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제안 방법
- ISO-DALT system(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA)에buffer를 채우고 gel당 10–15 mA로 12시간 정도 전기영동을 실시하였다.
- SDS-PAGE가 끝난 gel을 분리하여 증류수에 넣었다가, 물기를 제거한 다음 고정용액에 1시간가량 두었다. 고정용액을 제거한 다음 Coomassie blue 염색액을 넣고 24시간 이상 염색한 다음 scanner를 이용하여 gel image의 scan을 실시하였다. 얻어진 image는 ImageMaster 5.
- 뇌단백질 용액을 1 mg이 되도록 준비하여, 2% IPG로 처리하여 modify buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 2.5% DTT, 10% isopropanol, 5% glycerol, 2% v/v IPG buffer; pH 3–10)로 총 450 ㎕가 되도록 조절하였다(Görg 등, 2000).
- 충남대학교 실험 동물 사육장에서 생후 7~8주되는 ICR 암컷 생쥐에 5 IU의 PMSG를 주사한 다음 48시간 후에 5 IU의 HCG를 주사하여 배란유도 처리를 한 다음 성숙 수컷 생쥐와 합사하였다. 다음날 아침 플러그를 체크하여 교배 여부를 확인하여 플러그가 있는 마우스를 따로 분리하여 관리하며 교배 후 15.5일과 19.5일에 마우스 태아뇌조직을 적출하였다(Fig. 1). 채취된 생쥐 태아 뇌조직을 SDS sample buffer로 조직 1 mg당 1 ul로 부유시키고, 1 mM PMSF와 1x protease inhibitor를 첨가한 후 조직을 초음파 분쇄를 실시하였다.
- 따라서 본 연구에서는 태아 신경계의 발육메커니즘을 단백질 수준에서 이해하기 위해 생쥐 임신중기인 15.5일과 후기인 19.5일의 태아 뇌조직을 이용하여 2차원 전기영동과 MALDI-TOF 실험을 수행하였다.
- 발현에 차이가 나는 spot들이 어떤 단백질인지를 판단하기 위하여 spot를 gel에서 도려내어 트립신으로 단백질을 처리하여 peptide상태로 만든 다음 MALDI-TOF/MS를 실시하였고, DataExplorerTM 소프트웨어로 peptide masses 데이터를 수집하여 검색소프트웨어 ProFound (http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe)에서 후 보단백질을 검색하였다. 15개 spot에서 11개가 SWISS-PROT와 NCBI database에서 검색되었으며 동정된 단백질은 Table 1에 보여주고 있다.
- IPG strip을 3차 증류수로 한번 씻은 후 물기를 잘 닦고 gel 부분이 위로 향하게 하고, strip 양쪽 끝 1 cm 정도에 IEF electrode strip을 3~4 cm로 잘라 물에 적신 후 물기를 제거한 것을 겹쳐 놓는다. 이후 oil로 덮은 다음 집게로 IEF electrode strip과 paper가 strip에 잘 붙도록 겹쳐진 부분을 살짝 눌러주고 50 V로 100분, 100V 100분, 300 V 100분, 600 V 100분, 1000 V 100분, 3000 V 100분, 5000V 100분 및 8000 V 100분으로 전기영동을 실시하였다.
- 1). 채취된 생쥐 태아 뇌조직을 SDS sample buffer로 조직 1 mg당 1 ul로 부유시키고, 1 mM PMSF와 1x protease inhibitor를 첨가한 후 조직을 초음파 분쇄를 실시하였다. 다음 희석용액을 원액의 7~8배를 넣어주고 실온에서 1시간 가량 정치하였고, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리를 실시하고 상층액을 수집하여 endonuclease를 150 unit을 넣고 실온에서 30분간 정치하였다.
- 충남대학교 실험 동물 사육장에서 생후 7~8주되는 ICR 암컷 생쥐에 5 IU의 PMSG를 주사한 다음 48시간 후에 5 IU의 HCG를 주사하여 배란유도 처리를 한 다음 성숙 수컷 생쥐와 합사하였다. 다음날 아침 플러그를 체크하여 교배 여부를 확인하여 플러그가 있는 마우스를 따로 분리하여 관리하며 교배 후 15.
대상 데이터
- 5 ㎕를 넣고 37℃에서 12~16시간 처리하였고, 나머지 solution을 제거한 후 5 ㎕의 Extraction Buffer를 넣고 수중초음파(Water Sonic)에서 38℃에서 30분~1시간 동안 sonication하여 trypsin에 의해 나온 peptide를 추출하였다(Shevchenko 등, 1996). 추출된 peptide용액은 MALDI-TOF를 실시하였는데 Mass spectrometric 분석은 Voyager-DE STR MALDI-TOF-MS(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA)를 이용하여 peptide mass fingerprinting sample 자료를 수집하였다. 펩타이드 자료는 DataExplorerTM 소프트웨어를 이용하여 peak 데이타를 수집하고 온라인 단백질서열 데이타베이스에서 검색하였다(SWISS-PROT and/or NCBI [2010/02/01, Data Bank]).
- 추출된 peptide용액은 MALDI-TOF를 실시하였는데 Mass spectrometric 분석은 Voyager-DE STR MALDI-TOF-MS(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA)를 이용하여 peptide mass fingerprinting sample 자료를 수집하였다. 펩타이드 자료는 DataExplorerTM 소프트웨어를 이용하여 peak 데이타를 수집하고 온라인 단백질서열 데이타베이스에서 검색하였다(SWISS-PROT and/or NCBI [2010/02/01, Data Bank]).
데이터처리
- 고정용액을 제거한 다음 Coomassie blue 염색액을 넣고 24시간 이상 염색한 다음 scanner를 이용하여 gel image의 scan을 실시하였다. 얻어진 image는 ImageMaster 5.0 소프트웨어를 이용하여 단백질의 발현차이를 이용하여 gel 중 각 spot에서 분석하였다.
- 총 뇌단백질들이 각자의 등전점과 분자량에 따라 spot로 분리되어 있는 것을 gel image에서 확인할 수 있었다. 이 image들을 ImageMaster 5.0소프트웨어를 이용하여 분석한 결과 각 gel에서 약 800~1000개의 spot들이 나타나는 것을 확인할 수 있었고 각 spot에 대해 통계분석을 실시하였으며 임신 15.5일과 19.5일된 뇌의 단백질 spot에 발현차이를 보이는 것들의 퍼센트 볼륨과 그들의 평균값은 Fig. 3에 표시하였다. 임신 15.
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