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문제 정의
- 본 연구에서는 백련 잎을 이용하여 마리네이드 소스가 첨가된 쇠고기에서의 돌연변이원성 억제능력과 발암가능성 물질인 HCAs의 생성 억제 효과를 알아보았다. Choi 등(2009)의 연구에서와 같은 추출 방법으로 백련 잎의 ethanol, ethyl acetate, butanol, water fraction을 얻을 수 있었다.
- 이러한 백련 잎의 항산화 효과에 대한 사전 연구 결과를 바탕으로, 본 연구에서는 백련 잎 추출물이 가열한 쇠고기 스테이크에서의 HCAs 형성과 돌연변이원성에 미치는 영향에 대하여 평가하였다.
가설 설정
- 1)Data represent the mean and standard deviation (n=3). Means in the same columns bearing different superscripts differ significantly (p<0.
- 1)Values are expressed on a cooked beef basis. Means in the same columns bearing different superscripts differ significantly (p<0.
제안 방법
- 1 M HCl(6:4, v/v)을 5 mL씩 3회 가한 후 H2O 2 mL을 첨가하여 미리 활성화시킨 Bond-Elut PRS 컬럼에 통과시켰다. 그 다음 CH2Cl2: Toluene(95:5, v/v)을 Chem Elut Extraction cartridges에 20 mL 씩 3회 가하여 활성화된 Bond-Elut PRS 컬럼에 용출된 분석물을 통과하도록 하였다. Bond-Elut PRS 컬럼에 H2O을 5 mL씩 3회 가하여 washing한 후 MeOH 5 mL와 H2O 5 mL로 미리 활성화시킨 C-18 cartridge을 연결시키고 0.
- 소스는 Table 1에 나타낸 재료와 분획물을 첨가하여 제조하였다. 돌연변이원성 실험에는 butanol fraction(0.5, 1.0, 2.0, 4.0 g), ethyl acetate(2.0 g), ethanol(2.0 g), water fraction( 2.0 g)을 첨가하여 각각의 소스를 제조하였고 발암가능성 물질 HCAs의 생성 억제 실험을 위해 water fraction (2.0, 4.0, 8.0 g)을 첨가하여 농도 별로 기능성 소스를 제조하였다.
- 동결 건조된 고기에서 HCAs을 정제 추출하기 위해서 Gross와 Gruter(1992)의 고체상 추출방법을 변형하여 사용 하였다. 시료를 4 g을 취하고 1 M NaOH 16 mL을 가하여 3시간 동안 sonication(JAC Ultrasonic 2010, Kodo Co.
- 동결 건조된 쇠고기를 고체상 추출방법(SPE)을 이용하여 정제 추출하였고 이 정제추출물을 이용하여 쇠고기의 HCAs 형성 억제효과 평가를 알아보았다. 첨가한 백련 잎 fraction은 식용이 가능한 water fraction을 사용하였다.
- 첨가한 백련 잎 fraction은 식용이 가능한 water fraction을 사용하였다. 백련 잎 water fraction을 첨가하지 않은 쇠고기 100 g에 HCAs의 표준용액을 spike하여 전처리를 한 후, 회수율을 구하였다. 전체회수율은 31-76%이며, PhIP는 37±4%의 낮은 회수율을 나타내었고 그 밖에는 약 70% 이상의 회수율을 보여주었다.
- 쇠고기 등심 100 g을 이용하여 대조군(백련 잎 추출물을 첨가하지 않음)과 각각의 분획물이 첨가된 발암가능성 물질 생성 억제 기능성 소스들에 재워 4시간 동안 0℃에서 냉장 숙성한 실험 군을 준비하였다. 이 시료들은 표면 온도가 190℃와 225℃인 Teflon-coated electric frying pan(Chefline Corp.
- 일상 생활에서 섭취하는 가열한 생선, 육류 등의 고단백질 식품에서는 돌연변이원, 발암가능성 물질인 heterocyclic amine류가 생성된다. 안전성 측면을 고려하고자 백련 잎을 이용한 마리네이드 소스를 첨가하여 쇠고기의 HCAs의 형성억제효과와 돌연변이원성 억제효과를 알아보았다.
- 쇠고기 등심 100 g을 이용하여 대조군(백련 잎 추출물을 첨가하지 않음)과 각각의 분획물이 첨가된 발암가능성 물질 생성 억제 기능성 소스들에 재워 4시간 동안 0℃에서 냉장 숙성한 실험 군을 준비하였다. 이 시료들은 표면 온도가 190℃와 225℃인 Teflon-coated electric frying pan(Chefline Corp., Korea)에 양면을 10분간 가열하였다. 조리 시간 중 프라이팬의 가열 온도 측정에는 철 표면온도계를 사용하였고, 쇠고기의 내부온도는 surface temperature thermometer(Trend Instruments Inc.
- 05) 돌연변이원성 억제효과를 나타내었다. 이러한 결과를 바탕으로 ethanol, ethyl acetate, water fraction 2.0 g을 각각 첨가한 마리네이드 소스를 제조하여 쇠고기 스테이크를 위와 같은 조건으로 조리하여 돌연변이원성 억제효과를 평가하였으며 buthanol fraction을 첨가한 결과와 비교하였다. 각 용매 분획물의 마리네이드 소스를 처리한 고기를 225℃에서 가열한 결과 butanol fraction의 돌연변이원성 억제효과는 61.
- , Korea)에 양면을 10분간 가열하였다. 조리 시간 중 프라이팬의 가열 온도 측정에는 철 표면온도계를 사용하였고, 쇠고기의 내부온도는 surface temperature thermometer(Trend Instruments Inc., USA)를 사용하여 측정하였다. 가열된 고기는 잘게 자른 뒤 -70℃ deep freezer에 3시간 동안 냉동한 후, 동결건조기(Labconco, Kansas City, MO, USA)를 이용하여 건조시킨 다음, 막자사발과 블렌더(Hanil Electronics, Korea)를 이용하여 잘게 부수었다.
대상 데이터
- 3종의 HCAs 표준물질(MeIQx, DiMeIQx, PhIP)은 Toronto Research Chemicals Inc.(Canada)에서 구입하였으며, Polysulfonic acid(PRS) Bond Elute Columns(500 mg), C-18 cartridge (100 mg), Extrelut-20 columns은 Varian (USA)사로부터 구입하여 사용하였다. 내부표준물질인 caffeine은 Sigma사 (USA)에서 구입하였다.
- (Canada)에서 구입하였으며, Polysulfonic acid(PRS) Bond Elute Columns(500 mg), C-18 cartridge (100 mg), Extrelut-20 columns은 Varian (USA)사로부터 구입하여 사용하였다. 내부표준물질인 caffeine은 Sigma사 (USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에 사용된 백련 잎은 전남 무안에서 구입하였으며, 진간장, 청주, 후추, 양파, 생강, 참기름, 배, 설탕, 통깨, 마늘, 레몬쥬스, 올리고당, 쇠고기 등심(호주산)은 서울에 위치한 롯데마트(Korea)에서 구입하였다. 3종의 HCAs 표준물질(MeIQx, DiMeIQx, PhIP)은 Toronto Research Chemicals Inc.
- 기울기 용매조건 초기와 0-15분 동안에는 이동상 A를 88%, 15-25분 동안에는 50%, 25-33분 동안에는 88%로 설정하여 흘려주었으며, 컬럼의 재평형을 위해 15분간 88%로 흘려주었다. 사용된 질량 분석기는 Agilent 1100 series LC-MSD이었으며, 이온화는 양이온(positive ion) 방법의 전자 분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 이었다. quadrupole mass analyzer와 연결된 질량분석기를 사용하였으며, capillary voltage와 nebulizer pressure은 4 kV와 30 psig이었고 drying gas flow와 drying gas temperature는 600 L/h와 350℃이었다.
데이터처리
- 각 군간의 측정치 비교는 oneway analysis of variance(ANOVA)를 시행하였으며 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의미를 부여하였다.
- 05에서 의미를 부여하였다. 결과의 비교를 위해 Student-Newman-Keuls test를 이용하였으며 돌연변이원성 시험은 용량반응곡선의 선형회귀분석(liner regression analysis)을 통해 육류의 역 돌연변이 집락을 계산하였다.
- 모든 실험 data는 3회 반복한 것이며 window용 Sigma- Stat 2.0(Jandel Co., USA)를 이용하여 실험 군 간의 통계학적 분석이 이루어졌다. 각 군간의 측정치 비교는 oneway analysis of variance(ANOVA)를 시행하였으며 유의성은 신뢰구간 p<0.
이론/모형
- 돌연변이원성 시험은 Ames 등(1975)의 방법에 따라 S-9 mixture(Molecular Toxicology Inc., USA)존재 하에서 S. Typhimurium TA98(Molecular Toxicology Inc., USA)를 균주로 사용하여 행하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO)는 negative control(spontaneous revertant colonies)로서 사용되었고 2-aminoanthracene는 S.
- Typhimurium TA98 균주의 positive control로 사용되었다. 돌연변이원성의 결과 분석은 Moore와 Felton(1983)의 방법에 따라 실시되었으며 용량반응곡선의 liner portion은 가열된 육류의 역돌연변이 집락을 나타내는데 사용되었다.
성능/효과
- Butanol fraction 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 g을 첨가하였을 때 각각 49.8, 51.0, 61.5, 64.9%의 농도 의존적인 돌연변이원성 억제효과를 나타내었으며, butanol fraction 첨가군 중에서 특히 2.0 g 이상을 첨가하였을 때 통계적으로 유의한(p<0.05) 돌연변이원성 억제효과를 나타내었다.
- DPPH radical 소거능을 분석한 결과 p-hydroxybezoic acid, luteolin 및 quercetin 3- O-β-D-glucopyranoside가 가장 우수한 항산화 효과를 나타냈으며, 특히 luteolin은 대조군으로 사용된 ascorbic acid 보다 강력한 DPPH radical 소거능을 보였다(Ahn and Grun, 2005b).
- 가열 전 쇠고기 마리네이드 소스에 식용이 가능한 백련잎 water fraction(2.0, 4.0, 8.0 g)을 첨가한 후 190oC에서 가열한 결과 MeIQx(2-amino-3,8 dimethylimidazo[4,5-f]- quinoxalin)는 30.9-63.5%, PhIP(2-amino-1-methyl-6-pheny-limidazo[4,5-b]-pyridine)는 31.6-60.7% 억제되었다.
- 0 g을 각각 첨가한 마리네이드 소스를 제조하여 쇠고기 스테이크를 위와 같은 조건으로 조리하여 돌연변이원성 억제효과를 평가하였으며 buthanol fraction을 첨가한 결과와 비교하였다. 각 용매 분획물의 마리네이드 소스를 처리한 고기를 225℃에서 가열한 결과 butanol fraction의 돌연변이원성 억제효과는 61.5%의 값을 나타내었고 ethyl acetate, ethanol, water fraction은 각각 55.9, 55.7, 55.1%의 억제효과를 보여줌으로써, 용매 별 fraction의 돌연변이원성 억제효과는 유의적인 차이가 없다고 사료된다(Table 3). Kikugawa(2004) 는 가열된 고기에서 돌연변이를 최소화하는 방법 중 하나로 Maillard reaction 초기단계에서 pyrazine cation radical 의 형성 억제를 보고하였으며 이는 polyphenol 화합물들이 관여하는 것으로 여겨진다.
- 따라서 백련 잎 추출물은 heterocyclic amine류 형성과 돌연변이원성을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타나 고단백질 식품 섭취시 안전성 측면에서 긍정적인 영향을 미칠 것으로 판단된다.
- Knize 등(1994)은 조리온도를 150, 190, 230℃로 설정하여 쇠고기 패티에서의 HCAs 함량 분석한 결과 온도가 증가함에 따라 HCAs의 생성도 증가하는 것을 나타내었고 또한 Ahn 과 Grun(2005a)은 180-220℃에서 가열한 쇠고기 패티의 HCAs의 함량을 분석하여 220℃에서 가장 높은 검출빈도를 보여주었다. 백련 잎을 첨가한 마리네이드 소스의 HCAs 의 생성억제 효과를 보기 위해 water fraction 2.0, 4.0, 8.0 g을 첨가하여 쇠고기를 가열한 결과 DiMeIQx의 경우 각 농도에서 36.8, 48.6, 73.9%으로 가장 억제효율이 좋았고 다음으로 PhIP(33.9-67.6%), MeIQx(38.1-65.3%) 순으로 HCAs 형성이 억제되었다(Table 5).
- 9 ng/g 검출되었다(Table 4). 백련 잎의 water fraction 2.0, 4.0, 8.0 g을 첨가한 마리네이드 소스로 처리한 쇠고기 스테이크를 위와 같은 조건으로 가열한 결과, 각 농도에서 MeIQx는 30.9, 48.4, 63.5%, PhIP는 31.6, 47.4, 60.7%의 농도의존적인 억제효과를 나타내었다(Table 4). Trp-P-1(3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido-[4,3-b]indole), AaC(2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole), MeAaC(2-amino-3 methyl-5H-pyrido-[1,2-a:3,2-d]imidazole), MeIQx, DiMeIQx, PhIP, IQ(2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline)는 다양한 조건에 따라 처리된 쇠고기 패티에서 나타나는 돌연변이원으로 알려져 있다.
- 전체회수율은 31-76%이며, PhIP는 37±4%의 낮은 회수율을 나타내었고 그 밖에는 약 70% 이상의 회수 율을 보여주었다.
- 표면온도가 190℃인 프라이팬에서 쇠고기를 가열한 경우 PhIP가 26.05±1.2 ng/g로 가장 많이 검출되었고, MeIQx 는 12.23±1.9 ng/g 검출되었다(Table 4).
- 표면온도가 225℃인 프라이팬에서 쇠고기를 가열한 결과 MeIQx는 21.41±3.2 ng/g 검출되었고 DiMeIQx, PhIP 는 각각 14.61±1.4, 38.21±3.7 ng/g이 검출되어 190℃에서 조리한 경우보다 많이 검출되었다(Table 5).
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