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문제 정의
- 따라서 본 연구는 농도를 달리한 옥수수 열수 추출물이 마우스 비장세포에 직접 작용하여 면역세포를 증식시키는 활성이 있는지 검색하고, 동시에 사이토카인(IL-1β, IL-6, IFN-γ) 생성량을 측정하여 면역세포의 활성화에 관여함을 조사함으로써 면역 증진능을 갖는 천연 식품 소재로서의 옥수수의 면역 증진 식품으로서의 활용 가능성을 확인하고자 실시하였다.
- 또한, 더덕 열수 추출물 1～25 ㎍/㎖ 농도 첨가시 림프절 세포 증식 효과가 있었다는 연구 보고(Lee JH 2002)와 더덕과 가시오가피 혼합 추출물이 흉선과 비장세포 증식을 촉진시킨 것으로 보고된 바 있다(Lim 등 2007). 이러한 연구의 일환으로 우리나라에 전통적으로 곡류식품으로 널리 이용되고 있는 옥수수를 소재로 면역 증진 효과를 확인하고자 하였다. 옥수수는 기후나 토양에 대한 적응력이 뛰어나, 우리나라 전역에서 재배가 용이하고 생산량이 많으며, 주로 강원도 지역에서 많이 생산되고 있다.
제안 방법
- In vitro(시험관 내) 실험에서는 옥수수 에탄올 추출물 및 물 추출물을 세포배양액(10 % FBS-RPMI 1640; GIBCO)에 용해시킨 다음, 실험하고자 하는 농도가 되도록 희석하여 세포 배양시 첨가하였다. Ex vivo(생체 외) 실험에서는 옥수수 물 추출물을 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다.
- 0×106 cell/㎖이 되도록 희석하여 96 well plate의 각 well에 90 ㎕씩 분주하고, 각 군당 미토젠으로 ConA(5 ㎍/㎖), LPS(15 ㎍/㎖)를 10 ㎕씩 분주하고, 대조군에는 배지를 동량으로 분주하였다. 각 plate는 37℃, 5% CO2 incubator(Sanyo)에서 44시간 배양하여 MTT assay를 실시하였다. 배양후 MTT를 10 ㎕ 가하고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태에서 4시간 동안 다시 배양한 후 formazan crystal 형성을 유도하였다.
- 각 군별로 마우스 비장세포 현탁액을 5.0×106 cell/㎖이 되도록 희석하여 96 well plate의 각 well에 90 ㎕씩 분주하고, 각 군당 미토젠으로 ConA(5 ㎍/㎖), LPS(15 ㎍/㎖)를 10 ㎕씩 분주하고, 대조군에는 배지를 동량으로 분주하였다.
- 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누었으며, 실험군마다 4마리씩 사용하였다. 대조군에는 생리 식염수를, 투여군에는 검액을 각각 50 ㎎/㎏ B.W./day와 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도가 되도록 멸균중류수로 희석하여 0.2 ㎖/day씩 4주간 격일로 경구 투여하였다(Fig. 2).
-
1. 시료 추출 및 실험 동물
동결 건조된 시료를 증류수 또는 에탄올로 환류 냉각시키면서 80℃ 수욕상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 물 추출물과 에탄올 추출물을 얻었다(Fig. 1). 본 연구에 사용된 동물은 면역 실험용으로 제공되는 7～8주령 된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 공급받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7～8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다.
- 배양 상층액을 분리하여 배양액에 축적된 IL-1β, IL-6, IFN-γ량을 ELISA 사이토카인 kit(R&D system, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 본 실험에서는 IL-1β, IL-6, IFN-γ 의 분비량을 측정하였고, 각 군별 양성 대조군으로는 LPS(15㎎/㎖)로 자극한 대식세포로부터 분비된 사이토카인을 측정함으로써 대식세포의 활성화에 대한 지표로 삼았다.
- 옥수수 물 추출물을 경구 투여한 마우스의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인(IL-1β, IL-6, IFN-γ) 분비량을 각각 측정하였다. 비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640 900 ㎕와 대식세포를 활성화시키는 mitogen인 LPS와 배지를 100 ㎕ 가한 후 37℃, 5% CO2 incubator(Sanyo)에서 48시간 배양하였다. 배양 상층액을 분리하여 배양액에 축적된 IL-1β, IL-6, IFN-γ량을 ELISA 사이토카인 kit(R&D system, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 0×106 cell/㎖로 분산시킨 후 96-well plate에 90 ㎕씩 분주한 후 세포 증식능 측정에 사용하였다. 비장세포 증식능은 배양액 10% FBS-RPMI 1640을 넣은 대조군의 흡광도를 1로 하여 상대적인 값으로 표현하였다.
- 생체 외(ex vivo) 실험에서 옥수수의 물 추출물을 4주간 격일로 마우스 체중 ㎏ 당 0, 50, 500㎎/㎏ B.W.의 농도로 마우스에 경구 투여한 후 LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 생성량을 측정하였다.
- 실험 동물실 온도는 22±2℃, 습도는 40～60%로 유지하였고, 명암주기(Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
- 옥수수 물 추출물과 에탄올 추출물 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 배양하였고, 음의 대조군(negative control)으로는 옥수수 시료의 추출물 대신 배양액(10% FBS-RPMI 1640)을 첨가하고, 양의 대조군(positive control)으로는 Con A(5 ㎍/㎖)와 LPS(15 ㎍/㎖)를 첨가하여 배양하였다. Con A는 T세포를, LPS는 B세포 증식을 선택적으로 증가 시키고, 이들의 mitogen effect는 농도 의존적이었다.
- 옥수수 물 추출물을 경구 투여한 마우스의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인(IL-1β, IL-6, IFN-γ) 분비량을 각각 측정하였다.
- 2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 다시 RPMI medium 1640 용액에 분산시켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 그 세포수를 측정하였다. 세포농도 5.
대상 데이터
- Ex vivo(생체 외) 실험에서는 옥수수 물 추출물을 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다. 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누었으며, 실험군마다 4마리씩 사용하였다. 대조군에는 생리 식염수를, 투여군에는 검액을 각각 50 ㎎/㎏ B.
- 1). 본 연구에 사용된 동물은 면역 실험용으로 제공되는 7～8주령 된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 공급받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7～8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22±2℃, 습도는 40～60%로 유지하였고, 명암주기(Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
데이터처리
- 2) Means with different letters(a, b, c) within a colume significantly different from each other at α=0.05 as determined by Duncan's multiple range test(a>b>c).
- 각 군간의 평균치의 차이는 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA) 및 Duncan's multiple range test를 사용하여 α=0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 모든 실험 결과의 자료는 SAS(Statistic Analysis System) 통계 프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다. 각 군간의 평균치의 차이는 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA) 및 Duncan's multiple range test를 사용하여 α=0.
이론/모형
- 마우스 비장세포 분리는 Mishell(Mishell 등 1980)의 방법에 의해 시행되었다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 배양액으로 씻은 후 멸균 유리봉으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다.
성능/효과
- 4주 투여군의 결과, LPS로 처리하지 않은 경우 50, 500 ㎎/㎏ B.W. 첨가 시 각각 217.90±106.73, 203.14±49.35로 나타나, 50 ㎎/㎏ B.W. 농도에서 대조군보다 높은 생성을 보였다.
- 4주 투여의 결과, LPS로 처리하지 않은 경우 50 ㎎/㎏ B.W.의 농도에서 200.64±0.33 pg/㎖로 대조군(107.89±0.77 pg/㎖)에 비해 유의적으로 높은 생성을 보였고, 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서도 214.81±17.51 pg/㎖로 대조군에 비해 유의적으로 높은 생성량을 나타냈다.
- LPS 처리에 의한 영향도 50 ㎎/㎏ B.W.의 농도에서 389.87±8.49 pg/㎖로 대조군(342.67±4.41 pg/㎖)에 비해 높은 생성을 보였고, 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도에서는 406.65±6.3 pg/㎖로 대조군에 비해 유의적으로 높은 생성량이 관찰되었다.
- LPS로 처리하지 않은 경우 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서 111.79±11.35로 대조군(31.01±12.83)보다 유의적으로 높은 생성을 보였고, LPS 처리에 의한 경우 50 ㎎/㎏ B.W.에서 243.02±3.31, 500 ㎎/㎏ B.W.에서 1,037.82±188.5로 대조군보다 높은 분비능을 보였으며, 특히 500 ㎎/㎏ B.W.의 경우는 유의적으로 높은 생성능을 보였다.
- 그 결과, 옥수수 물 추출물은 LPS로 자극하지 않은 경우, IL-1β은 50, 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서, IL-6는 50 ㎎/㎏ B.W에서, IFN-γ는 50과 500㎎/㎏ B.W. 농도 모두에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 증식 효과를 보여주었다.
- 옥수수 추출물을 경구 투여한 마우스의 대식세포에서 IL-1β분비량이 50, 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도 모두에서 대조군에 비해 유의적으로 증가되어 옥수수 추출물이 마우스의 복강 대식세포를 활성화하여 IL-1β 생성을 촉진시킴으로써 면역 증강에 영향을 미칠 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 옥수수의 물 추출물 및 에탄올 추출물에 대한 생체 외 실험으로 비장세포 증식능을 검색한 결과, 물 추출물에서 50～1,000 ㎕/㎖의 농도를 첨가했을 때 비장세포 증식능을 촉진하는 효과가 있는 것으로 나타났고, 에탄올 첨가 시에는 유의적인 변화를 보이지 않았다. 생체 외(ex vivo) 실험에서 옥수수의 물 추출물을 4주간 격일로 마우스 체중 ㎏ 당 0, 50, 500㎎/㎏ B.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 500 ㎎/㎏ B.W. 농도의 옥수수 추출물 경구 투여시 마우스 비장세포 증식능과 사이토카인 분비능에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 이상의 결과에 따르면 옥수수 추출물의 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ 생성 효과는 500 ㎎/㎏ B.W. 농도 투여 시 효과적으로 면역 세포와 면역 기관의 주요 기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 6%의 종양 성장 저지율을 보였다고 보고하였다(Ryu 등 1987). 이러한 결과는 500 ㎎/㎏ B.W. 농도군의 옥수수 추출물이 외부로부터의 항원에 대항하여 마우스의 복강 대식세포를 활성화시켜 IL-6의 생성을 촉진시킴으로써 면역기능 증강에 효과적으로 작용할 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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