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문제 정의
- 그러나 화피의 충치균 및 치주질환에 관련한 항균활성이나 항염효과에 관한 연구는 보고된 바가 없어서 실험을 통하여 지견을 얻었기에 보고한다.
제안 방법
- 의 방법에 준하여 측정하였다. 37℃에서 24시간 배양한 S. mutans 및 P. gingivalis 균액을 각각 Table 1에서와 같이 BHI broth 및 조제배양액에 약 103 CFU/ml 되도록 접종한 후 멸균된 시험관에 무균적으로 분주하고 각 추출액을 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2 및 1.6 ㎍/ml 되도록 첨가한 후 37℃에서 혐기성배양기 (Model Bactron I, Sheldon Mfg. Co., Comelius, OR, USA)에서 3일간 배양하여 spectrophotometer (Genesys 5, Milton Roy Co., PA, USA)로 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 0)중에 0℃에서 45초 동안 전동 homogenizer로 균질화한 후 4℃에서 3,000 rpm으로 20분간 원심분리 하였다. MPO 활성도를 측정하기 위하여 96-well microtiter plate에 상층액 50 ㎕와, 50 ㎕의 phosphate buffer 함유 0.5% HTAB (pH 6.0), 50 ㎕의 o-dianisidine (0.68 mg/ml in distilled water)을 첨가하고 반응을 촉진하기 위하여 새로 조제한 0.003% hydrogen peroxide를 가하였다. 그리고 450 nm에서 흡광도차를 이용하여 계산하였다.
- 쥐가 물을 자유롭게 마시도록 하며 18시간 절식시키고, 생리식염수 (saline) 및 각 추출물을 농도별 (5, 10, 50, 100 mg/kg)로 경구 투여한 1시간 후 ketamine HCl (30 mg/kg)과 xylazine (6 mg/kg)을 근육 주사하여 마취시킨 뒤, trypsin (500 pmol)을 생리식염수에 녹여 100 ㎕씩 쥐의 뒷다리 발바닥에 주사하였다. 부종의 크기는 쥐의 발바닥 주사직전과 1시간 후에 plethysmometer (Ugo Basile Co., Comerio, VA, Italy)을 이용하여 측정하였으며 전후 차이로 계산하였다. 부종 억제율은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
- 상기와 같이 37℃에서 24시간 배양한 S. mutans 및 P. gingivalis균 액을 각각 BHI broth 및 조제배양액에 약 103 CFU/ml 되도록 접종한 후 멸균된 시험관에 무균적으로 분주하고 각 추출액을 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 및 3.2 ㎍/ml 되도록 첨가한 후 37℃에서 혐기적으로 3일간 배양하여 pH meter (701A, Orion Co., MA, USA)로 pH를 측정하였다.
- 실험용 화피를 세절한 후 환류냉각장치에 각기 5배량의 증류수, 80% 메탄올 및 80% 에탄올을 넣어 각각 3시간씩 가열 추출하고 여과한 뒤 감압 농축한 다음 동결 건조하여 시료로 사용하였다. 용매별 수득량은 Table 2와 같다.
- 쥐가 물을 자유롭게 마시도록 하며 18시간 절식시키고, 생리식염수 (saline) 및 각 추출물을 농도별 (5, 10, 50, 100 mg/kg)로 경구 투여한 1시간 후 ketamine HCl (30 mg/kg)과 xylazine (6 mg/kg)을 근육 주사하여 마취시킨 뒤, trypsin (500 pmol)을 생리식염수에 녹여 100 ㎕씩 쥐의 뒷다리 발바닥에 주사하였다. 부종의 크기는 쥐의 발바닥 주사직전과 1시간 후에 plethysmometer (Ugo Basile Co.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 화피는 전주시 보화당약업사에서 구입한 것 중 정품만을 선별하여 세절한 후 각기 5배량의 증류수, 80% 메탄올 및 80% 에탄올을 넣어 3시간 환류냉각장치 하에서 가열 추출하고 여과한 뒤 감압 농축한 다음 동결 건조하여 각기 물엑스 (WX), 메탄올엑스 (MX) 및 에탄올엑스 (EX)를 만들어 이것들을 희석하여 시료 (BCX)로 사용하였다. Streptococcus mutans ATCC25175 및 Porphyromonas gingivalis ATCC33277 표준균주는 한국미생물보존센터 (서울시 서대문구)에서 구입하여 사용하였으며, 세균배양 및 보존에는 Table 1과 같이 각각 BHI (Difco Co, USA) 및 조제 배지를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 화피는 전주시 보화당약업사에서 구입한 것 중 정품만을 선별하여 세절한 후 각기 5배량의 증류수, 80% 메탄올 및 80% 에탄올을 넣어 3시간 환류냉각장치 하에서 가열 추출하고 여과한 뒤 감압 농축한 다음 동결 건조하여 각기 물엑스 (WX), 메탄올엑스 (MX) 및 에탄올엑스 (EX)를 만들어 이것들을 희석하여 시료 (BCX)로 사용하였다. Streptococcus mutans ATCC25175 및 Porphyromonas gingivalis ATCC33277 표준균주는 한국미생물보존센터 (서울시 서대문구)에서 구입하여 사용하였으며, 세균배양 및 보존에는 Table 1과 같이 각각 BHI (Difco Co, USA) 및 조제 배지를 사용하였다.
- 실험용 동물로는 Sprague-Dawley계 숫컷 흰쥐를 대한바이오링크 (충북 음성군)에서 구입하여 180±20 g인 것을 실험실 환경에서 충분한 사료와 물을 공급하면서 적응시킨 후에 실험에 사용하였으며, 본 연구는 우석대학교 동물 윤리위원회 규정에 따라 실시하였다.
데이터처리
- 실험성적은 평균치 ± 표준오차 (mean ± SE)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균차이는 student's t-test로 분석하여 p<0.05일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- Trypsin주사에 의한 혈관투과성은 Katayama등30)의 방법에 따라 측정하였다. 생리식염수 및 각 추출물을 농도별로 경구투여하고 1시간 뒤, 2.
- 생리식염수 및 각 추출물을 농도별로 경구 투여한 1시간 후 trypsin을 쥐 발바닥에 주사하여, 6시간 후 쥐 발바닥을 절취하여 무게를 측정하고 myeloperoxidase (MPO) 활성도를 Bradley등31)의 방법에 따라 수행하였다. 발바닥 조직을 잘게 썰어서 0.
- 조제된 각 추출물의 최소발육저지농도 (minimal inhibitory concentration; MIC) 측정은 Lorian28)와 Murray29)의 방법에 준하여 측정하였다. 37℃에서 24시간 배양한 S.
성능/효과
- PAR-2 효능약물인 trypsin으로 유발된 쥐의 뒷발바닥 부종은 생리식염수 단독 처리 시보다 유의성 있게 증가하였다. Trypsin으로 유발된 부종을 보면 각 추출물 50 mg/kg과 100 mg/kg에서 유의성 있는 억제율을 보였으나 50 mg/kg 이상에서는 큰 차이가 나지 않았으며, 10 mg/kg이하에서는 유의성이 보이지 않았다.
- PAR-2 효능약물인 trypsin으로 유발된 쥐의 뒷발바닥 부종은 생리식염수 단독 처리 시보다 유의성 있게 증가하였다. Trypsin으로 유발된 부종을 보면 각 추출물 50 mg/kg과 100 mg/kg에서 유의성 있는 억제율을 보였으나 50 mg/kg 이상에서는 큰 차이가 나지 않았으며, 10 mg/kg이하에서는 유의성이 보이지 않았다. 이때 증류수 추출물과는 달리, 80% 메탄올 및 80% 에탄올 추출물의 경우는 큰 차이는 없었다(Fig.
- gingivalis)에 대하여 MIC 측정법으로 항균효과를 측정한 결과, 각 균 모두가 에탄올 추출물 (BCX)의 경우에 가장 항균효과가 컸다. pH 변화를 조사한 결과 S. mutans에 대하여 BCX 50 ㎍/ml 이상의 농도에서 pH 값이 유의성 있게 높아졌으나 50 ㎍/ml 이상의 농도에서는 큰 변화를 나타내지 않았으며, P. gingivalis에 의한 pH값의 변화에서 유의성은 없었다.
- 각 추출물 (BCX)에 대한 농도별 pH변화를 보면 S. mutans에 대해서는 BCX 농도가 50 ㎍/ml 이상의 경우 control에 비해 유의성 있는 pH의 상승을 나타내었으나, P. gingivalis에 대해서는 농도에 따른 유의성 있는 변화가 보이지 않았다. 이는 충치의 발생은 구강미생물이 생산하는 산에 의해 치면이 탈회되어 발생한다는 보고33,34)와 일치한다고 볼 수 있으며, 치주질환 균은 산의 생성에 직접 관련성을 갖지는 않는 것으로 생각된다.
- gingivalis 균에 첨가하여 배양이 끝난 액체배지의 pH를 측정한 결과는 Table 4와 같다. 각 추출물로 S. mutans와 함께 배양했을 때는 농도에 따라 pH가 6.10으로부터 점차 증가하여 각 추출물의 농도 (㎍/ml)가 50.0과 100.0에서 유의성을 나타냈다. 그러나 P.
- 각 추출물의 최소발육저지농도 (Minimal Inhibitory Concentration; MIC) 측정결과를 보면 ethanol추출물의 경우가 S. mutans와 P. gingivalis 모두에 대해 가장 항균력이 좋았으며 MIC (㎍/ml)는 각기 100과 50이었다. 이는 方藥合編의 藥性歌32)에 ‘得酒醋良’이라 하여 술을 첨가하면 더 효과가 양호하다는 내용과 맥락을 같이 한다고 보여 진다.
- Trypsin을 500 pmol씩 쥐 발바닥에 주사한 1시간 후 Evans blue의 투과성이 뚜렷하게 높아졌다. 그러나 쥐 발바닥 조직의 Evans blue 혈관 투과성을 보면 부종억제율에서와 같이 각 추출물 50 mg/kg과 100 mg/kg에서 유의성 있는 억제율을 보였으나, 50 mg/kg 이상에서의 억제율은 큰 차이를 나타내지 않았다(Fig. 2).
- 또한 proteinase-activated receptor-2 (PAR-2)에 의한 흰쥐 뒷발바닥 부종모델에서 BCX를 경구 투여한 경우, trypsin으로 유발된 발바닥 부종, 혈관투과성, myeloperoxidase 활성도에서 모두 유의성 있는 억제율을 보여 항염증 활성이 뚜렷함을 나타냈다. 이런 결과로 보아 화피는 충치예방 및 염증질환 치료에 효과가 있는 약물임을 알 수 있었다.
- 또한 trpysin으로 유발된 쥐의 발바닥부종, 혈관투과성의 활성도에서 BCX 50 및 100 mg/kg 투여 시 유의성 있는 감소율을 보였다. 이 실험에서 BCX 100 mg/kg이상의 고용량에서도 50 mg/kg의 경우와 큰 차이를 보이지는 않았다.
- 이 실험에서 BCX 100 mg/kg이상의 고용량에서도 50 mg/kg의 경우와 큰 차이를 보이지는 않았다. 또한 trypsin으로 유발된 염증조직에서 조직손상에 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 MPO활성을 조사하였는데, 상기 염증조직에서는 MPO활성이 현저히 증가하였으나 BCX 투여로 유의성 있게 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 trypsin과 같은 PAR-2 효능약의 주사로 쥐 발바닥에서 혈관투과성이 증가하여 부종으로 나타난다는 연구결과35,36)와 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 생리식염수 및 각 추출물을 농도별로 경구 투여한 1시간 후 trypsin을 쥐 발바닥에 주사하여, 6시간 후 쥐 발바닥 무게를 측정하고 myeloperoxidase (MPO) 활성도를 측정한 결과 각 추출물 50 mg/kg과 100 mg/kg에서 유의성 있는 MPO활성 억제효과를 나타냈는데, 50 mg/kg 이상의 경우 MPO활성억제율도 부종이나 혈관투과성의 경우와 마찬가지로 큰 차이를 나타내지 않아 각 추출물 50 mg/kg 이상에서는 활성도에 큰 영향이 없음을 알 수 있었다. 그러나 용매별로 비교적 큰 차이를 보여 에탄올 추출물의 경우에 뚜렷한 억제효과를 보였다(Fig.
- 수득량은 용매별로 80% methanol > 80% ethanol > water 순으로 methanol 추출량이 제일 높았다.
- 樺皮(Betulae Cortex)의 용매별 수득량은 80% methanol로 추출할 때가 가장 많았다. 용매별로 얻어진 추출물을 이용하여 충치균 (S. mutans) 및 치주질환균 (P. gingivalis)에 대하여 MIC 측정법으로 항균효과를 측정한 결과, 각 균 모두가 에탄올 추출물 (BCX)의 경우에 가장 항균효과가 컸다. pH 변화를 조사한 결과 S.
- 또한 proteinase-activated receptor-2 (PAR-2)에 의한 흰쥐 뒷발바닥 부종모델에서 BCX를 경구 투여한 경우, trypsin으로 유발된 발바닥 부종, 혈관투과성, myeloperoxidase 활성도에서 모두 유의성 있는 억제율을 보여 항염증 활성이 뚜렷함을 나타냈다. 이런 결과로 보아 화피는 충치예방 및 염증질환 치료에 효과가 있는 약물임을 알 수 있었다.
- 따라서 이미 그 효과가 발표된 약재 이외에 새로운 천연약물을 찾는 것은 뜻이 있는 일이라고 생각된다. 화피는 한의학이론에 따라 각종 염증이나 잇몸 질환에 복용하거나 외용해오고 있어 그 효과여부를 실험한 결과 충치균 (S. mutans) 및 치주질환균 (P. gingivalis)에 대한 항균활성과 항염효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 화피를 추출하기 위하여 증류수, 80% 메탄올과 80% 에탄올을 이용하여 각기 가열 추출한 결과 수득량은 증류수 추출물이 제일 적었고 메탄올 추출물이 가장 많았다.
후속연구
- 이를 차단하기 위한 일환으로 BCX를 투여하면 trypsin으로 유발된 PAR-2의 생성을 억제함으로써 항염증효과를 나타내는 것으로 보인다. 그러나 화피의 어떤 성분이 이러한 효과를 나타내는 지에 대해서는 더 연구가 진행되어야 할 것이다.
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