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제안 방법
- RT-PCR 분석은 94℃에서 4 min, 35 cycle로 94℃에서 40 sec, 5 5℃~58℃에서 40 sec, 72℃에서 3 min에서 수행하였다. Positive control로서는 housekeeping 유전자인 G3PDH (glyceradehydes-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하였 으며, 프라이머 G3PDH-S (GAA ATC CCA TCA CCA TCT TCC AGG)와 G3PDH-AS (GAG CCC CAG CCT TCT CCA TG)를 사용해 G3PDH를 증폭하였다.
- 또한 붉은 털 원숭이 뇌 조직의 cDNA 라이브러리를 통해 동정된 CCDC94 유전자의 붉은 털 원숭이 내에서의 전사 양상 및 전사의 특징과 인간과의 비교 분석을 위하여 붉은 털 원숭이의 조직(1, 부신; 2, 소뇌; 3, 대뇌피질; 4, 심장; 5, 신장; 6, 간; 7, 폐; 8, 고환; 9, 골격근; 10, 기관; 11, 비장; 12, 결장; 13, 맹장; 14, 위; 15, 췌장; 16, 타액선; 17, 직장; 18, 방광; 19, 십이지장; 20, 공장에서 RNeasy mini kit (Qiagen)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 인간 조직, 1.
- 본 연구를 정리하면, 붉은 털 원숭이의 cDNA 라이브러리를 통하여 R54 전사체 내에 LINE 패밀리인 L2A가 붉은 털 원숭이의 7번 엑손에 삽입되어 엑손화 된 현상을 밝혔다. CCDC94 유전자와 높은 유사성을 가진 R54 전사체는 인간과 붉은 털 원숭이의 조직에서 서로 다른 양상의 유전자의 발현을 보였다.
- 이 가운데 붉은 털 원숭이는 인간과 형태학적, 생리학적, 유전학적으로 가장 유사한 종 중 가장 많이 연구되는 영장류 중 하나이며, 생물의학적으로 적합한 실험 모델로서 보고되고 있다[11]. 본 연구에서는, 붉은 털 원숭이 뇌 조직의 cDNA 라이브러리를 구축하였으며, 이를 통하여 밝혀 지지 않은 전사체의 동정 및 트랜스포존이 삽입되어 형성된 융합 전사체에 대한 구조적인 특징 분석, 유전적 발현 및 진화적인 분석을 고찰하였다.
- 붉은 털 원숭이 뇌조직으로부터 확립한 full-length cDNA library에서 찾아낸 각 전사체를 인간 및 영장류 genomic DNA를 사용하여 각 전사체의 가동성인자의 삽입시기 분석을 위해 PCR 증폭을 하였다. 이들의 프라이머 정보 는 Table 1에서 보여준다.
- 붉은 털 원숭이에서 L2A서열을 가진 R54 전사체와 L2A 서열이 존재하지 않는 인간의 전사체의 발현 양상을 비교하기 위하여, 붉은 털 원숭이의 6번과 8번 엑손에 해당하는 영역에서 프라이머(Table 1)를 디자인하여 인간과 붉은 털 원숭이의 조직에서 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 인간의 조직에서는 L2A의 서열이 빠진 길이(150 bp)의 전사체가 전 조직에서 발현하였으며(Fig.
- 붉은 털 원숭이의 뇌 유래의 cDNA 라이브러리를 통해 발견된 R54 전사체를 인간과 침팬지의 등록된 mRNA서열 alignmnent를 통하여 비교 분석하였다. 원숭이에서는 인간의 4번 엑손이 존재하지 않은 반면에 LINE 가운데 오래된 패밀리 가운데 하나인 L2A의 엑손화 현상으로 인하여, 인간에서는 존재하지 않는 7번 엑손이 붉은 털 원숭이 R54 전사체에서 발견되었다(Fig.
- 붉은 털 원숭이의 뇌 조직 cDNA 라이브러리 구축 붉은 털 원숭이의 뇌 조직에서의 cDNA 라이브러리는 cap trapper method를 사용하여 구축하였으며, 라이브러리 스크리닝을 위하여 클로닝 벡터(pCNS-D2) 양쪽의 서열로부터 Primer쌍 preT7 (5’-CGT GTA CGG TGG GAG GTC TA-3’)와 SP6 (5’-CCT ATT CTA TAG TGT CAC CTA AAT-3’)을 디자인하여 PCR을 통해 스크리닝 한 다음, positive 클론은 Competent cell에 LB 배지에서 배양하였다.
- 추출한 RNA는 cDNA 합성을 위해 DNA-free RNA를 사용했으며, M-MLV (moloney- murine leukemia virus) 역전사 효소(Promega)와 RNase inhibitor (Promega)를 사용하여 합성하였다. 새롭게 찾아낸 각 전사체의 조직 발현을 보기 위해 RT-PCR 증폭을 하였다. 각 유전자들의 프라이머 정보는 Table 1에서 보여준다.
- 추출한 RNA는 cDNA 합성을 위해 DNA-free RNA를 사용했으며, M-MLV (moloney- murine leukemia virus) 역전사 효소(Promega)와 RNase inhibitor (Promega)를 사용하여 합성하였다.
대상 데이터
- 또한 붉은 털 원숭이 뇌 조직의 cDNA 라이브러리를 통해 동정된 CCDC94 유전자의 붉은 털 원숭이 내에서의 전사 양상 및 전사의 특징과 인간과의 비교 분석을 위하여 붉은 털 원숭이의 조직(1, 부신; 2, 소뇌; 3, 대뇌피질; 4, 심장; 5, 신장; 6, 간; 7, 폐; 8, 고환; 9, 골격근; 10, 기관; 11, 비장; 12, 결장; 13, 맹장; 14, 위; 15, 췌장; 16, 타액선; 17, 직장; 18, 방광; 19, 십이지장; 20, 공장에서 RNeasy mini kit (Qiagen)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 인간 조직, 1.부신; 2, 소뇌; 3, 전 뇌; 4, 심장; 5, 신장; 6, 간; 7, 폐; 8, 고환; 9, 기관; 10, 골수; 11, 태아 뇌; 12, 태아 간; 13, 태반; 14, 전립선; 15, 타액선; 16, 골격근; 17, 척수; 18, 흉선; 19, 갑상선; 20, 골수 유래의 total RNA는 Clontech사로부터 구매하였다.
이론/모형
- CCDC94 유전자의 염기서열은 UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu/)의 BLAT(Basic local alignment tool)을 이용하여 분석하였으며, 라이브러리를 통해 밝혀진 전사체 내에 삽입된 전위요소 서열의 분석을 위하여 RepeatMasker 프로그램을 사용하였다(http://repeatmasker. genome.washington.edu).
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