 106 cfu/mL인 것으로 조사되었다.
- 닭고기 세척 버퍼를 이용한 간이 진단키트의 살모넬라균 검출 실험 결과도 살모넬라균의 농도 증가에 따라 시험선에 형성된 띠의 색이 짙어 졌으며, 살모넬라균의 농도가 108 cfu/mL일 때 가장 짙은 색을 나타내었다(Fig. 9). 닭고기 시료에 대한 진단키트의 살모넬라균 검출한계는 표준인산버퍼에서와 마찬가지인 106 cfu/mL였고 닭고기 세척 버퍼만의 기준신호와의 평균 밝기차이는 33이었다.
- 하지만 그림 6(B)의 영상에서 보듯이 전처리를 한 경우 대부분의 살모넬라항체-금입자 결합물이 시료와 함께 이동하여 니트로셀룰로오스 막 표면에 얼룩을 거의 남기지 않았다. 또한, 자당을 이용한 전처리를 하지 않았을 때 결합패드에 도포되었던 살모넬라항체-금입자 결합물이 모두 빠져나오지 못하고 주입했던 시료 용액이 다 흘러간 이후에도 많이 남아있었지만, 전처리를 한 경우 대부분의 살모넬라항체-금입자 결합물이 시료를 따라 흡수패드 쪽으로 이동한 것으로 나타났다.
- 화소의 평균 밝기는 256 단계로 표시했을 때 살모넬라균이 포함되지 않은 시료의 기준신호 209 ± 6에서 107 cfu/mL일 때 86 ± 38로 감소하였다. 밝기 정보 분석을 통하여 구해진 간이 진단키트의 살모넬라균 검출한계는 106 cfu/mL였고 기준신호와의 평균 밝기차이는 77이었다.
- 간이 진단키트 각 구성부에서의 시료 이동과 시약끼리의 반응을 향상시킬 목적으로 수행한 전처리 효과 비교 실험은 살모넬라균이 포함되지 않은 표준인산용액을 이용하여 수행하였다. 비선택적 반응을 최소화하기 위해 실시한 BSA 처리는 살모넬라항체-금입자 결합물이 살모넬라균 이외의 물질이나 키트 표면에 부착되는 것을 효과적으로 차단하는 것으로 나타났다. 그림 6(A)에서 보듯이 시료패드와 결합패드에 BSA 처리를 하지 않은 경우 시료가 흘러가는 도중에 살모넬라항체-금입자 결합물이 니트로셀룰로오스 막 표면 전체에 걸쳐 붉은색 얼룩을 남겼다.
- 6을 이용해 항체와 금입자를 결합하는데 사용하였다. 살모넬라균을 이용한 검출 실험에 앞서 pH 6.6 버퍼를 이용하여 결합시킨 바이오틴 부착 항체와 금입자 결합물을 결합패드에 포함시키고, 뉴트라아비딘으로 컨트롤선을 형성시킨 간이 진단키트를 이용한 사전 실험 결과 붉은색의 컨트롤선이 생성되어 간이 진단키트가 잘 동작하는 것을 확인할 수 있었다.
- 살모넬라균이 검출된 간이 진단키트의 영상분석 결과 그림 8과 같이 검출되는 살모넬라균의 농도가 높을수록 화소의 평균밝기가 감소하는 것으로 나타났다. 화소의 평균 밝기는 256 단계로 표시했을 때 살모넬라균이 포함되지 않은 시료의 기준신호 209 ± 6에서 107 cfu/mL일 때 86 ± 38로 감소하였다.
- 시료에 포함된 살모넬라균은 결합패드의 살모넬라항체-금입자와 반응하여 살모넬라균-항체-금입자의 결합물을 형성한 뒤 니트로셀룰로오스 막을 따라 이동하였다. 실험 결과 그림 7과 같이 살모넬라균의 농도 증가에 따라 시험선에 형성된 띠의 색이 짙어 졌으며, 살모넬라균의 농도가 107 cfu/mL일 때 가장 짙은 색을 나타내어 개발된 간이 진단키트가 효과적으로 살모넬라균을 검출하는 것으로 나타났다. 그림에서 컨트롤 시료에 대한 검사선의 약한 색변화는 검사선 항체의 수작업 도포와 항체의 비특이적 결합으로 인해 발생한 것으로 보인다.
- Martín-Hernández 등(2009)은 가짜 치즈에 들어가는 응유효소 유청을 신속하게 검사할 수 있는 측방유동 간이 진단키트를 개발하였다. 연구결과 측방유동 간이 진단키트를 이용하여 4% 이상의 응유효소 유청이 들어있는 우유를 정확하게 판정할 수 있었고, 이 결과는 기존검사 방법인 고성능액체크로마토그래피를 이용한 결과와 유사하였다.
- 농식품 분야에서는 Hossain 등(2009)이 우유나 사과 주스 등의 식품에 들어있는 잔류농약을 검사할 수 있는 간이 진단키트를 개발한 바 있다. 연구자들은 양방향 사용이 가능한 측방유동 센서를 이용하여 말라티온과 파라옥손 같은 잔류농약을 5분 이내에 각각 10 nM과 1 nM의 높은 감도로 검출할 수 있었다. Martín-Hernández 등(2009)은 가짜 치즈에 들어가는 응유효소 유청을 신속하게 검사할 수 있는 측방유동 간이 진단키트를 개발하였다.
- 준비된 시료 100 μL를 간이 진단키트의 시료패드에 주입하였을 때 시료용액은 모세관 현상에 의해 결합패드로 이동하는 것이 관찰되었다.
- 보라색으로 변색된 항체-금입자 혼합용액은 항체의 등전점에서 금입자 끼리의 교차결합을 유도하여 서로 응집됨으로써 살모넬라균과 반응할 수 없게 되어 면역분석에 사용하기에 부적합하였다. 최적 pH값 선정 실험에서 육안으로 혼합용액의 색 변화를 관찰한 결과 pH 5.4, 6.6, 7.3 세 가지 용액에서는 색 변화가 일어나지 않고 응집현상도 없었지만, pH값 7.8, 8.2, 8.4, 8.8, 9.2, 9.6, 10.1 용액에서는 그림 5의 pH 9.2 용액에서처럼 금입자가 응집하여 짙은색으로 변했다.
- 반응을 마친 시료용액은 니트로셀룰로오스 막을 따라 흡수패드 쪽으로 이동하여 흡수패드에 저장되었다. 컨트롤선에 생성된 붉은색 띠를 통해 간이 진단키트가 제대로 동작하는 것을 확인할 수 있었으며, 검사선에 생성된 붉은색 띠를 통하여 살모넬라균 검출이 가능함을 확인하였다.
- 식중독균의 검출 여부 표시를 위한 금입자와 항체의 결합은 버퍼의 pH 값에 크게 영향을 받기 때문에, 금입자와 항체의 최적 결합을 위해 반응 버퍼의 적절한 pH 값을 실험을 통해 구명하였다. 항체-금입자 결합을 위한 최적 pH 선정을 위한 실험 결과는 그림 5와 같이 결합 단계에서 금입자가 항체와 정상적으로 결합할 경우 혼합용액의 색변화가 없었으나, 항체의 농도가 적어 불완전 결합한 금입자는 응집되어 처음의 붉은색에서 짙은 보라색 또는 검은색으로 변하였다. 보라색으로 변색된 항체-금입자 혼합용액은 항체의 등전점에서 금입자 끼리의 교차결합을 유도하여 서로 응집됨으로써 살모넬라균과 반응할 수 없게 되어 면역분석에 사용하기에 부적합하였다.
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