본 연구에서는 새로운 제형 클로렐라제품의 정확한 총 엽록소 정량시험법을 마련하기 위해 새로운 제형 중 Syrup과 Candy 두 가지 제형의 제품을 마련하여 현행 공전방법을 적용한 함량 비교시험을 하였고 보다 정확한 결과 값을 나타낸 제1법인 pyridine 추출법의 전 처리방법을 개선하기 위하여 alkari성 pyridine으로 시료에서 엽록소를 추출하기 위하여 30분간 방치하고, 15분간 가온 할 때 초음파 처리를 병행하는 방법을 개발하여 그 결과 값의 정확성, 정밀성을 검토하였고 또 matrix sparking에 의한 정밀성과 재현성을 검토하였다. 그 결과 액상제품의 경우 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV는 18.82와 40.00, 이론치에 대한 결과 값이 106.3%와 78.1%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전 처리를 추가한 결과는 $27.2{\pm}5.12\;mg$/100 g와 $25.0{\pm}2.84\;mg$/100 g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV도 18.82에서 11.36으로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 106.3%와 97.7%로 pyridin-초음파 추출방법이 보다 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 측정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율이 모두 향상된 결과를 나타내었다. 고형제품의 경우도 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV는 7.05와 30.00, 이론치에 대한 결과 값이 62.7%와 40%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전처리를 추가한 결과는 $62.7{\pm}4.42\;mg$/100 g와 $99.4{\pm}4.06\;mg$/100 g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV값도 7.05에서 4.08로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 62.7%에서 99.4%로 pyridin-초음파 추출법이 명확하게 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 측정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율 모두 향상된 결괴를 나타내었다.
본 연구에서는 새로운 제형 클로렐라제품의 정확한 총 엽록소 정량시험법을 마련하기 위해 새로운 제형 중 Syrup과 Candy 두 가지 제형의 제품을 마련하여 현행 공전방법을 적용한 함량 비교시험을 하였고 보다 정확한 결과 값을 나타낸 제1법인 pyridine 추출법의 전 처리방법을 개선하기 위하여 alkari성 pyridine으로 시료에서 엽록소를 추출하기 위하여 30분간 방치하고, 15분간 가온 할 때 초음파 처리를 병행하는 방법을 개발하여 그 결과 값의 정확성, 정밀성을 검토하였고 또 matrix sparking에 의한 정밀성과 재현성을 검토하였다. 그 결과 액상제품의 경우 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV는 18.82와 40.00, 이론치에 대한 결과 값이 106.3%와 78.1%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전 처리를 추가한 결과는 $27.2{\pm}5.12\;mg$/100 g와 $25.0{\pm}2.84\;mg$/100 g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV도 18.82에서 11.36으로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 106.3%와 97.7%로 pyridin-초음파 추출방법이 보다 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 측정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율이 모두 향상된 결과를 나타내었다. 고형제품의 경우도 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV는 7.05와 30.00, 이론치에 대한 결과 값이 62.7%와 40%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전처리를 추가한 결과는 $62.7{\pm}4.42\;mg$/100 g와 $99.4{\pm}4.06\;mg$/100 g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV값도 7.05에서 4.08로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 62.7%에서 99.4%로 pyridin-초음파 추출법이 명확하게 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 측정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율 모두 향상된 결괴를 나타내었다.
A new and improved analytical method involving alkaline pyridine extraction was proposed to quantity chlorophyll contents in syrup and candy type chlorella products. The performance of analytical method was compared with the conventional Korea food standard method which involves acetone extraction. ...
A new and improved analytical method involving alkaline pyridine extraction was proposed to quantity chlorophyll contents in syrup and candy type chlorella products. The performance of analytical method was compared with the conventional Korea food standard method which involves acetone extraction. The application of sonication chlorophyll extraction form alkaline pyridine sample was also explored. The analytical procedure was validated by evaluating accuracy, precision and reproducibility. For liquid samples, the pyridine extraction method showed higher accuracy and precision compared to acetone extraction method. The CV values of pyridine extract method and the acetone extraction method were 18.82 and 40.0, and the accuracy to theoretical values were 106.3% and 78.1%, respectively. When sonication extraction method was applied to the pyridine extraction, the precision was improved as indicated by reduced CV values from 18.82 to 11.36. The improved performance of pyridine-sonication extraction was also validated by recovery test of chlorophyll that was previously spiked into the sample matrix. For solid matrix, the pyridine extraction method showed better performance in analysis of chlorophyll in solid food matrix (CV = 7.05) compared to conventional acetone extraction method (CV = 30.0). However, the accuracy to theoretical values of pyridine and acetone extraction methods only showed only 62.7% an 40%, respectively. The relatively low accuracy of pyridine extraction method (62.7%) was improved to 99.4% by applying additional sonication extraction method. The improved performance of applying additional sonication extraction was validated by standard deviation, CV values and accuracy to theoretical values.
A new and improved analytical method involving alkaline pyridine extraction was proposed to quantity chlorophyll contents in syrup and candy type chlorella products. The performance of analytical method was compared with the conventional Korea food standard method which involves acetone extraction. The application of sonication chlorophyll extraction form alkaline pyridine sample was also explored. The analytical procedure was validated by evaluating accuracy, precision and reproducibility. For liquid samples, the pyridine extraction method showed higher accuracy and precision compared to acetone extraction method. The CV values of pyridine extract method and the acetone extraction method were 18.82 and 40.0, and the accuracy to theoretical values were 106.3% and 78.1%, respectively. When sonication extraction method was applied to the pyridine extraction, the precision was improved as indicated by reduced CV values from 18.82 to 11.36. The improved performance of pyridine-sonication extraction was also validated by recovery test of chlorophyll that was previously spiked into the sample matrix. For solid matrix, the pyridine extraction method showed better performance in analysis of chlorophyll in solid food matrix (CV = 7.05) compared to conventional acetone extraction method (CV = 30.0). However, the accuracy to theoretical values of pyridine and acetone extraction methods only showed only 62.7% an 40%, respectively. The relatively low accuracy of pyridine extraction method (62.7%) was improved to 99.4% by applying additional sonication extraction method. The improved performance of applying additional sonication extraction was validated by standard deviation, CV values and accuracy to theoretical values.
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문제 정의
기존에 허가되어 있던 정제 등 6가지 제형은 현재의 공전 시험법을 적용하여 정확한 분석이 가능하므로 본 연구에서는 법 개정으로 새로 확장된 시럽 등 6가지 제형에 대한 적용을 목표로 하여 연구를 진행하여 시료 전 처리 방법을 개선한 시험방법을 제안하였다. 추가로 확장된 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리와 바 6가지 제형을 형상에 따라 대별하면 편상, 젤리와 바 3종은 chewable 고형상으로 페이스트상, 시럽과 겔 3종은 액상으로 분류되어 지므로 본 연구에서 제안한 시험방법을 전부 적용할 수 있고, 기존의 6 가지 제형에서도 시료에서의 엽록소추출 효율성을 높이기 위하여 본 연구에서 제안한 초음파 처리를 병행하면 전체시험 시간이 유의적으로 단축될 것으로 기대된다.
본 연구에서는 새로운 제형 클로렐라제품의 정확한 총 엽록소 정량시험법을 마련하기 위해 새로운 제형 중 Syrup과 Candy 두 가지 제형의 제품을 마련하여 현행 공전 방법을 적용한 함량 비교시험을 하였고 보다 정확한 결과 값을 나타낸 제 1법인 pyridine 추출법의 전 처리방법을 개선하기 위하여 alkari성 pyridine으로 시료에서 엽록소를 추출하기 위하여 30분간 방치하고, 15분간 가온 할 때 초음파 처리를 병행하는 방법을 개발하여 그 결과 값의 정확성, 정밀성을 검토하였고 또 matrix sparking에 의한 정밀성과 재현성을 검토하였다. 그 결과 액상제품의 경우 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CVe 18.
정밀성을 보장하기 위하여 엽록소 추출 전 처리 시에 초음파처리를 병행하여, UV spectrophotometer로 엽록소를 분석하는 비교실험을 하였다. 이를 통하여 기존의 공전 시험법을 보다 정확하고 이용이 편리한 시험법으로 개정할 필요성이 있는지를 보고, 건강기능식품공전 시험법을 이용하여 새로 개발한 신 제형 제품의 기능.지표 성분을 시험하고자 하는 사람들이 정확한 시험방법을 적용할 수 있도록 제형확대에 따른 시험법 검토를 하고자 하였다.
이를 통하여 기존의 공전 시험법을 보다 정확하고 이용이 편리한 시험법으로 개정할 필요성이 있는지를 보고, 건강기능식품공전 시험법을 이용하여 새로 개발한 신 제형 제품의 기능.지표 성분을 시험하고자 하는 사람들이 정확한 시험방법을 적용할 수 있도록 제형확대에 따른 시험법 검토를 하고자 하였다.
제안 방법
건강기능식품공전 시험방법인 총 엽록소시험법 제1 법과 제2 법을 사용한 예비실험의 결과를 통하여 저)1법인 pyridin 추출법을 적용하기로 하였고 시료채취 시 액상제품은 homogenize하였고 고형제품은 냉동 후 고속분쇄하여 즉시 계량하였다. 두 가지 제형 모두 시료방치 및 추출 시에 초음파 처리를 하였고 matrix spiking 법으로 회수율을 측정하여 개선한 추출방법의 정확성을 검증하였다.
두 가지 제형 모두 시료방치 및 추출 시에 초음파 처리를 하였고 matrix spiking 법으로 회수율을 측정하여 개선한 추출방법의 정확성을 검증하였다. 또한 본 연구에서는 모든 시험을 3가지 lot별로 한 검체씩 취하였고, 한검체당 3회 시험을 반복하여 데이터의 정확성 검증을 하였다
본 연구에서는 새로운 제형에 적합한 시험방법을 찾기 위하여 건강기능식품공전 총 엽록소시험법 제1법과 제2 법을 적용하여 두 가지 제형 제품의 함량측정 실험을 하였고 그 결과 값의 분포도는 Fig. 1, 2, 3, 4와 같다. 액상제품은 pyridine 추출법의 평균값이 #, acetone 추출법의 평균값은 20±8 mg/100g이고 고형제품은 pyridine 추출법의 평균값이 62.
본 연구에서는 제형자율화 시행 이후 개발이 예상되는 syrup 제형 클로렐라 음료와 고형(chewable)제형 클로렐라 candy에 공전 제1법과 제2법을 적용하여 총 엽록소 함량 정량 비교실험을 하여 결과 값의 정확성이 높은 저 법을 새로운 제형에 적합한 시험방법으로 채택하였고, 신 제형 제품의 원료조성 matrix 차이에 따른 엽록소 추출의 정확성과 정밀성을 보장하기 위하여 엽록소 추출 전 처리 시에 초음파처리를 병행하여, UV spectrophotometer로 엽록소를 분석하는 비교실험을 하였다. 이를 통하여 기존의 공전 시험법을 보다 정확하고 이용이 편리한 시험법으로 개정할 필요성이 있는지를 보고, 건강기능식품공전 시험법을 이용하여 새로 개발한 신 제형 제품의 기능.
그러나 두 방법 간 차이에도 불구하고 고형제품의 경우 pyridine 추출법의 결과도 이론치와는 상당한 차이를 나타내고 있는 바 이는 액상 제품에 비해서 matrix가 훨씬 복잡하고 제형유지를 위하여 첨가한 결착제인 xantan gum 둥의 방해를 받아서 인 것으로 보인다. 위의 결과와 같이 비교적 함량이론치에 가까운 결과값을 나타낸 제1법을 본연구의 실험방법으로 선정하여 연구를 진행하였다.
대상 데이터
Syrup 제형 클로렐라 pauch 제품과 고형 제형 클로렐라 Chewable candy 제품은 관련 전문 업체의 협조를 얻어 업체에서 개발 중인 제품과 외부 협력업체에 의뢰하여 개발 중인 시제품을 시료로 사용하였다. 제작에 사용한 클로렐라 원말의 엽록소 함량은 25 mg/g이었고 최종 제품의 총 엽록소 함량은 음료의 경우 20mg/g 캔디는 100mg/g 이었다.
(Optizen 32200V0) 를 이용하였고, 표준물질 및 시 약은 Pyridine (GR grade), Sodium Hydroxide (GR grade), Dist. Water (HPLC grade)를사용하였다.
시제품을 시료로 사용하였다. 제작에 사용한 클로렐라 원말의 엽록소 함량은 25 mg/g이었고 최종 제품의 총 엽록소 함량은 음료의 경우 20mg/g 캔디는 100mg/g 이었다.
성능/효과
7% 와 40%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 주줄법에 조음파 전처리를 주가한 결과는 62.7 ± 4.42 mg/ 100 g와 99.4 ±4.06 mg/100 g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV값도 7.05에서 4.08로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 62.
1%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전 처리를 추가한 결과는 27.2 ±5.12 mg/100 g와 25.0 ±2.84 mg/100 g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV도 18.82에서 11.36으로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 106.
7%와 40%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전처리를 주가한 결과는 62.7 ± 4.42 mg/100 g와 99.4 ± 4.06mg/100g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV값도 7.05에서 4.08로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 62.
Pyridine 추출 시험법의 데이터 정밀성을 높이기 위하여 30분간의 시료 방치시간과 15분간의 가온 시간에 초음파처리를 하여 추출 수율을 향상시킨 결과 액상제품은 평균값이 25.0 ± 2.84 mg/lOOg 고형제품은 99.4 ± 4.06 mg/100 g 로서 초음파 처리하지 않은 시료 각각의 결과값 27.2±5.12 mg/100 g, 62.7 ±4.42 mg/100 g보다 표준편차의 분포가 줄어들었고 이론치에 더 가까운 정밀한 결과 값을 얻을 수 있었다(Fig. 5,6). 또 고형제품의 경우 시료계량 시 취급의 용이와 시료가 엉겨 붙는 것을 방지하기위하여 냉동하여 분쇄를 하게 되는데 정치하여 방치하거나 가온추출 시 역시 시료가 엉겨 붙어서 엽록소 추출의 효율성이 저하되었으나 초음파처리를 함으로서 이를 방지 할 수 있었다.
1%로 샹당한 차이를 보였다. Pyridm 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전 처리를 추가한 결과는 27.2 ±5.12 mg/100 g와 25.0 ±2.84 mg/100 g로 표준편차가 상당히 줄어들었고 CV도 18.82에서 11.36으로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 106.
또 고형제품의 경우도 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV는 7.05와 30.00, 이론치에 대한 결과 값이 62.7% 와 40%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 주줄법에 조음파 전처리를 주가한 결과는 62.
그 결과 액상제품의 경우 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CVe 18.82와 40.00, 이론치에 대한 결과 값이 106.3%와 78.1%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전 처리를 추가한 결과는 27.
두 가지 제형 모두 시료방치 및 추출 시에 초음파 처리를 하였고 matrix spiking 법으로 회수율을 측정하여 개선한 추출방법의 정확성을 검증하였다. 또한 본 연구에서는 모든 시험을 3가지 lot별로 한 검체씩 취하였고, 한검체당 3회 시험을 반복하여 데이터의 정확성 검증을 하였다
또 고형제품의 경우도 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV는 7.05와 30.00, 이론치에 대한 결과 값이 62.7% 와 40%로 상당한 차이를 보였다. Pyridin 추출법과 pyridin 주줄법에 조음파 전처리를 주가한 결과는 62.
본 연구에서 검토한 4가지 시험법의 결과 값을 비교해 보면 액상제품의 경우 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV (Coefficience Vhliation)는 18.82와 40.00, 이론치에 대한 결과 값이 106.3%와 78.1%로 샹당한 차이를 보였다. Pyridm 추출법과 pyridin 추출법에 초음파 전 처리를 추가한 결과는 27.
20mg/ 100 g 로서 상당히 근접한 값을 보였다. 분포도 또한 거의 직선에 가까운 모양을 보여 주었고 회수율은 각각 100.6%, 99.8%로서 데이터의 신뢰성을 높일 수 있었다(Fig 7,8)
1, 2, 3, 4와 같다. 액상제품은 pyridine 추출법의 평균값이 #, acetone 추출법의 평균값은 20±8 mg/100g이고 고형제품은 pyridine 추출법의 평균값이 62.7 ±4.42 mg/100 g, acetone 추출법의 평균값은 40±12 mg/100 g이어서 두 가지 제형 모두에서 pyridine 추출법이 보다 신뢰 할 수준이었다. 배합비율에 의한 시료의 함량 이론치가 각기 25.
36으로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 106.3%와 97.7%로 pyHdin-초음파 추출방법이 보다 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 즉정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율이 모두 향상된 결과를 나타내었다. 고형제품의 경우도 pyridin 추출법과 acetone 추출법의 결과 값 CV는 7.
36으로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 106.3%와 97.7%로 pyridin-초음파 추출방법이 보다 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 측정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율이 모두 향상된 결과를 나타내었다(Table 1).
08로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 62.7%에서 99.4%로 pyridin-초음파 추출법이 명확하게 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 측정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율 모두 향상된 결과를 나타내었다. 앞에서 언급한 시료 분쇄시의 문제도 초음파처리를 함으로서 완전히 개선된 것으로 확인되었다(Table 2).
08로 상당히 줄어들었다. 이론치 대비율도 62.7%에서 99.4%로 pyridin-초음파 추출법이 명확하게 이론치에 근접한 것으로 나타났으며 회수율 측정을 하기 위하여 pyridin-초음파 추출법에 matrix spiking 한 결과도 표준편차, CV값과 이론치 대비율 모두 향상된 결과를 나타내었다. 앞에서 언급한 시료 분쇄시의 문제도 초음파처리를 함으로서 완전히 개선된 것으로 확인되었다(Table 2).
초음파 처리가 목적하는 총 엽록소의 추출에 주는 영향을 검토하고 개선된 시험방법의 재현성, 정확성을 검증하기 위하여 matrix spiking 방법으로 회수율을 측정하였고 액상 제품은 회수율 측정하기 위해 제조한 시료의 함량 이론치는 30.6mg/100g 이고 3회 반복 시험한 평균값은 30.8± 1.25 mg/100 g 이었고 고형제품은 시료의 함량 이론치는 124 mg/100g 이고 3회 반복 시험한 평균값은 123.7±2.20mg/ 100 g 로서 상당히 근접한 값을 보였다. 분포도 또한 거의 직선에 가까운 모양을 보여 주었고 회수율은 각각 100.
후속연구
2011년 1월 현재 시중에서 판매되고 있는 클로렐라 제품을 제형별로 살펴보면 Table3에서처럼 전체 78가지 중 정제가 66가지로 85%를 차지하며 분말 5가지 과립 3가지 등 6가지 제형이 시판되고 있고, 제형자율화 이후인 2008년 8 월 이후 허가된 제형도 유사한 경향을 보이지만 경질캡슐 2가지 환 1가지 외에 본 연구의 시험대상이었던 시럽 제형 1가지를 포함하여 4가지 제형이 새로 허가 받았지만 신 제형은 시럽 1가지 제형뿐으로 클로렐라 제품은 원료의 물성 때문에 제품개발에 한계를 보이고 있다.
소비자가 건강기능식품을 섭취하고 기대하는 효과를 얻기 위해서는 제조가공유통 과정에서의 품질관리가 매우 중요하다. 새로운 제형의 기능성을 인정하기 위해서는 객관적인 기능성의 평가가 필요하므로 기능성과 관련된 기능 성분의 함량 시험법이 정립되어야 할 것이다. 최근 국제적인 식품 시험법에 대한 연구는 실용분야와 실질 분야로 분류되어 개발되고 있는 추세이다.
시험방법을 제안하였다. 추가로 확장된 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리와 바 6가지 제형을 형상에 따라 대별하면 편상, 젤리와 바 3종은 chewable 고형상으로 페이스트상, 시럽과 겔 3종은 액상으로 분류되어 지므로 본 연구에서 제안한 시험방법을 전부 적용할 수 있고, 기존의 6 가지 제형에서도 시료에서의 엽록소추출 효율성을 높이기 위하여 본 연구에서 제안한 초음파 처리를 병행하면 전체시험 시간이 유의적으로 단축될 것으로 기대된다.
참고문헌 (9)
건강기능식품공전, 식품의약품안전청(2009).
Chlorophyll in Plants: Photoelectric colorimetric method for total chlorophyll only, A.O.A.C. Official Method 940.03 (2000).
Robert J. Porra,:The assay of chlorophylls a and b convertied to their respective Mg- rhodochlorin derivatives by extraction from recalcitrante algal cells with aqeous alkaline methanol prevention of allomerization with reductants, Biochem. Biophys. Acta, 1015, 493-502 (1990).
Manuel Zapata et al.: Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography of algal chlorophylls, J. Chromatogr. A, 738, 285-289 (1966).
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Beatriz Gandul-Rojas et al.: Chlorophyll and Carotenoid Patterns in Olive Fruits Olea europaeaCv.Arbequina, J. Agric. Food Chem., 47, 2207-2212 (1999).
Yasuyo Suzuki and Yuzo Shioi: Identification of Chlorophyll and Carotenoids in Mazor Teas by HPLC with PAD, J. Agric. Food Chem., 51, 5307-5314 (2003).
Emel Ergun et al.: Stimultaneous determination of chlorophyll a and chlorophyll b by derivative spectrophotometry, Anal. Bioanal. Chem., 379, 803-811 (2004).
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