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문제 정의
- 따라서 본 연구는 천연보존제 및 항산화제 개발을 위한 연구의 일환으로 만병초를 이용하여 식중독 유발균에 대한 항균력 및 항산화 효과를 검증하여, 새로운 기능성식품이나 식품첨가물 소재로서의 개발가능성을 조사하였다.
- 본 연구는 만병초 에탄올추출물의 식중독 유발균에 대한 항균효과 및 항산화 활성을 조사하였다. 추출물의 항균활성은 paper disc 방법으로 조사하였다.
제안 방법
- DPPH 용액(45 μg/mL)을 추출물과 혼합한 다음 515 nm에서 흡광도의 감소를 30초 간격으로 5분간 측정하였다.
- monocytogenes, 그람음성균인 Sal. Typhimurium와 E. coli O157:H7 총 4균주를 선정하여, 각 균주에 대한 성장에 미치는 영향을 조사하였다. Fig.
- 건조된 만병초 164.8 g을 마쇄하여 수직으로 환류냉각관을 부착시킨 round flask에 넣어 95% 에탄올(Daejung Chemical & Metals Co., Gyeonggi-do, Korea)을 첨가하여 혼합한 후 heating mantle(E105, Minsung Scientific Co., Seoul, Korea)로 80oC에서 4시간 강열 환류 추출하였다.
- 0 mg)을 DMSO로 녹인후 흡수시켜 건조시킨 다음 30oC incubator에서 24시간 배양 하여 paper disc 주위의 저해환(mm)의 크기를 측정하여 항균력을 비교하였다. 대조군은 DMSO를 사용하여 동일한 방법으로 점적하였다.
- 형광도 감소는 추출물 내 항산화물질에 의한 ROS 생성 억제를 나타낸다. 또한, 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용하여 ROS 생성 억제 효과를 비교 조사하였다.
- 또한, 양성대조군으로 α-tocopherol을 사용하여 DPPH 소거활성을 비교 조사하였다.
- 만병초 추출물을 DMSO로 녹인 후 TSB배지에 250, 500, 1,000, 2,000 mg/L 농도별로 첨가하였다. 각 시험 균주는 사면배지에서 배양된 것을 1 백금이를 취하여 10 mL의 TSB배 지에 접종한 후 30oC shaking incubator에서 24시간 배양하였다.
- 또한, 만병초 추출물이 식중독 유발균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium과 Escherichia coli O157:H7의 배양액에 250, 500, 1,000 및 2,000 mg/L 농도로 첨가하여 생육을 조사한결과, 배양시간 별로 250 mg/L 농도까지는 대조군과 차이가 없었으나, 1,000 mg/L 이상의 농도에서는 균의 증식이 억제되었다. 만병초 추출물의 항산화 효능을 조사하기 위해 DPPH 라디칼 소거활성, ROS 생성 억제 및 supercoiled DNA strand 절단 억제효과를 측정하였다. Pyrogallol의 억제율을 100%로 기준하였을 때, DPPH 라디칼을 50% 억제시키는데 필요한 만병초 추출물의 농도는 양성대조군인 α-tocopherol 의 약 절반으로 나타났다.
- 배양한 각 균주 100 μL를 petri dish에 넣고 여기에 멸균된 TSA배지 10 mL 를 분주하여 고루 섞은 후에 완전히 굳힌 다음 멸균된 8-mm paper disc(Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)를 배지표면에 얹고 밀착시킨 후 추출물(2.5, 5.0, 10.0 mg)을 DMSO로 녹인후 흡수시켜 건조시킨 다음 30oC incubator에서 24시간 배양 하여 paper disc 주위의 저해환(mm)의 크기를 측정하여 항균력을 비교하였다.
- 배양한 배양액을 각 100 μL씩 접종하고(106 cells/mL) 30oC에서 72시간 배양하면서 spectrophotometer(Beckman DU650, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 6시간마다 660 nm 에서 흡광도를 측정하였고, 추출물을 넣은 broth를 blank로 사용하였다.
- 8% agarose에서 전기영동을 실시하였다. 자외선하에서 사진을 촬영한 후, DNA band의 density는 Image J 1.44 program(NIH, Bethesda, MD, USA)을 사용하여 측정하였으며, 만병초 추출물의 supercoiled DNA strand 절단 억제효과는 supercoiled DNA band의 retention%를 측정함으로써 조사하였다. Retention%는 [1－(Asample/Anative)]×100의 공식으로 계산하였으며, Asample은 radical과 추출물 처리 시의 supercoiled DNA strand의 양을 나타내며, Anative는 radical과 추출물 무처리 시의 supercoiled DNA strand의 양을 나타낸다.
- 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 는 Choi 등(14)의 방법에 따라 측정하였다. 추출물의 함량이 50 mg/L 간격으로 들어있는 TSA 고체배지에 사면배지에서 배양된 각 균주 1 백금이를 취해 접종하여 30oC에서 24시간까지 배양한 후 육안으로 관찰하여 미생물이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.
대상 데이터
- 만병초 추출물의 항균실험에 사용한 식중독 유발균주는 그람양성 3균주(Bacillus cereus KCTC 1012, Staphylococcus aureus KCTC 1928 및 Listeria monocytogenes KCTC 3569)와 그람음성 5균주(Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Yersinia enterocolitica ATCC 23715, Salmonella Choleraesuis ATCC 2931, Escherichia coli KCTC 2441 및 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895) 총 8균주를 사용하였다. 균의 생육배지로는 모든 균주에 대하여 tryptic soy broth(TSB, BD, Sparks, MD, USA)를 사용하여 30oC incubator에서 18∼24시간 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 만병초는 강원도 태백의 만병초 재배농가에서 건조된 것을 구입하여 시료로 사용하였다.
- 2 μg 에 추출물을 넣고 5 mM 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH)와 함께 37oC에서 2시간 배양하였다. 양성 대조군으로 Trolox를 사용하였다.
- 1 mM FeSO4와 함께 37oC에서 1시간 배양하였다. 양성 대조군으로 sesamol 을 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험의 통계분석은 PASW statistics 18.0 program (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석 하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
- 실험결과에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- DPPH free radical 소거활성은 Malterud 등(15)의 방법에 따라 측정하였다. DPPH 용액(45 μg/mL)을 추출물과 혼합한 다음 515 nm에서 흡광도의 감소를 30초 간격으로 5분간 측정하였다.
- Hydroxyl radical에 의한 DNA strand 절단은 Hiramoto 등(18)의 방법에 따라 측정하였다. Supercoiled pBR322 DNA 0.
- Peroxyl radical에 의한 DNA strand 절단은 Hu 등(17)의 방법에 따라 측정하였다. Supercoiled pBR322 DNA 0.
- 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 는 Choi 등(14)의 방법에 따라 측정하였다. 추출물의 함량이 50 mg/L 간격으로 들어있는 TSA 고체배지에 사면배지에서 배양된 각 균주 1 백금이를 취해 접종하여 30oC에서 24시간까지 배양한 후 육안으로 관찰하여 미생물이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.
- Cell-free system에서 1 μM H2O2와 10 μM FeSO4로 ROS를 유발시켰다. 추출물과 혼합한 다음 DCF 형성에 따른 형광도 변화는 LeBel 등(16)의 방법에 따라 microplate spectrofluorometer (Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 excitation 파장 488 nm와 emission 파장 525 nm 에서 2분 간격으로 10분간 측정하였다. 형광도 감소는 추출물 내 항산화물질에 의한 ROS 생성 억제를 나타낸다.
- 본 연구는 만병초 에탄올추출물의 식중독 유발균에 대한 항균효과 및 항산화 활성을 조사하였다. 추출물의 항균활성은 paper disc 방법으로 조사하였다. 추출물을 10 mg/disc 점적한 후 저해환의 크기를 측정한 결과, 그람양성 3균주 중에서 Bacillus cereus에 대해, 그리고 그람음성 5균주 중에서 Escherichia coli O157:H7에 대한 항균활성이 가장 좋 았다.
- 항균효과 실험을 하기 위하여 paper disc-diffusion method (13)를 사용하였다. 각 시험균주는 사면배지에서 배양된 것을 1 백금이를 취하여 10 mL의 TSB배지에 접종한 후 30oC shaking incubator에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
- 0.2 mg/mL 농도의 만병초 추출물 첨가 시 hydroxyl radical에 대한 supercoiled DNA 의 retention은 75.9%로 나타나 동일한 농도의 양성대조군인 sesamol에 의한 retention(94.7%)에 비해 낮았고(p<0.05), peroxyl radical에 대한 추출물의 retentin(92.4%)보다도 낮게 나타났다.
- 1)Antimicrobial activity was indicated as diameter of clear zone surrounding paper disc absorbing 2.5, 5.0 or 10.0 mg of soluble solid of R. brachycarpum ethanol extract on TSA plate inoculated with test microorganisms.
- 2,000 mg/L 첨가군에서는 배양 12시간에 OD660값은 0.245±0.022로 나타났지만 배양 72시간에도 OD660값은 0.268±0.006으로 나타나, 대조 군과 비교하면 84.8%의 성장억제효과를 나타내었다.
- Choleraesuis 및 E. coli O157:H7에서는 각각 13.67±0.29 mm, 13.33±0.29 mm 및 14.67±0.29 mm로 나타나, 그람양성균과 그람음성균에서 광범위한 생육 저해 효과가 나타났다.
- 7B). Hydroxyl radical 존재 하에 plasmid DNA를 만병초추출물과 함께 배양하였을 때, 추출물 농도가 증가함에 따라 nicked open circular form은 감소한 반면 supercoiled form은 증가하여, 만병초추출물은 농도 의존적으로 hydroxyl radical에 의해 유도된 single-strand 절단을 억제하였다. Peroxyl radical에 대한 supercoiled DNA 절단 실험결과와는 달리, 0.
- 7A). Peroxyl radical 존재 하에 plasmid DNA를 만병초추출물과 함께 배양하였을 때, 추출물 농도가 증가함에 따라 nicked open circular form은 감소한 반면 supercoiled form은 증가하여, 0.2 mg/mL 농도의 추출물 첨가 시 DNA band pattern은 native(peroxyl radical 무처리) plasmid DNA band pattern과 유사하게 관찰되었다(Lane 1 vs 7, Fig. 7A 및 Table 3). 또한, 만병초추출물(0.
- Pyrogallol의 억제율을 100%로 기준하였을 때 만병초 추출물의 0.1 mg/mL 농도에서 DPPH radical 소거활성은 31.7±1.0%이었고, 추출물 농도가 증가할수록 소거활성도 증가하여 0.2, 0.5, 1 및 2 mg/mL 농도의 추출물은 각각 40.2±0.8, 58.2±3.7, 79.3±8.5 및 89.6±3.5%의 소거 활성을 나타내었다.
- Pyrogallol의 억제율을 100%로 기준하였을 때, DPPH 라디칼을 50% 억제시키는데 필요한 만병초 추출물의 농도는 양성대조군인 α-tocopherol 의 약 절반으로 나타났다.
- aureus에 대한 증식을 지연시켰다고 보고한바, 본 실험에서 사용한 만병초 추출물이 손바닥 선인장 추출물에 비해 Staphy. aureus에 대한 증식억제 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
- 따라서 만병초 추출물의 농도가 높을수록 Staphy. aureus의 성장을 효율적으로 억제시킬 수 있는 것으로 판단되었다. Chung (22)은 손바닥 선인장 에탄올추출물 농도가 3.
- 각 균주에 대한 항균활성은 disc에 점적한 만병초 추출물의 농도가 증가함에 따라 항균활성이 높게 나타났다(p<0.05).
- 그러나 만병초 추출물의 농도가 250과 500 mg/L인 경우, 72시간 배양 후 OD660값은 각각 1.730±0.020, 1.656±0.034로 나타나 성장억제효과가 관찰되지 않았으나, 2,000 mg/L에서는 OD660값이 0.339±0.017로 나타나 만병초 추출물이 L. monocytogenes의 성장을 80.1% 억제시켰다 (p<0.05).
- coli O157:H7에 대해서는 항균효과를 나타내지 않았다고 보고한 바 있다. 그러나 본 연구에서는 만병초 추출물이 E. coli O157:H7균의 성장을 효율적으로 억제시켰다. 따라서 본 연구에서는 특정 식중독균을 대상으로 만병초 추출물의 항균활성을 조사하였으나, 추후 보다 광범위한 식중독 유발 세균에 대한 항균성 검색이 필요하리라 사료된다.
- 4%)보다도 낮게 나타났다. 따라서 만병초 추출물이 hydroxyl radical 에 비해 peroxyl radical에 의해 유도된 supercoiled DNA 절단 억제효과가 높음을 알 수 있었다.
- 최소 억제 농도(MIC)는 현재 합성보존료로 이용되고 있는 sorbic acid와 비슷하게 나타났다. 또한, 만병초 추출물이 식중독 유발균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium과 Escherichia coli O157:H7의 배양액에 250, 500, 1,000 및 2,000 mg/L 농도로 첨가하여 생육을 조사한결과, 배양시간 별로 250 mg/L 농도까지는 대조군과 차이가 없었으나, 1,000 mg/L 이상의 농도에서는 균의 증식이 억제되었다. 만병초 추출물의 항산화 효능을 조사하기 위해 DPPH 라디칼 소거활성, ROS 생성 억제 및 supercoiled DNA strand 절단 억제효과를 측정하였다.
- 만병초 추출물 2,000 mg/L 첨가군에서 배양 72시간의 OD660값은 0.316±0.007로 나타나, 대조군에 비해 균의 증식이 약 80% 억제되었다(p<0.05).
- 만병초 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 경우, 배양후 6시간부터 급속한 균의 증식을 보여 72시간에는 OD660값이 최대인 1.772±0.013으로 나타나, 추출물의 첨가 농도가 높을수록 성장이 억제되었다(p<0.05).
- 05). 만병초 추출물의 농도가 높을수록 OD660값이 감소 하여, 1000 mg/L 농도 첨가 시 배양후 72시간에는 대조군과 비교하여 약 42%의 성장 저해효과를 나타냈다. 특히, 2,000 mg/L 농도를 첨가하였을 경우, 배양 후 72시간에도 OD660값이 0.
- 모든 배양시간에서 만병초 추출물 500 mg/L 농도까지 OD660값은 대조군에 비해 차이가 없었다(p>0.05).
- 양성 대조군으로 사용된 α-tocopherol의 0.1, 0.2 및 0.5 mg/mL에서 DPPH 소거활성은 각각 31.8±5.7, 58.6±6.4 및 91.3±4.7%로 나타나, 농도가 증가함에 따라만병초 추출물의 소거활성이 α-tocopherol에 비해 낮았다 (p<0.05).
- 양성 대조군으로 사용된 ascorbic acid의 DCF 형광도는 1 및 5 mg/mL 농도에서 각각 270.0±5.8 및 237.2±13.1로, 만병초 추출물에 비해 높게 나 타나(p<0.05), 만병초 추출물의 ROS 생성 억제효과가 ascorbic acid에 비해 우수한 것을 알 수 있었다.
- coli O157:H7에 대한 항균력을 보고하였고, Lee 등(20)은 매실 착즙액의 농도에 따라 그람양성균과 그람음성균에 대한 항균력 차이가 관찰되었다고 보고한 바 있다. 이와 유사하게 본 실험에서도 만병초 에탄올 추출물의 농도에 따라 항균력의 차이는 다소 있었지만, 식중독 유발균에 대해 강한 항균력을 나타내었다.
- 추출물 농도가 증가할수록 DCF 형광도는 감소하여 1 및 5 mg/mL 농도의 추출물은 각각 247.9±8.2및 210.3±4.0으로 나타나, ROS 생성은 농도 의존적으로 억제되고 있음을 알 수 있었다.
- 05). 추출물 농도와 DPPH radical 소거활성 간의 회귀 분석 결과 50%의 radical 소거활성에 필요한 만병초 추출물의 농도(IC50)는 0.43 mg/mL로 나타났다. α-Tocopherol의 DPPH IC50이 0.
- 추출물 무첨가 시 DCFH의 산화에 의한 DCF 형광도는 410.3±7.6이었으며, 만병초 추출물의 0.1 mg/mL 농도에서 DCF 형광도는 357.1±3.6로 추출물 무첨가에 비해 낮게 (p<0.05) 나타났다.
- 추출물의 항균활성은 paper disc 방법으로 조사하였다. 추출물을 10 mg/disc 점적한 후 저해환의 크기를 측정한 결과, 그람양성 3균주 중에서 Bacillus cereus에 대해, 그리고 그람음성 5균주 중에서 Escherichia coli O157:H7에 대한 항균활성이 가장 좋 았다. 최소 억제 농도(MIC)는 현재 합성보존료로 이용되고 있는 sorbic acid와 비슷하게 나타났다.
- 추출물의 농도가 증가할수록 DCF 형광도는 감소하여 ROS 생성이 농도 의존적으로 억제되고 있음을 알 수 있었다. 추출물의 ROS 생성 억제효과는 양성대조군인 아스코르빈산에 비해 높게 나타났다. 또한, 만병초 추출물은 peroxyl radical 및 hydroxyl radical로 유발된 supercoiled DNA strand 절단을 억제시켰다.
- Pyrogallol의 억제율을 100%로 기준하였을 때, DPPH 라디칼을 50% 억제시키는데 필요한 만병초 추출물의 농도는 양성대조군인 α-tocopherol 의 약 절반으로 나타났다. 추출물의 농도가 증가할수록 DCF 형광도는 감소하여 ROS 생성이 농도 의존적으로 억제되고 있음을 알 수 있었다. 추출물의 ROS 생성 억제효과는 양성대조군인 아스코르빈산에 비해 높게 나타났다.
- 특히, 2,000 mg/L 농도를 첨가하였을 경우, 배양 후 72시간에도 OD660값이 0.404±0.007로 나타나 대조군에 비해 균의 증식이 약 77% 억제되었다(p<0.05).
- 현재 합성보존료로 많이 사용하고 있는 sorbic acid의 시험균주에 대한 MIC도 1,000∼1,200 mg/L로 나타나, 만병초 추출물의 항균활성이 sorbicacid와 유사한 것으로 나타났다.
후속연구
- 또한, 만병초 추출물은 peroxyl radical 및 hydroxyl radical로 유발된 supercoiled DNA strand 절단을 억제시켰다. 따라서 본 연구결과는 만병초 추출물이 식중독 유발균에 대하여 우수한 항균작용과 항산화능을 나타내어 만병초가 효과적인 천연 보존료 및 항산화제로서 이용될 수 있음을 시사하고 있다.
- coli O157:H7균의 성장을 효율적으로 억제시켰다. 따라서 본 연구에서는 특정 식중독균을 대상으로 만병초 추출물의 항균활성을 조사하였으나, 추후 보다 광범위한 식중독 유발 세균에 대한 항균성 검색이 필요하리라 사료된다.
- 이상과 같이, 본 연구결과는 만병초 추출물이 식중독 유발균에 대하여 우수한 항균작용과 free radical에 의해 유도된 산화억제능을 나타내어 만병초가 효과적인 천연보존료 및 항산화제로서 이용될 수 있음을 시사하고 있다.
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