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문제 정의
- 본 연구의 목적은 양극 산화 티타늄 임플란트 표면에 화학적고정 방법 또는 물리적 흡착 방법을 이용한 RGD 펩타이드 코팅이 임플란트의 표면 변화와 인간간엽줄기세포의 부착, 증식, 분화 및 광화에 미 치 는 영향을 비 교, 평 가하는 것이다.
제안 방법
- 3 일, 7일동안배양 후에 증식의 정도를 측정하였다. XTT assay kit (Cell Proliferation Kit Ⅱ, Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 을 사용하였다.
- XTT assay kit (Cell Proliferation Kit Ⅱ, Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 을 사용하였다. XTT 표지시 약(sodium3‘ -[1-[(phenylamino)-car- bonyl]-3, 4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6nitro)benzenesulfonicacidhy- drate) 와 electron coupling reagent (N-methyl dibenzopyrazine methyl sul- fae)을미 리녹여섞은후, well 당 250 M/500 以 농도가 되도록 투여했다. 세포를 37。, 5% CO2 세포 배 양기 에서 2시간 동안 배 양하였다.
- X선광전자분광법 분석에서 물리적 흡착으로 코팅한실험군에서 C와N의 양이 많이 관찰되어 화학적인 방법보다 많은 양의 펩타이드가 코팅된 것을 알 수 있었고, ATPES 처리 이후, Si 원소의 존재로 실란이라는 화학물질이 고정된 것을 확인할 수 있었으며, 펩타이드가 화학적으로 고정 된 이 후에도 Si 원소가 관찰되어 실란이 안정 적 으로 남아있는 것을 확인할 수 있었다. X선광전자분광법 분석은 시편 표면의 7 - 30 nm 정도의 영역만 선택적으로 신호 분석을 하므로, 표면에 펩타이드가 안정적으로 도입이 되었음을 확인하는 방법 으로 적 합하였다.
- X선광전자분광법을 통하여 각 시편의 원소 함량 비율을 관찰하였으며, 이를 백분위 함량으로 정리하였다(Table 2). 실란화합물에서만 선택적으로 존재하는 Si 원소가 APTES 처리를한 시편과 화학적 고정 실험군에서만 나타났다.
- 3, 4 이에 대한 대안으로 화학적 고정 방법이 소개되 었으며, 흡착 방법 에비해 과정 이 복잡하지만 흡착된 단백질보다 화학적 고정 에 의한 단백질의 활성이 더 우수하고, 19 생체화학물질을 특정 배위로 표면에 고정시킬 수 있다. 본 연구에서는 물리적 흡착 및 화학적 고정 방법으로 RGD 펩 타이 드를 코팅 한 표면을 이용하여 인간간엽 줄기세포의 반응실험을 진행하였다.
- 분화 표지 단백질인 osteopontin, collagen type I, osteocalcin의 mRNA 양을정 량중합효소연쇄반응분석(RT-PCR)을통해 즉정하였다. 각각의 단백질에 대한 mRNA의 발현양을 Figs.
- 배 양 배지 는 2 - 3일에 한번씩 교체해 주었다. 분화를 관찰하기 위해서, 세포를 배 양한 후 24시간 뒤 에 골모세 포분화유도배지 (Lonza, Walkersville, MD, USA)로 교체 후 14일, 또는 21일 동안 배양하앗였다. 실험에 사용한 세포는passage 6에서 8까지의 세포를 사용하였다.
- 분화의 마지막 단계인, 칼슘 침착량을 알아보기 위해 각 시편에서 21일 동안 배 양한 후 alizarin red assay를 시 행하였다(Fig. 12). 물리적 흡착 실험군에서 대조군과 화학적 고정 실험군에서 보다 칼슘 침 착량이 유의 할 정도로 증가하였다(戶<.
- Brfrd assay kit (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)을 이용하여 단백질의 양을 측정하고, 동량의 단백질 80 以씩 96-wellplate에 넣은후 50 以의 5 mM p-nitrophenylphosphate를각 well에 넣어주었다. 빛을 차단한 상태로 1시간 동안 실온에 반응시 켜서 p-nitrophenylphosphate가 가수분해되어 형성된 p-nitrophenol를 효소결합면역흡착검사를 이용해 405 nm에서 흡광도를측정하였다.
- 1% TritonX-100 인산완충용액으로 2분간 투과과정을 거 친 뒤, 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세포를 인산완충용액으로희석한50 *gml 농도의 형광phalloi血 공액용액 (Sigma, Castle Hill, Australia)으로 actin filament를 대상으로 암실조건에서 염색시켰다. 여러번 인산완충용액로 세척하고 고정용액 (Dako North America Inc.
- 세포의 형태를 관찰하기 위해서 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였다. 세포를 파종한 후 2시 간과 24시간 뒤 에 시편을 인산완충용액으로 세척하여 배지를 제거하였다.
- 시편을 UV/O cleaner (Jelight Co. Inc., Irvine, CA, USA) 를통해표면을 활성 화시 킨 후, 실란의 도입 을 위해 aminopropyHriethoxysilane(APTES)을 2.5% (v/v)농도로 에탄올로 희석한 용액에 90분간 침지하였다. 이후 시편 표면을 에탄올로 세척한 후 질소로 건조하고, 110。。의 오븐에서 1시간동안건조시켰다.
- 세 포를 인산완충용액으로2회 수세하고70% 에탄올로-20。에서 1시간동안고정한후수회 증류수로 수세하였다. 실온에서 15분간 40 mM alizarin red S (Sigma, Castle Hill, AustraEa)로염색후, 남은 용액을 제거한뒤 여러 번 증류수로 수세하였다. 염료를 10% cetylpyridinium chloride (Sigma, Castle Hill, AustraEa)에서 1시간 동안 녹여 낸 다음, 효소결합면역흡착검사를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포를 인산완충용액으로희석한50 *gml 농도의 형광phalloi血 공액용액 (Sigma, Castle Hill, Australia)으로 actin filament를 대상으로 암실조건에서 염색시켰다. 여러번 인산완충용액로 세척하고 고정용액 (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) 으로 고정한 뒤, 공초점 레이저 현미경 (LSM 700, Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany) 을 이용하여 세 포의 모양을 관찰하였다.
- 실온에서 15분간 40 mM alizarin red S (Sigma, Castle Hill, AustraEa)로염색후, 남은 용액을 제거한뒤 여러 번 증류수로 수세하였다. 염료를 10% cetylpyridinium chloride (Sigma, Castle Hill, AustraEa)에서 1시간 동안 녹여 낸 다음, 효소결합면역흡착검사를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 코팅 을 하지 않은 양극산화 티 타늄 디 스크를 대 조군으로 사용하였으며, 펩타이드를 화학적 고정, 물리적 흡착 방법으로코팅한 시편을실험군으로 하였다.
- , Daejon, Korea) 을 사용하였다. 펩타이드는 N-CAAALLLKERGDSK-C 배열로 RGD 기 반의 14개의 서 열로 되어 있으며, 탄소 말단에 펩타이 드의 코팅 여부 확인을 위해 형 광 표지자로서 fluorescenceisothiocy- nate (FITC)를 연결하였다. 합성 된 RGD 펩타이 드는 고성 능 액체크로마토그래 피 (HPLC)를 통해 86%의 순도로 평 가되 었으며 , 동결 건조 되고 빛이 차단된 상태로 -20^에서 보관된 것을 사용하였다.
- 형광현미경 (Nikon instruments inc., Melville, NY, USA) 으로 이미지를 촬영하여 위치 별 밝기를 해석하고 코팅의 균일성을 확인하였다. 이때 9개의 기준용액을큐벳(cuvette)에 넣은 후형 광분 광기 (fluorescence spectroscopy; FP-6500, JASCO, Tokyo, Japan) 를이용하여 여기 파장은 495 nm, 발광 파장은 516 nm 조건으로 파장을 측정하여 농도와 파장 관계의 표준 곡선을 작성하여 정량에 이용하였다.
- 화학적 고정과 물리적 흡착을 통해 펩타이드를 코팅한 시편의 표면 구조를 평가하기 위하여 전계 방출형 주사전자현미경 (FE-SEM; Stereoscan440, Leica Cambridge, England)을 이용하여 50, 000 배로관찰하였다.
- 염 색된 세포를 95% 에탄올로 실온에서 최소 15분간 용해시켜 96-well plate에 담았다. 효소결합면역흡착검사 (ELISA; Spectra MAX 250s Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)을이용하여 590 nm에서 흡광도를측정하였다.
대상 데이터
- 합성 된 RGD 펩타이 드는 고성 능 액체크로마토그래 피 (HPLC)를 통해 86%의 순도로 평 가되 었으며 , 동결 건조 되고 빛이 차단된 상태로 -20^에서 보관된 것을 사용하였다. 보관 중인 RGD 펩타이드는 실험 직전에 증류수 및 완충 용액 에 녹여 1회 한정하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 합성 RGD 펩타이 드(Peptron Inc., Daejon, Korea) 을 사용하였다. 펩타이드는 N-CAAALLLKERGDSK-C 배열로 RGD 기 반의 14개의 서 열로 되어 있으며, 탄소 말단에 펩타이 드의 코팅 여부 확인을 위해 형 광 표지자로서 fluorescenceisothiocy- nate (FITC)를 연결하였다.
- 분화를 관찰하기 위해서, 세포를 배 양한 후 24시간 뒤 에 골모세 포분화유도배지 (Lonza, Walkersville, MD, USA)로 교체 후 14일, 또는 21일 동안 배양하앗였다. 실험에 사용한 세포는passage 6에서 8까지의 세포를 사용하였다.
- 양극산화처리를시행한직경 12.0 mm, 두께 3.0 mm 크기의 티타늄 디 스크를 시 편으로 사용하였다(0.1 M H2SO4, 0.1 M HPQ, 3 A, 180 volt : Cowellmedi Co., Pusan, Korea).
- 펩타이드는 N-CAAALLLKERGDSK-C 배열로 RGD 기 반의 14개의 서 열로 되어 있으며, 탄소 말단에 펩타이 드의 코팅 여부 확인을 위해 형 광 표지자로서 fluorescenceisothiocy- nate (FITC)를 연결하였다. 합성 된 RGD 펩타이 드는 고성 능 액체크로마토그래 피 (HPLC)를 통해 86%의 순도로 평 가되 었으며 , 동결 건조 되고 빛이 차단된 상태로 -20^에서 보관된 것을 사용하였다. 보관 중인 RGD 펩타이드는 실험 직전에 증류수 및 완충 용액 에 녹여 1회 한정하여 사용하였다.
데이터처리
- 0, SPSS, USA)를 사용하여 통계 처 리하였다. Kruskal-Wis test로 유의성을 검증하였고, 사후검정은 Bofrroni test를 시행하였다(F<.05).
- 위의 과정으로 확보된 RT-PCR mixture에 다음조건의 20 pmole의 primer를 넣었다(Table 1). Real-Time PCR System 7300 (Applied Biosystem, Foster city CA, USA) 을이용하여 RTPCR을실시하였고, delta-delta Ct method로 결과를 분석하였다.
이론/모형
- 분화를 통해 세 포에 침착된 칼슘의 양을 측정 하기 위해 alizarin red S stain 법을 이용하였다. 24-well plate에 0.
- 세포의 부착에 대한 정 량적 특성을 평가하기 위해 crystal violet assay를 시 행하였다. 각각의 시편이 들어있는 24-well plate에 4 X 104/well의 세포를 파종한 후 배 양하였다.
- 코팅에 따른 시편의 표면 원소 변화를 평가하기 위해서 X선 광전자 분광법 (XPS; X-ray photonic spectrometry, ESCA, Sigma Probe, ThermoVG, West Sus-sex, UK)를 이용하여 분석을 시행하였다.
성능/효과
- 또한 물리적 흡착 실험군과 마찬가지로 부분적으로 어두운 부분이 나타나며, 세척 과정이 들어갔기 때문에 점의 비율은 적게 나타났다. X선광전자분광법 분석에서 물리적 흡착으로 코팅한실험군에서 C와N의 양이 많이 관찰되어 화학적인 방법보다 많은 양의 펩타이드가 코팅된 것을 알 수 있었고, ATPES 처리 이후, Si 원소의 존재로 실란이라는 화학물질이 고정된 것을 확인할 수 있었으며, 펩타이드가 화학적으로 고정 된 이 후에도 Si 원소가 관찰되어 실란이 안정 적 으로 남아있는 것을 확인할 수 있었다. X선광전자분광법 분석은 시편 표면의 7 - 30 nm 정도의 영역만 선택적으로 신호 분석을 하므로, 표면에 펩타이드가 안정적으로 도입이 되었음을 확인하는 방법 으로 적 합하였다.
- 각시편에서 3일과 7일 동안 세포배 양후XTT assay를 이용해 세포증식 정도를 측정한 결과(Fig. 7), 배 양 3일째와 7일째 모두 대조군, 각 실험군 사이의 세포증식 정도가 유의할만한 차이를 보이지 못했다 (F>.05).
- 골 모세포의 분화 초기에 발현되는 collagen type I, osteopontin, osteocalcin 의 mRNA 양이 증가했으며, ALP activity 또한 14일째에 유의하게 증가하였다. 골모세 포의 분화 마지 막 단계 인 광화정도를 살펴보는 alizarin red assay에 의한결과또한물리적 흡착실험군에서 석회화 정도가 유의하게 증가되었다.
- 골 모세포의 분화 초기에 발현되는 collagen type I, osteopontin, osteocalcin 의 mRNA 양이 증가했으며, ALP activity 또한 14일째에 유의하게 증가하였다. 골모세 포의 분화 마지 막 단계 인 광화정도를 살펴보는 alizarin red assay에 의한결과또한물리적 흡착실험군에서 석회화 정도가 유의하게 증가되었다. 많은 연구에서 RGD 펩타이드의 세포 부착에 관한 효과에 대해서 보고되고 있지만, 15, 16 세포 분화에 대한 효과에 대해서는 연구가 많지 않았다.
- 3, 4에 나타내었다. 대조군에서는 형광이 나타나지 않았으며, 펩 타이 드가 코팅 된 실험 군 모두 명 확하게형광을 나타내었다. 물리적 흡착 실험군에서는 높은 형광의 밝기가 나타났으며, 일부 점 형태의 좀 더 녹색을 띄는 부분이 관찰 되 었다.
- 11에 나타내었다. 배양 14일째, 물리적 흡착 실험군에서 대조군과 화학적 고정 실험군보다 유의성 있게 ALP activity가 높아진 것을 확인할 수 있었다(P<.05).
- 본 연구를 통하여 RGD 펩타이 드를 양극 산화 임플란트에 코팅 함으로써 인간간엽줄기세포의 반응에 영향을 주어 임플란트의 골유착을 증진시킬 수 있는 가능성을 확인하였으며, 특히 많은 양의 펩타이드를 코팅할 수 있었던 물리적 흡착 방법이 화학적 고정 방법보다인간간엽줄기세포의 반응에 더욱효과적 이 라고 판단된다.
- 본 연구에서 더 많은 양의 펩타이드를 고정 할 수 있었던 물리적 흡착 실험군이 대조군과 화학적 고정 실험군보다 인간간엽줄기세포의 분화에 효과적 이 었음을 알 수 있었다. Yang 등24 은 RGD 펩타이 드의 농도가 증가될수록 골수줄기세 포의 골형성 표지자인 osteocalcin의 발현양과 alkaline phosphatase의 activity 가 증가되 었다고 보고하였다.
- 실험 시편을 제작하고 표면 특성을 살펴보기 위해 형광 현미 경으로 관찰하고, X선광전자분광법을 통하여 성 분을 분석한결과, 두 가지 방법 모두에서 RGD 펩타이드의 코팅을확인할 수 있었다. 형광 현미경 관찰에서 물리적 흡착 실험군은 전체적으로 밝기가 높게 나타나며 부분적 인 단파장에 가까운 녹색점과 약간 어두운 영역들이 관찰되었다.
- 인간간엽줄기세포를 이용한 본 실험에서는 물리적 흡착 실험군에서 대조군과 화학적 고정 실험군보다 세포의 분화와 관련된 지표에서 유의 할 정도로 향상된 결과를 보였다. 골 모세포의 분화 초기에 발현되는 collagen type I, osteopontin, osteocalcin 의 mRNA 양이 증가했으며, ALP activity 또한 14일째에 유의하게 증가하였다.
후속연구
- 또한 RGD 펩타이 드에 proteoglycan。] 나, heparin, hydroxyapatite 등을 함께 적 용하였을 때 RGD 펩타이드만를 코팅 한 경 우보다 줄기 세 포의 부착과 증식을 보다 향상시킬 수 있었다는 연구가 있었다.21 따라서 본 연구에서 사용한인 간간엽 줄기 세 포의 부착과 증식 을 향상시 키 기 위해 서 는 RGD 펩타이드와 병행하여 부가적 인 코팅 물질이 추가되어 야할 것으로 예상되며, 이에 대한 구체적 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
- 하지만 Sawyer 등25의 연구에서는 소태아혈청과RGD 펩타이드를 함께 사용한 실험군에서 높은 RGD 펩타이 드 농도가 세포의 초기 부착과 증식을 방해 할수 있다고 보고한 바 있다. 따라서 RGD 펩타이 드의 적절한 농도와 펩타이드와 함께 적용할 수 있는 단백질 군과의 상호 작용에 대한 보다 진전된 연구가 필요하다고 생각된다. 또한 세포 반응 연구에 한정하지 않고 적절한 동물 모델을 이용한 성능및 유효성 평가를통하여 더욱구체적인 검증을해 볼필요가있을것이다.
- 따라서 RGD 펩타이 드의 적절한 농도와 펩타이드와 함께 적용할 수 있는 단백질 군과의 상호 작용에 대한 보다 진전된 연구가 필요하다고 생각된다. 또한 세포 반응 연구에 한정하지 않고 적절한 동물 모델을 이용한 성능및 유효성 평가를통하여 더욱구체적인 검증을해 볼필요가있을것이다.
- 본 연구에서는 양극 산화 임플란트에 대한RGD 펩타이드의코팅을 시행했을 때 인간간엽줄기세포의 부착과 증식에 대해서는 대조군과 비교하여 별다른 차이를 나타내지 못하였다. 양극 산화 표면처리를 한 경우 나노 단위의 다공성 표면을 형성하게 되는데, 5 기존 실험의 machined sufce에 대한 부착실험에 대하여 임 플란트 표면의 구조 특성 차이가 세 포의 부착에 영향을 주었을 가능성 에 대해서 생각해 볼 수 있다.
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