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문제 정의
- 본 연구에서는 수소 이온 펌프 역할 기능을 가지는 PR과 신호전달기능을 하는 ASR을 이용하여, 각 단백질을 다양한 측정 방법으로 환경조건에 따른 그 특성의 차이점을 알아보려 한다.
제안 방법
- PR과 ASR 측정샘플은 pH 9.0에 녹아 있는 상태로 Shimadzu UV-visible spectrophotometer (UV-2550)을 사용하여 흡수스펙트럼을 측정했다. 광-감응 차이스펙트럼은 SCINCO 및 RSM 1000 (Olis, USA)에 의해서 측정되었다.
- 각 PR과 ASR의 각 intermediate의 포토사이클 효율(rate) 을 계산하기 위해서 레이저 감응 포토사이클을 측정하였다 (Fig. 4). PR 막의 경우 ground formation의 half time이 39 ms로 O decay의 half time 36 ms와 비슷하게 나타났다(Table 1).
- 각 단백질이 막에 끼어 있는 상태(membrane state), polyacrylamide gel에 고정되어 있는 상태, nonionic detergent 일종인 DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside)과, OG (octylβ-D-glucopyranoside)에 녹아 있는 상태, 좀더 자연상태와 유사한 환경을 위해 단백질만 깨끗하게 정제한 다음 다시 Escherichia coli의 지질인 DOPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero3-phosphocholine)에 재조립한 상태, 이렇게 5가지 조건에서 각각의 광화학/생물리학 특징을 흡수스펙트럼(absorption spectrum), 빛-어둠 차이 흡수스펙트럼(light-induced difference spectrum), 포토사이클(photocycle)을 측정하였다.
- 단백질 발현을 위해서, β-carotene을 합성할 수 있는 pORANGE를 E. coli UT5600에 형질전환하여 E. coli strain β/UT를 구축했다.
- 5로 알려져 있다. 따라서, PR의 acceptor 기능을 하는 Asp97이 deprotonated form을 유지해서 PR이 좀 더 효율적인 M-, O-like intermediate을 형성 할 수 있도록 pH 9.0에서 광감응 차흡수를 측정했다. MEM과 GEL, 그리고 REC에서는 최대 흡수 파장인 약 530 nm에서 G (ground state)를 보였고, 약 410 nm에서 M-intermediate, 약 600 nm에서 O-intermediate을 보였다.
- 막 분획에 최종농도를 1%가 되게끔 n-dodecylβ-D-maltopyranoside (DDM)과 octyl-β-D-glucopyranoside (OG)를 첨가해서, 4℃에서 두 시간 이상 두어 막 단백질을 가용화시켰다.
- 본 연구에서는 PR과 ASR이 과발현 된 막분획 상태, PR과 ASR이 과발현 된 light membrane을 polyacrylamide-gel로 고정시킨 상태, 각 로돕신을 정제하여 DDM에 녹인 상태, OG 에 녹인 상태, 정제된 각 단백질을 E. coli lipid인 DOPC로 재조립한 상태로 준비해서 흡수 스펙트럼, 광감응 차스펙트럼, 레이저 감응 포토사이클을 측정했다.
- 둘째, 한 오페론에서 14 kDa 전달자와 같이 발현되면서 신호 전달 기능을 하는 Anabaena sensory rhodopsin (ASR)이 있다. 이에 본 연구에서는 이 두 미생물 로돕신을 이용하여 다양한 조건에서 그 차이를 살펴보았다. 각 단백질이 막에 끼어 있는 상태(membrane state), polyacrylamide gel에 고정되어 있는 상태, nonionic detergent 일종인 DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside)과, OG (octylβ-D-glucopyranoside)에 녹아 있는 상태, 좀더 자연상태와 유사한 환경을 위해 단백질만 깨끗하게 정제한 다음 다시 Escherichia coli의 지질인 DOPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero3-phosphocholine)에 재조립한 상태, 이렇게 5가지 조건에서 각각의 광화학/생물리학 특징을 흡수스펙트럼(absorption spectrum), 빛-어둠 차이 흡수스펙트럼(light-induced difference spectrum), 포토사이클(photocycle)을 측정하였다.
- 클로닝을 위해서, 각 PR과 ASR 유전자를 pKJ900 vector에 NdeI/NotI 제한 효소를 이용했고 T4-DNA ligase를 이용해서 라이게이션(ligation)을 해서 E. coli DH5α에 형질전환 (transformation)을 한 다음, 50 μg/ml의 농도로 앰피실린이 녹아 있는 LB (Luria-Bertani)-broth에 접종을 하고, 35℃로 조정된 배양기에서 세포 배양했다.
대상 데이터
- 광-감응 차이스펙트럼은 SCINCO 및 RSM 1000 (Olis, USA)에 의해서 측정되었다. 화학 섬광은 Nd-YAG pulse laser (Continuum, MinilightII, 532 nm, 6 ns, 25 mJ)를 통해 이용되었다. Photointermediate의 생성 및 소멸율은 16번씩 재어서 평균값으로 나타냈다.
성능/효과
- 0에서 광감응 차흡수를 측정했다. MEM과 GEL, 그리고 REC에서는 최대 흡수 파장인 약 530 nm에서 G (ground state)를 보였고, 약 410 nm에서 M-intermediate, 약 600 nm에서 O-intermediate을 보였다. 전체적으로 ΔOD=0.
- PR과 ASR 모두 DDM에서 깨끗하고 명확한 광감응 차스펙트럼을 얻을 수 있는 것을 확인 할 수 있다.
- DDM과 OG에서는 약 10 nm가 blue shift 된 543 nm에서 최대 흡수 파장을 가진 반면, REC 조건에서는 약 24 nm가 blue shift 된 529 nm에서 최대 흡수 파장을 가진다(Table 1). 같은 단백질이지만 샘플 조건에 따라서 chromophore와 단백질간의 상호작용 정도가 달라져서 최대 흡수 파장에 차이가 있다는 것을 확인했다.
- 각 단백질이 막에 끼어 있는 상태(membrane state), polyacrylamide gel에 고정되어 있는 상태, nonionic detergent 일종인 DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside)과, OG (octylβ-D-glucopyranoside)에 녹아 있는 상태, 좀더 자연상태와 유사한 환경을 위해 단백질만 깨끗하게 정제한 다음 다시 Escherichia coli의 지질인 DOPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero3-phosphocholine)에 재조립한 상태, 이렇게 5가지 조건에서 각각의 광화학/생물리학 특징을 흡수스펙트럼(absorption spectrum), 빛-어둠 차이 흡수스펙트럼(light-induced difference spectrum), 포토사이클(photocycle)을 측정하였다. 그 결과 DDM에 녹아 있는 PR과 ASR에서 각 다른 파장에서 M과 O state와 같은 선명한 photointermediate를 가지고, 가장 signal/noise 비율이 좋았다. 본 연구를 통해 막단백질의 다양한 측정 환경에 대한 그 특성의 차이점을 살펴봄으로써 앞으로 다양한 종류의 로돕신 연구에 기초 기반이 될 것으로 사료 된다.
- ASR G (ground) formation half time은 GEL, DDM, OG, REC 모두 비슷한 약 40 ms이다. 그리고 MEM, DDM, OG에서 비슷한 속도(약 38 ms)의 M-intermediate을 측정할 수 있었는데, 이는 PR의 M-intermediate의 decay 속도 보다 약 40배가 느리다는 것을 확인 할 수 있다. 반면, 모든 ASR 환경 조건을 pH 9.
- 두 로돕신 모두 MEM, GEL, REC 환경과 DDM, OG 환경에 따라 광화학/생물리학적 성질이 바뀌는 것을 확인 할 수 있었다. 최대 흡수 파장의 경우, 자연 상태와 가장 비슷한 조건인 MEM, GEL, REC 환경에서는 두 단백질 모두 좀 더 안정한 상태인 blue shift 형태로 존재 했고, detergent에 용해시킨 DDM, OG에서는 조금 불안정한 상태인 red shift 형태로 존재했다.
- ASR의 경우, 센서 (sensory) 로돕신이기 때문에 수소 이온을 펌핑하는 로돕신보다 상대적으로 느린 포토사이클을 지닌다. 따라서, 빠른 포토 사이클을 가지고 있는 PR에서는 측정하기 어려운 M-intermediate (약 390 nm)가 DDM과 OG에 녹아 있는 ASR에서는 아주 높게 형성되는 것을 확인할 수 있다. M-intermediate 형태의 로돕신이 많은 비율(ΔOD=0.
후속연구
- PR DDM의 경우 gel보다 약 4배 빠른 포토사이클 시그널을 얻을 수 있었다. 만약 다른 종에서 얻은 수소 이온 로돕신을 정제해서 DDM 상태에서 포토사이클을 측정했지만, gel 상태에서는 얻을 수 없었다면, PR의 것과 비교해서 gel 상태의 포토사이클 속도를 예상할 수 있을 것이다.
- 그 결과 DDM에 녹아 있는 PR과 ASR에서 각 다른 파장에서 M과 O state와 같은 선명한 photointermediate를 가지고, 가장 signal/noise 비율이 좋았다. 본 연구를 통해 막단백질의 다양한 측정 환경에 대한 그 특성의 차이점을 살펴봄으로써 앞으로 다양한 종류의 로돕신 연구에 기초 기반이 될 것으로 사료 된다.
- 따라서, 여러 종 생물에서 로돕신 유전자를 분리 및 클로닝 할 수 있다. 이를 통해 얻은 다양한 로돕신의 성질을 규명하는데 있어, 본 연구에서 얻은 결과가 좋은 표준 참고 자료 역할을 할 것이라 생각된다.
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