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문제 정의
- 본 연구는 시중에 판매되고 있는 구절초 꽃차에 관한 효능 연구를 통해 건강기능성에 대한 구체적 근거를 제시하고자 구절초 꽃으로부터 다양한 용매의 분획을 얻고 이들의 항산화력과 flavonoid 함량을 측정하였다.
제안 방법
- 2,2’-azinobi-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS)를 7mM 농도로 증류수에 용해시키고 여기에 최종농도가 2.45mM이 되도록 potassium persulfate를 첨가하여 ABTS 양이온 라디칼을 만들었다.
- 분획물 비첨가군은 시료대신 80% MeOH 10μL를 첨가하여 측정하였다. ABTS를 이용한 총 항산화력은 시료 첨가군과 비첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였다.
- MeOH 추출물과 EtOAc 분획물을 시료전처리용 ODS-S cartridge(Toyopak ODS-S, Tosoh, Tokyo)에 여과시키고 그 여과액을 다시 0.45μm PVDF syringe filter로 여과한 후, flavonoid 성분을 HPLC(Shimadzu LC-10AD, Japan)로 측정하였다.
- MeOH 추출물과 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH, 잔류 water 분획물을 최종 농도가 10, 50, 100μg･mL-1의 농도가 되도록 조제한 후, 96 well plate에 100μL씩 각각 분주한 다음 200μM DPPH 100μL를 첨가하였다.
- 4mL에 증류수를 첨가하여 4mL로 만들어 실온에서 1시간 방치하였다. Spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu Co., Japan)로 725nm에서 흡광도를 측정하여 총 polyphenol 함량으로 환산하였다. 이 때 총 polyphenol 함량은 tannic acid를 표준품으로 0-600μg･mL-1 농도로 작성한 표준곡선을 이용하여 함량을 구하였으며 측정단위로는 TAE(Tannic Acid Equivalent)･g-1을 사용하였다.
- 구절초의 유효 성분 중 항산화 활성이 있다고 생각되는 주요 flavonoid 성분을 정량 분석하기 위해 HPLC를 이용하였다. 구절초 MeOH 추출물과 EtOAc분획물을 HPLC로 분석한 결과 확인된 flavonoid는 quercetin과 luteolin이었으며 체류 시간은 quercetin이 14.
- 또한 비첨가군에는 추출물 대신에 80% MeOH 100μL를 첨가하여, 10초간 shaking 시킨 다음 540nm에서 spectrophotometer SUNRISE(Tecan, USA)로 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도를 조사하였다.
- 분획물 비첨가군은 시료대신 80% MeOH 10μL를 첨가하여 측정하였다.
- 정치시킨 상등액을 10mm cell에 물을 대조액으로 하여 spectrophotometer를 사용하여 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 흡광도와 별도로 10% ammonium nitrate 용액 대신 물 0.1mL를 가한 것의 흡광도를 뺀 흡광도 차를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 flavonoid 함량을 구하였다. 이 때 검량선에 사용된 표준품은 quercetin을 이용하였으며 측정 단위로는 QE(Quercetin Equivalents)･g-1을 사용하였다.
- 96% acetic acid(H2O 100: acetic acid 2)로 하였다. 용매 구배는 A: 30%, B: 70%로 시작하여 5 분에 A: 50%, B: 50%, 10 분에 A: 70%, B: 30%, 15 분에 A: 90%, B: 10%로 하여 30 분까지 분석하였다. 유속은 1mL･min-1로 하였으며, 시료는 5μL를 injection하여 분석하였다.
- 또한 비첨가군에는 추출물 대신에 80% MeOH 100μL를 첨가하여, 10초간 shaking 시킨 다음 540nm에서 spectrophotometer SUNRISE(Tecan, USA)로 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도를 조사하였다. 이 때 EDA는 시료첨가군과 비첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였다.
- 이 때 총 polyphenol 함량은 tannic acid를 표준품으로 0-600μg･mL-1 농도로 작성한 표준곡선을 이용하여 함량을 구하였으며 측정단위로는 TAE(Tannic Acid Equivalent)･g-1을 사용하였다.
- 정량분석을 위하여 표준품 quercetin, luteolin(Sigma, USA)을 MeOH에 녹여 각각 10, 30, 50, 100μg･mL-1의 농도로 제조하여 peak 면적을 구하고 회귀방정식을 이용한 검량선을 작성하여 정량하였다.
- 이 때 총 polyphenol 함량은 tannic acid를 표준품으로 0-600μg･mL-1 농도로 작성한 표준곡선을 이용하여 함량을 구하였으며 측정단위로는 TAE(Tannic Acid Equivalent)･g-1을 사용하였다. 총 flavonoid 함량은 건강기능식품공전의 질산알루미늄법으로 측정하였는데, 각 MeOH 추출물과 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH, 잔류 water 분획물을 1mg･mL-1가 되게 DMSO에 녹인 후 0.5mL를 시험관에 취하고 ethanol 10%(w/v) 1.5mL, ammonium nitrate 용액 0.1mL, 1M potassium acetate 0.1mL, 증류수 2.8mL를 가하여 충분히 교반 한 후 40분간 실온에서 정치시켰다. 정치시킨 상등액을 10mm cell에 물을 대조액으로 하여 spectrophotometer를 사용하여 415nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 총 항산화력 측정을 위하여 MeOH 추출물과 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH, 잔류 water 분획물을 최종농도가 10, 50, 100μg･mL-1이 되도록 조제한 후 96 well plate에 10μL를 넣어준 후, ABTS solution 190μL, 증류수를 50μL 첨가하여 6분 후 734nm에서 spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- latilobum) 꽃은 한유농원(충청남도 아산시)에서 구입하여 사용하였다. 추출물 제조를 위하여 꽃을 잘게 자르고 시료의 10배 해당하는 메탄올(MeOH)을 가하여 실온에서 일주일 동안 추출하였다. 얻어진 추출액은 40℃에서 감압 농축한 후 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 꽃은 한유농원(충청남도 아산시)에서 구입하여 사용하였다. 추출물 제조를 위하여 꽃을 잘게 자르고 시료의 10배 해당하는 메탄올(MeOH)을 가하여 실온에서 일주일 동안 추출하였다.
- 6 × 250mm, Cosmosil, Germany)를 사용하였고 검출 파장은 365nm를 사용하였다. 용매 조성은 A: MeOH, B: 1.96% acetic acid(H2O 100: acetic acid 2)로 하였다. 용매 구배는 A: 30%, B: 70%로 시작하여 5 분에 A: 50%, B: 50%, 10 분에 A: 70%, B: 30%, 15 분에 A: 90%, B: 10%로 하여 30 분까지 분석하였다.
- 1mL를 가한 것의 흡광도를 뺀 흡광도 차를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 flavonoid 함량을 구하였다. 이 때 검량선에 사용된 표준품은 quercetin을 이용하였으며 측정 단위로는 QE(Quercetin Equivalents)･g-1을 사용하였다.
데이터처리
- Same letters on bars represent no significant difference at P = 0.05 by Duncan’s multiple range test.
- Same letters within same concentration represent no significant difference at P = 0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 모든 실험은 최소 3반복 이상 수행되었으며 SPSS Statistics(Version 17.0)의 Duncan’s multiple range test를 이용하여 5% 유의수준에서 처리평균간 차이를 검정하였다.
이론/모형
- 구절초 추출물의 총 항산화력은 Miller et al.(1993)의 방법을 이용하여 측정하였다. 2,2’-azinobi-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS)를 7mM 농도로 증류수에 용해시키고 여기에 최종농도가 2.
- 구절초 추출물의 전자공여능(electron donating ability, EDA)은 Blois(1958)에 의해 소개된 DPPH법으로 측정하였다. DPPH법은 α,α-diphenyl-β-picryl-hydrazyl 전자 소거 특성을 이용한 것으로 가장 광범위하게 항산화 활성을 측정하기 위해 이용되는 방법이다.
- 총 polyphenol 함량은 Folin-Denis법(Singleton and Rossi, 1965)으로 비색 정량하였다. 각 MeOH 추출물과 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH, 잔류 water 분획물을 2mg･mL-1이 되도록 Dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹인 후 0.
성능/효과
- 3). DPPH radical과 polyphenol의 함량과의 관계는 EtOAc 분획물에서 polyphenol 함량이 가장 높고 전자공여능 활성도 높은 것으로 나타났으나, 다른 용매별 분획물은 그에 비례하지 않았다. 이는 polyphenol 화합물의 종류에 따라 다른 전자공여능을 보이고 천연물은 함유된 성분에 따라 상이한 정도의 항산화 활성을 나타낸다는 연구(Park et al.
- 2A). Flavonoid 함량은 EtOAc 분획물이 143mg･g-1으로 가장 높았고 그 다음으로 n-BuOH 분획물이 60mg･g-1로 높았으며 n-hexane, MeOH 추출물, 잔류 water 분획물, CHCl3 분획물 순으로 나왔다(Fig. 2B). 이러한 결과는 Lim et al.
- 구절초의 유효 성분 중 항산화 활성이 있다고 생각되는 주요 flavonoid 성분을 정량 분석하기 위해 HPLC를 이용하였다. 구절초 MeOH 추출물과 EtOAc분획물을 HPLC로 분석한 결과 확인된 flavonoid는 quercetin과 luteolin이었으며 체류 시간은 quercetin이 14.4분, luteolin이 15분이었다(Fig. 5). 표준검량선을 이용해 함량을 계산한 결과 구절초 MeOH 추출물의 quercetin과 luteolin의 함량은 각각 12.
- 구절초 MeOH추출물에 대한 총 항산화력의 측정결과 용매별로 농도가 높아질수록 활성이 증가 하였으며 분획별로는 EtOAc 분획물이 68.12%로 가장 높은 활성을 보였으나 이는 DPPH radical 소거능에서 나타난 활성(81.56%)보다는 다소 낮은 수준이었다(Fig. 4). DPPH법으로 측정한 것과 ABTS법으로 측정한 값에 차이가 나는 것은 두 측정 방법에서 이용되는 라디칼의 종류가 다르고, 페놀물질의 종류에 따라 두 기질에 결합하는 정도의 차이와 라디칼을 제거하는 능력이 다른 때문으로 사료된다(Wang et al.
- 구절초를 MeOH로 추출한 경우 추출 수율이 16%이고, 구절초 MeOH 추출물을 증류수에 현탁시켜 얻은 분획물의 수율은 잔류 water 분획물이 44.3%로 가장 높았고, 그 다음으로 n-hexane 분획물이 19.7%, EtOAc와 n-BuOH 분획물이 8%이었으며 CHCl3 분획물이 6%로 가장 낮은 추출 수율을 보였다(Table 1).
- 2에 나타내었다. 분획물 1g당 polyphenol 함량은 EtOAc 분획물이 195mg･g-1으로 가장 높았으며 그 다음으로 MeOH 추출물이 94mg･g-1으로 높았고 나머지 CHCl3, 잔류 water 분획물, n-BuOH, n-hexane 분획물 순으로 높게 나왔다(Fig. 2A). Flavonoid 함량은 EtOAc 분획물이 143mg･g-1으로 가장 높았고 그 다음으로 n-BuOH 분획물이 60mg･g-1로 높았으며 n-hexane, MeOH 추출물, 잔류 water 분획물, CHCl3 분획물 순으로 나왔다(Fig.
- 표준검량선을 이용해 함량을 계산한 결과 구절초 MeOH 추출물의 quercetin과 luteolin의 함량은 각각 12.95 ± 1.26 mg･g-1, 4.45 ± 0.07mg･g-1 이었고, EtOAc 분획물의 quercetin 과 luteolin의 함량은 20.02 ± 0.23mg･g-1, 1.65 ± 0.02mg･g-1이었다(Table 2).
후속연구
- DPPH radical과 polyphenol의 함량과의 관계는 EtOAc 분획물에서 polyphenol 함량이 가장 높고 전자공여능 활성도 높은 것으로 나타났으나, 다른 용매별 분획물은 그에 비례하지 않았다. 이는 polyphenol 화합물의 종류에 따라 다른 전자공여능을 보이고 천연물은 함유된 성분에 따라 상이한 정도의 항산화 활성을 나타낸다는 연구(Park et al., 2006)와 관련이 있다고 사료되므로 향후 더 연구가 필요하다고 생각된다.
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