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문제 정의
- 또한 amylosucrase, branching enzyme을 비롯하여 다양한 전분 관련 효소를 생산하고 있다(13,14). 본 연구에서는 D. geothermalis DSM 11300로부터 기존의 CD 분해효소들과 상동성은 낮으나 CD 분해효소들의 공통 적인 N-말단 도메인을 가지고 있는 것으로 확인된 dgeo_0475 유전자를 이용하여 재조합 단백질을 생산, 정제하여 그 효소학적 특성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- D. geothermalis DSM 11300균주로부터 maltogenic amylase 유전자를 클로닝하기 위하여 이미 밝혀진 dgeo_0475유전자 염기서열(GenBank accession number YP_603946)을 바탕으로 primer를 설계하고 PCR 방법을 통해 maltogenic amylase로 예상되는 유전자를 얻어내었다. PCR 단편은 pGEM-T-easy 벡터와 결합하여 그 시퀀스를 확인한 결과 이 유전자는 1,827 bp의 길이로 608개의 아미노산을 암호화하고 있으며 예상된 분자량은 약 68,704 Da이었다.
- D. geothermalis DSM 11300의 유전자는 GeneAllTM total DNA purification kit(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 추출하였다. 이미 알려져 있는 게놈 염기서열을 통해 확인한 MAase 유전자(dgeo_0475: GenBank accession number YP_603946)를 이용 하여 DGMA-F: 5'-CAT ATG AAC ATC ATC TTT GCC GAC C-3'와 DGMA-R: 5'-TCT AGA GGC CAA CAG CAA CCG CCC-3' primer를 제작하였다.
- D. geothermalis의 dgeo_0475 유전자로부터 만들어지는 효소를 정제하여 그 특성을 확인하였다. DGMA는 분자량이 약 68 kDa 크기의 효소로서 β-CD, soluble starch 및 pullulan을 가수분해하는 CD 분해 효소임을 확인하였다.
- DGMA의 발현은 항시 발현 프로모터를 가지고 있는 pHCXHD 벡터를 이용하였다. 발현을 위해 Nde I과 Xho I 제한효소를 이용하여 pHCXHD 벡터와 dgma 유전자가 들어있는 pGEM-T-easy 벡터에 각각 처리하여 단편을 얻어 발현벡터인 pHC-DGMA를 제조하였으며 효소발현을 위한 숙주인 E.
- 0에서 30-55℃까지 실험하였다. DGMA의 열 안정성은 45, 55, 65℃에서 관찰하였다. 활성측정은 위에 언급한 DNS 방법으로 수행하였고 동일한 조건하에서 측정되었다.
- E. coli에서 효율적인 단백질 발현을 위한 재조합 plasmid의 구축은 PCR을 통해 얻은 maltogenic amylase유전자를 pGEM Teasy벡터에 결합하여 얻은 plasmid와 pHCXHD(15)를 각각 Nde I 과 Xho I 제한효소로 처리하여 gel extraction kit(Axygen scientific Inc, Union City, CA, USA)로 정제한 다음 얻어진 단편들을 연결하여 pHC-DGMA를 제조하였다. 구축된 재조합 plasmid는 효율적인 발현을 위해 E.
- DGMA-F primer부위에는 Nde I 제한효소 인식 부위를 가지며 DGMA-R primer부위에는 Xho I 제한효소 인식 부위를 가지고 있다. PCR은 Pfu DNA polymerase를 사용하였고 thermal cycler(ASTEC PC-320, ASTEC Inc, Fukuoka, Japan)를 이용하여 maltogenic amylase유전자를 증폭하였다. PCR을 통해 얻은 단편은 pGEM T-easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)와 결합 후 E.
- PCR은 Pfu DNA polymerase를 사용하였고 thermal cycler(ASTEC PC-320, ASTEC Inc, Fukuoka, Japan)를 이용하여 maltogenic amylase유전자를 증폭하였다. PCR을 통해 얻은 단편은 pGEM T-easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)와 결합 후 E. coli DH10B에 형질전환하여 그 서열을 확인하였다.
- 2A). Plasmid pHC-DGMA가 형질전환된 E. coli DH10B 를 37℃에서 14시간 배양한 후, 배양된 세포를 sonicator로 파쇄 하여 Ni-NTA affinity chromatography를 통해 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE를 통해 확인하였고 그 결과 아미노산 서열에서 계산된 분자량과 일치하는 약 68 kDa 부근의 위치에서 순수 분리된 DGMA의 단일 band를 확인할 수 있었다(Fig.
- Louis, MO, USA)제품을 사용하였으며 pullulan은 Wako사 (Osaka, Japan) 제품을 구입하였다. 또한 당 분석을 위해 Whatman(Kent, UK)의 silica gel K5F thin-layer chromatography(TLC) 를 사용했다.
- 0 범위의 pH조건에서 활성을 측정하였다. 먼저 최적 pH 조건을 찾기 위해 40℃에서 pH 3.0-9.0까지 실험하였다 (40 mM sodium citrate buffer pH 3.0, 4.0, 5.0, and 6.0; 40 mM sodium acetate buffer pH 4.0, 5.0, and 6.0; 40 mM sodium phosphate pH 6.0, 7.0, and 8.0; 40 mM Tris-HCl pH 7.0, 8.0, and 9.0). 활성을 나타내는 효과적인 온도는 40 mM sodium acetate pH 6.
- DGMA의 발현은 항시 발현 프로모터를 가지고 있는 pHCXHD 벡터를 이용하였다. 발현을 위해 Nde I과 Xho I 제한효소를 이용하여 pHCXHD 벡터와 dgma 유전자가 들어있는 pGEM-T-easy 벡터에 각각 처리하여 단편을 얻어 발현벡터인 pHC-DGMA를 제조하였으며 효소발현을 위한 숙주인 E. coli DH10B를 사용하였다(Fig. 2A). Plasmid pHC-DGMA가 형질전환된 E.
- 효소의 가수분해반응 산물을 확인하기 위하여 Silica gel K5F thin layer chromatography plate(Whatman, Kent, UK)를 이용하여 TLC분석을 실시하였다. 전개 용매는 2-propanol:ethyl acetate:water =3:1:1(v/v/v)을 사용하였으며 전개 후 건조시킨 다음 dipping solution(methanol 950 mL, sulfuric acid 50 mL, 1-naphtol 3 g)을 이용하여 발색시켜 110℃에서 건조하여 확인하였다.
- DGMA의 열 안정성은 45, 55, 65℃에서 관찰하였다. 활성측정은 위에 언급한 DNS 방법으로 수행하였고 동일한 조건하에서 측정되었다.
- 효소의 가수분해반응 산물을 확인하기 위하여 Silica gel K5F thin layer chromatography plate(Whatman, Kent, UK)를 이용하여 TLC분석을 실시하였다. 전개 용매는 2-propanol:ethyl acetate:water =3:1:1(v/v/v)을 사용하였으며 전개 후 건조시킨 다음 dipping solution(methanol 950 mL, sulfuric acid 50 mL, 1-naphtol 3 g)을 이용하여 발색시켜 110℃에서 건조하여 확인하였다.
- 효소의 최적 활성을 나타내는 조건을 찾기 위해 30-55℃ 범위의 온도와 3.0-9.0 범위의 pH조건에서 활성을 측정하였다. 먼저 최적 pH 조건을 찾기 위해 40℃에서 pH 3.
대상 데이터
- T4 DNA ligase, Pfu DNA polymerase와 같은 restriction endonucleases, modifying enzymes는 New England Biolabs(Beverly, MA, USA)와 Solgent(Seoul, Korea)에서 구입해서 사용했다. 기질로 사용한 soluble starch, β-cyclodextrin(β-CD)는 Sigma-Aldrich사 (St.
- 기질로 사용한 soluble starch, β-cyclodextrin(β-CD)는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)제품을 사용하였으며 pullulan은 Wako사 (Osaka, Japan) 제품을 구입하였다.
- 본 연구에 사용한 D. geothermalis DSM 11300은 TGY 배지 (0.5% tryptone, 0.3% yeast extract 그리고 0.1% glucose)를 이용 하여 50℃에서 배양하였다. 클로닝 및 발현을 위하여 Escherichia coli DH10B [F– araD139 ∆ (ara leu)7697 ∆lacX74 galU galK rpsL deoR Φ80lac Z∆M15 endA1 nupG recA1 mcrA ∆(mrr hsdRMS mcrBC)] 균주를 사용하였으며 Luria-Bertani(LB, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 배지를 이용하여 37°C에서 배양하였다.
- 이미 알려져 있는 게놈 염기서열을 통해 확인한 MAase 유전자(dgeo_0475: GenBank accession number YP_603946)를 이용 하여 DGMA-F: 5'-CAT ATG AAC ATC ATC TTT GCC GAC C-3'와 DGMA-R: 5'-TCT AGA GGC CAA CAG CAA CCG CCC-3' primer를 제작하였다.
- 클로닝 및 발현을 위하여 Escherichia coli DH10B [F– araD139 ∆ (ara leu)7697 ∆lacX74 galU galK rpsL deoR Φ80lac Z∆M15 endA1 nupG recA1 mcrA ∆(mrr hsdRMS mcrBC)] 균주를 사용하였으며 Luria-Bertani(LB, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 배지를 이용하여 37°C에서 배양하였다.
이론/모형
- 정제된 DGMA의 효소활성은 환원당 측정법인 DNS방법을 이용하여 측정하였다. 최적 온도 및 pH를 확인하기 위해 30-55℃온도 범위와 pH 3.
- 효소의 활성 측정 방법은 환원당의 양을 측정 하는 DNS(dinitrosalicylic acid)방법을 사용하였다(16). 효소 반응액은 효소의 최적 buffer인 sodium acetate(pH 6.
성능/효과
- geothermalis의 dgeo_0475 유전자로부터 만들어지는 효소를 정제하여 그 특성을 확인하였다. DGMA는 분자량이 약 68 kDa 크기의 효소로서 β-CD, soluble starch 및 pullulan을 가수분해하는 CD 분해 효소임을 확인하였다. 효소의 최적 온도는 40o C 최적 pH 는 6.
- DGMA의 경우 CD 분해효소와 마찬가지로 starch 뿐만 아니라 pullulan과 β-CD를 가수분해하는 특성을 가지고 있는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- gov)과 alignment분석을 한 결과 Thermoactinomyces vulgaris R-47의 amylase II와 27%, Thermus sp. IM6501 maltogenic amylase(ThMA)와 27%, Geobacillus stearothermophilus neopullulanase와 26%의 낮은 상동성을 가지고 있는 것으로 나타났다(Table 1)(17-19). 하지만 DGMA는 다른 CD 분해효소들과 같이 α-amylase의 공통적인 상동부위 conserved region(CR) IIV가 존재하고 있으며 CD 분해효소들의 공통적인 특징인 N-말단 도메인을 가지고 있었다(3).
- geothermalis DSM 11300균주로부터 maltogenic amylase 유전자를 클로닝하기 위하여 이미 밝혀진 dgeo_0475유전자 염기서열(GenBank accession number YP_603946)을 바탕으로 primer를 설계하고 PCR 방법을 통해 maltogenic amylase로 예상되는 유전자를 얻어내었다. PCR 단편은 pGEM-T-easy 벡터와 결합하여 그 시퀀스를 확인한 결과 이 유전자는 1,827 bp의 길이로 608개의 아미노산을 암호화하고 있으며 예상된 분자량은 약 68,704 Da이었다. 이는 알려진 기존의 CD 분해효소와 비슷한 분자량을 보여 주고 있으나 단백질 서열을 NCBI의 BLAST 프로그램(http:// www.
- TLC 를 통해 가수분해산물을 확인하여 본 결과 β-CD와 반응하여 glucose와 maltose를 생성하였고 pullulan 또한 비교적 잘 분해하여 glucose 및 maltose 와 함께 미량의 panose를 생산하였다.
- 3). pH 5.0 이하의 산성 조건에서는 효소의 활성이 80% 이상 감소하였으며 pH 8.0 이상에서도 50%이상 효소의 활성이 감소하는 것으로 나타났지만 pH 6.0 과 7.0사이에서 효소 활성의 70% 이상이 유지되었다. 이러한 효소의 최적 pH 범위는 현재까지 알려진 대부분의 Bacillus속의 CD 분해효소가 pH 6.
- vulgaris R-47 α-amylase I와 상대적으로 유사한 점이 많은 것으로 미루어 아마도 구조적으로 활성부위 부분이 기존의 CD 분해효소와 차이가 있을 것으로 예상된다(24). 또한 DGMA 대부분의 기질을 glucose와 maltose로 분해하는 강한가수분해 활성을 보여주고 있는데, 이는 앞서 언급했던 +1 결합 부위에 존재하는 CR III 부분의 영향이 큰 것으로 추측된다. 특히 DGMA의 경우 soluble starch, pullulan등의 다당류 기질을 대부분 glucose와 maltose로 가수분해하는 특성을 보여주고 있는데 이는 전분당 생산에 응용할 수 있을 것으로 예상된다.
- 0 사이에서 최고 활성을 보여주는 것과 유사 하였다(Table 1)(8,20). 또한 효소의 열안정성은 65℃와 55℃ 에서 반감기가 각각 8.2분과 187.4분으로 최적온도 이상에서 상당시간 효소활성이 유지됨을 보여주었다(Fig. 3C). DGMA의 경우 효소의 최적온도가 40℃로 상대적으로 고온에서 잘 성장하는 것으로 알려진 D.
- 이에 반해 DGMA는 β-CD에 대한 가수분해능력이 다른 기질에 비해 높기는 하였지만 soluble starch에 비하여 2배, pullulan 에 대해서는 9배 높은 것으로 나타나 기존의 CD 분해효소에 비해 차이가 있었다(Table 2).
- coli DH10B 를 37℃에서 14시간 배양한 후, 배양된 세포를 sonicator로 파쇄 하여 Ni-NTA affinity chromatography를 통해 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE를 통해 확인하였고 그 결과 아미노산 서열에서 계산된 분자량과 일치하는 약 68 kDa 부근의 위치에서 순수 분리된 DGMA의 단일 band를 확인할 수 있었다(Fig. 2B).
- 정제된 DGMA의 효소활성은 환원당 측정법인 DNS방법을 이용하여 측정하였다. 최적 온도 및 pH를 확인하기 위해 30-55℃온도 범위와 pH 3.0-9.0의 범위에서 효소 활성을 측정한 결과 DGMA는 40o C의 온도에서 최고 활성을 보였으며 이 때 최적 pH 는 pH 6.0으로 나타났다(Fig. 3). pH 5.
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