그람-양성균(Peptidoglycan)으로 유도한 대식세포에서 감태 에탄올 추출물의 항염증 효과 Anti-inflammatory effect of ethanol extract from Ecklomia cava on gram-positive bacteria(Peptidoglycan)-induced macrophages원문보기
Objectives : Ecklonia cava is brown alga(Laminariaceae) which grows is sea, it has antioxidant, diarrhea and anticoagulant effect. In this study, the effect of ethanol extract of Ecklonia cava (EC) on peptidoglycan(PGN) -induced NO production in RAW 264.7 cells was investigated. Methods : In the pre...
Objectives : Ecklonia cava is brown alga(Laminariaceae) which grows is sea, it has antioxidant, diarrhea and anticoagulant effect. In this study, the effect of ethanol extract of Ecklonia cava (EC) on peptidoglycan(PGN) -induced NO production in RAW 264.7 cells was investigated. Methods : In the present study, IL-6 production was measured using the enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), prostaglandin $\E_2$($\PGE_2$) production was measured using the EIA kit, and inducible NO synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), and mitogen-activated protein kinase(MAPK) activation, as determined by western blot analysis and reverse transcription -polymerase chain reaction(RT-PCR). Results : EC inhibited PGN-induced NO and IL-6 production. Consistent with these observations, the protein expression of iNOS and COX-2 were inhibited by EC. Moreover, EC suppressed the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase(ERK) 1/2 in PGN-induced RAW 264.7. Conclusions : These results suggest that EC has inhibitory effects on PGN-induced $\PGE_2$, NO, and IL-6 production, as well as the expressions of iNOS and COX-2 in the murine macrophage. These inhibitory effects occur through blockades on the MAPKs phosphorylation.
Objectives : Ecklonia cava is brown alga(Laminariaceae) which grows is sea, it has antioxidant, diarrhea and anticoagulant effect. In this study, the effect of ethanol extract of Ecklonia cava (EC) on peptidoglycan(PGN) -induced NO production in RAW 264.7 cells was investigated. Methods : In the present study, IL-6 production was measured using the enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), prostaglandin $\E_2$($\PGE_2$) production was measured using the EIA kit, and inducible NO synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), and mitogen-activated protein kinase(MAPK) activation, as determined by western blot analysis and reverse transcription -polymerase chain reaction(RT-PCR). Results : EC inhibited PGN-induced NO and IL-6 production. Consistent with these observations, the protein expression of iNOS and COX-2 were inhibited by EC. Moreover, EC suppressed the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase(ERK) 1/2 in PGN-induced RAW 264.7. Conclusions : These results suggest that EC has inhibitory effects on PGN-induced $\PGE_2$, NO, and IL-6 production, as well as the expressions of iNOS and COX-2 in the murine macrophage. These inhibitory effects occur through blockades on the MAPKs phosphorylation.
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문제 정의
PGE2 생성량과 iNOS. COX-2의 발현 및 IL-6에 미치는 영향을 알아보고 그 기전을 밝히고자 한다.
따라서 본 연구에서도 EC가 NO와 COX-2, IL-6와 같은 염증매개체들을 어떠한 신호전달을 통해 억제하는지 알아보기 위해 MAPKs의 인산화를 억제하는지 알아보았다. 그 결과 MAPKs의 인산화는 PGN으로 유도한 대식세포의 염증반응은 ERK 1/2의 인산화를 억제하는 것을 보여준다.
그러나 그람-양성균인 PGN에 관한 연구는 거의 이루어져 있지 않은 실정이다. 따라서 본연구에서는 PGN로 유도된 대식세포에서 감태의 에탄올 추출물(EC) 항염증 효능을 실험하였다. NO는 자율신경계와 중추신경계의 대식세포를 포함하는 몇몇 기관에 있어 세포 간 신호 전달에 중요한 인자 중 하나로 알려져 있다”I 그러나 NO의 과도한 생성은 건강에 해로울 수 있으며, 패혈성 쇼크, 류마티스성 관절염, 자가 면역 질환을 일으킬 수 있다22) NO생산의 억제는 NO의 과다생성으로 인한 질병의 치료에 이로운 효과가 있을 수 있다23-24).
또한 최근 연구에서 감태에서 분리된 성분이 인간 대장에서의 항산화, 항염증 효능이 있는 것으로 밝혀졌다4). 본 연구는 감태의 에탄올 분획 (EC)이 그람양성균 PGN에 의해 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 항염증 효능을 밝히고자 한다. 박테리아는 숙주의 선천면역계를 흥분시키며, 감염되면 사이토카인과 케모카인과 같은 염증성 분자들을 분비하게 한다5,6).
또한 감태에는 알긴산, 푸코이단, 라미나란과 같은 수용성 식이섬유들이 다량 함유되어 있다20). 이에 본 연구에서는 감태 에탄올 추출물을 이용하여 대식세포에서 항염증 효과를 관찰하였다.
제안 방법
EC에 의한 염증인자의 억제와 iNOS 및 COX-2, IL-6 mRNA 발현과의 상관성을 알아보기 위하여 RT-PCR로 mRNA 발현을 조사하였다. RNA 및 RT-PCR RNA는 RAW 264.
1% Tween20 + TBS) 용액에 상온에서 실시하였다. ERK의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse ERK(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 반응시킨 후 TTBS로 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 희석하여 상온에서 반응시킨 후 TTBS로 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 과 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
PGN로 유도된 IL-6 생성에 대한 EC의 효과를 ELISA를 이용해서 관찰하였고, IL-6 mRNA 발현에 대한 EC의 효과를 RT-PCR 분석법으로 실험하였다. 그 결과, 50과 100 ug/mL 농도의 EC를 전 처리한 경우에 IL-6의 생성과 발현이 현저히 감소하였다(Fig.
mRNA 발현을 조사하였다. RNA 및 RT-PCR RNA는 RAW 264.7세포 5xl06 cells/mL 로 분주한 다음, 여기서 얻어진 RNA 에 MuLV 역전사효소(reverse transcriptase), 1mM dNTP를 넣어 cDNA를 만들었다. 여기에 IL-6, iNOS, COX-2, 。-actin 프라이머를 넣고 유전자 증폭기 (thermal cycler)를 이용하여 증폭시켰다.
감태는 100% 에탄올로 2시간씩 3회 환류 추출을 하였다. 추출된 추출물은 1 L 회전 감압 농축기 (N-1000S.
7)는 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 사용하였디"(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology American Tissue Culture Collection). 대식세포는 항생제 및 항균제로서 100 U/mL의 페니실린 G과 100 U/n血의 스트렙토마이신(streptomycin) 을 첨가하고 10% 열처리 우태아 혈청 (heat inactivated FBS)을 첨가한 완전한 RPMI 1640 배지에서 5% C6의 습한 대기, 37℃의 온도조건으로 배양하였다.
여기에 IL-6, iNOS, COX-2, 。-actin 프라이머를 넣고 유전자 증폭기 (thermal cycler)를 이용하여 증폭시켰다. 만들어진 RNA를 2% 아가로스 겔에 전기 영동시켜 UV 검출기로 확인하였다.
발현에 어떤 관계가 있는지 확인하기 위해 RT-PCR을 수행했다. RAW 264.
7세포가 배양된 96 well plate에 농도별(50, 100 ug/mL)로 전처리하고, 여기에 PGN을 각각 주입하였다. 배양한 대식세포주의 상층액을 수집하여 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% N- (1-naphthyl) -ethylene diamine dihydrochloride in 2.5% phosphoric acid solution)-2]- 동량으로 주입한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
EC가 PGE?생성을 억제하는지 약리학적인 효능평가를 실시하기위해 EC를 각각 50 ug/mL, 100 ug/mL농도로 1시간 동안 전 처리한 후 PGN으로세포를 자극한 후 세포 부유액을 원심분리하여 세포들을 침전시켜 상층액을 수집하고, 상층액 내 PGE2 생성양을 측정하였다. 그 결과, Fig.
설치류의 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 PGN으로 자극 하였을 때 감태 에탄올 추출물(EC)의 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
그렇게 처리한 후 흡광도를 590 nm에서 측정하였다. 세포 독성은 아무 처리를 하지 않은 그룹과 각 그룹의 흡광도의 비율로 계산하였다.
7 세포를 5xl05 cells/mL로 24 well plate에 접종하고, 5% COz 항온기에서 배양 하였다. 이후 배지를 교체하고 EC(50, 100 ug/mL)을각각 처리한 후, PGN 자극한 후 세포 부유액을 원심분리하여 세포들을 침전시켜 상층액을 수집하고 상층액 내 IL-6 생성량을 ELISA kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량해 분석하였다.
7 세포를 5xl05 cells/mL로 24 well plate 에 접종하고 5% CO2 항온기에서 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 EC(50, 100 ug/mL)을각각 처리한 후, PGN으로 자극한 후 세포부유액을 원심분리하여 세포들을 침전시켜 상층액을 수집하고 상층액 내 PGE2 생성양을 EIA kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량해 분석하였다.
대상 데이터
대식세포(murine macrophage cell line. RAW264.7)는 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 사용하였디"(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology American Tissue Culture Collection). 대식세포는 항생제 및 항균제로서 100 U/mL의 페니실린 G과 100 U/n血의 스트렙토마이신(streptomycin) 을 첨가하고 10% 열처리 우태아 혈청 (heat inactivated FBS)을 첨가한 완전한 RPMI 1640 배지에서 5% C6의 습한 대기, 37℃의 온도조건으로 배양하였다.
p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK monoclonal 항체와 peroxide conjugated 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 그리고 RNA extraction kit는 iNtRON(iNtRON, Korea)에서 구입하였다.
소혈청알부민 (BSA), FBS. 3-(4.5-Dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole (MTT), PD098059는 Sigma(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였고, RPMI 1640. 페니실린/스트렙토마이신은 Hyclone(Hyclone Labs Logan.
7에서 PGN으로 유도된 NO의 발현에 대한 EC의 효과를 측정하기 위해, 세포에 EC를 전 처리하거나 처리하지 않고 1시간 후에 PGN(3) μg/mL)로 자극했다. PD098059는 ERK 1/2의 억제제로 대조군으로 사용하였다. 세포자극 24시간 후 세포배양액을 채취하여 N0의 양을 Griess 시약 반응을 통해 결정하였다.
Louis, MO, USA) 에서 구입하였고, RPMI 1640. 페니실린/스트렙토마이신은 Hyclone(Hyclone Labs Logan. UT)에서 구입하였다. p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK monoclonal 항체와 peroxide conjugated 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
데이터처리
모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치士표준편차(SE) 를 구하여 그 유의성은 Student's t-test 분석법을 이용하여 신뢰수준 95% (p < 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
Cell viability was evaluated with the MTT assay. Data represent the means+S.
EC의 세포에 대한 독성 측정은 3-(4.5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole(MTT) assay 방법으로 분석하였다. 이는 mitochondrial dehydrogenases의하여 MTT가 foimazaD으로 전환되는 것을 측정하는 것이다.
PGN으로 유도된 RAW 264.7 세포에서 MAPKs 의 인산화에 대한 감태에탄올 추출물(EC)의 효과를 Western blot analysis를 통해 확인하였다. EC (50 μg/mL, 100 μg/mL)는 PGN으로 자극된 RAW 264.
감태에탄올 추출물 (EC)이 세포독성에 영향을 주는지 알아보기 위해 MTT 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. EC를 50 ug/mL, 100 ug/mL의 농도로 처리 하였을 때 모두에서 세포독성이 나타나지 않았다(Fig.
성능/효과
2. EC는 PGN으로 유도된 전염증성 사이토카인 IL-6생성과 발현을 현저하게 억제하였다.
4. EC 전 처리시 PGN으로 유도된 MAPKs 인산화를 저해 하는지 알아보기 위해 western blot을 수행한 결과 MAPKs(ERKl/2) 인산화를 저해하였다.
7 세포에서는 PGN을 처리하였을 때 iNOS와 COX-2 mRNA 발현이 급격히 증가하였으며. EC를 전 처리하면 iNOS와 COX-2의 발현이 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 5).
세포자극 24시간 후 세포배양액을 채취하여 N0의 양을 Griess 시약 반응을 통해 결정하였다. PGN으로 자극한 세포는 자극하지 않은 세포에 비해 5배 이상의 NO를 발현하였으나, ECdOO ug/mL)의 농도에서는 ERK 1/2이 억제제 PD098059(30 uM) 보다 통계적으로 유의하게 억제하였다(Fig. 2).
억제하는지 알아보았다. 그 결과 MAPKs의 인산화는 PGN으로 유도한 대식세포의 염증반응은 ERK 1/2의 인산화를 억제하는 것을 보여준다. 이러한 결과는 EC가 PGN으로 유도된 대식세포를 매개로한 염증반응의 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 수 있고, 그람-양성균에 의한 염증 질환의 새로운 치료 후보물질임을 알 수 있다.
그 결과, 50과 100 ug/mL 농도의 EC를 전 처리한 경우에 IL-6의 생성과 발현이 현저히 감소하였다(Fig. 3).
생성양을 측정하였다. 그 결과, Fig. 4에서와같이 PGN에 의해 PGE2 생성양 증가하였고, EC 를 각각 50 ug/mL, 100 ug/mL 모두에서 억제되었다.
NO와 PGE?생성을 농도 의존적으로 억제하였다.
그리고 COX-2는 염증성 질환을 가진 동물이나 환자의 염증성 부위에서 강하게 유발되는 것으로 알려져 왔다25). 이번 연구에서 보면, PGN에노출된 대식세포가 NO생성량이 늘어나는 것으로 볼 때 배지에 IL-6, NO를 죽적하는 것과 관련이 있다. 또한 PGN으로 유도된 IL-6와 NO, PGE2 생성은 EC의 처리에 의해 억제되었다.
이와 같은 결과로 보아 감태 에탄올 추출물은 대식세포에 작용하여 MAPKs의 인산화 저해를 통해 NO, PGE2, IL-6의 생성과 iNOS, COX-2 발현을 억제함으로써 항염증에 효과가 있음을 알 수 있다.
후속연구
그 결과 MAPKs의 인산화는 PGN으로 유도한 대식세포의 염증반응은 ERK 1/2의 인산화를 억제하는 것을 보여준다. 이러한 결과는 EC가 PGN으로 유도된 대식세포를 매개로한 염증반응의 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 수 있고, 그람-양성균에 의한 염증 질환의 새로운 치료 후보물질임을 알 수 있다.
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