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문제 정의
- 본 연구는 갈근탕을 발효시키기 위한 starter 균주로서의 Lactobacillus의 가능성을 살펴보기 위하여 Lactobacillus 발효에 의한 갈근탕의 특성변화를 분석하였으며, 또한 각 Lactobacillus들에 의한 갈근 isoflavone 배당체의 비배당화 활성을 비교하여 갈근탕 유효성분의 생체 이용률을 높일 수 있는 Lactobacillus를 선발하고자 수행하였다.
- 6 사이인 것을 고려하여 이를 적정 pH로 결정하여 유산균 발효 실험에 사용하였다. 본 연구의 목표는 균주 접종에 의한 갈근탕 내 isoflavone 배당체의 가수분해를 확인하는 것으로, 균주를 접종할 배지는 해당 균주의 생육이 가능할 조건이어야 하는 것이 기본 전제이다. 따라서, 이러한 목표의 baseline을 보여주는 대조구는 갈근탕에 균주를 접종하기 바로 전 상태, 즉 pH 조정이 되고, 멸균처리를 거친 시료를 정하여 발효 후 상태와 비교를 하였다.
제안 방법
- 갈근탕 및 유산균 발효 갈근탕에 함유된 isoflavone들을 추출하기 위해 동결건조된 각 시료의 일정량에 10배의 80% 메탄올 용액을 가하여 상온에서 24시간 추출하였다. 불용성 물질은 원심분리(4,000 g×15분)하여 제거한 다음, 상등액을 syringe filter(0.
- 갈근탕의 발효 전후 유산균에 의해 대사되는 물질의 변화를 분석하기 위하여 HPLC를 이용하여 갈근탕의 원료 중 하나인 갈근의 지표물질(Isoflavone)의 발효 전후 성분변화를 비교 분석한 결과는 Fig. 1과 같다. 갈근탕 내에 존재하는 isoflavone의 대표적 형태는 대조구(Fig.
- 따라서 daidzein의 경우 puerarin 과 daidzin의 최종 대사산물이 아닌 중간 대사산물로서 배당체와 비당체간의 생물전환율을 정량적으로 matching 시키는 것은 어려운 일이다. 그러므로, 본 연구에서는 puerarin이나 daidzin의 daidzein으로의 전환효율을 나타내기 보다는 각 배당체의 가수분해율 및 중간대사체인 daidzein 농도의 증가를 측정함으로써 유산균에 의한 갈근탕 내 isoflavone의 전환을 정성적으로 확인하였다. 유산균에 의한 배당체의 비배당화 활성은 유산균의 종류에 따라 다양하며, 유산균들이 생산하는β-glucosidase의 활성과 밀접한 관련이 있다고 보고된 바 있으며(21), L.
- 본 연구의 목표는 균주 접종에 의한 갈근탕 내 isoflavone 배당체의 가수분해를 확인하는 것으로, 균주를 접종할 배지는 해당 균주의 생육이 가능할 조건이어야 하는 것이 기본 전제이다. 따라서, 이러한 목표의 baseline을 보여주는 대조구는 갈근탕에 균주를 접종하기 바로 전 상태, 즉 pH 조정이 되고, 멸균처리를 거친 시료를 정하여 발효 후 상태와 비교를 하였다. 현재 많은 천연물 발효관련 논문에서 기질이 산성인 경우, 미생물 생육에 불리하므로 pH 조절로 발효 기질의 조건을 개선하는 방법을 사용하고 있다(16,17).
- 0로 조정했을 때 균수가 활발히 증식되었음이 보고된 바 있다(15). 본 발효실험에 사용된 갈근탕의 유산균 접종 전 pH는 4.9로 산성을 나타내어 접종 전 초기 pH의 영향을 조사하기 위하여 1 M NaOH 용액을 이용하여 갈근탕의 pH를 7.0으로 조정하였다. 이것을 멸균한 후 갈근탕의 pH를 측정한 결과 갈근탕의 pH는 6.
- 각 한약재의 재배지역은 갈근(경남 거창군), 마황(중국), 건강(충남 태안군), 대조(경북 영천시), 계피(베트남), 작약(경북 의성군), 감초(베트남)이다. 본 연구에서는 초고속 진공 저온 약탕기(Cosmos-660, KyungSeo, Inchon, Korea)를 이용한 전탕 추출법에 의해 갈근탕 추출을 실시하였으며, 처방구성(갈근 400 g, 마황 200 g, 건강 50 g, 대조 200 g, 계피 150 g, 작약 150 g, 감초 100 g)(12)에 따른 각 한약재들을 무게의 50배에 해당하는 생수에 넣어 1시간 침적한 다음 115℃에서 180분간 열탕 추출하였다.
- 분석 컬럼은 SunfireTM C18(4.6×250 mm i.d., 5 µm, Waters, Milford, MA, USA)를 사용 하였고, 주입량은 20 µL, 유속은 1.0 mL/min, 컬럼온도는 30℃, 자외선 검출기 흡광파장은 254 nm로 설정하여 분석하였다.
- 불용성 물질은 원심분리(4,000 g×15분)하여 제거한 다음, 상등액을 syringe filter(0.2 µm, Millipore Co., Bedford, MA, USA)로 여과하여 HPLC의 분석 시료로 사용하였다(13).
- 유산균 발효에 의한 갈근탕 내의 isoflavone변화는 배당체(puerarin, daidzin)가 유산균 발효에 의해 가수분해된 비율을 산출하여 비교하였다.
- 0 mL/min, 컬럼온도는 30℃, 자외선 검출기 흡광파장은 254 nm로 설정하여 분석하였다. 이동상으로는 (A) water와, (B) acetonitrile을 초음파 세척기로 탈기하여 사용하였고, 기울기 용리조건(gradient system)을 이용하였으며 B 를 기준으로 15%(0분), 15%(10분), 35%(50분), 80%(58분), 15%(63분), 15%(70분)이었다(14).
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 isoflavone 표준품 puerarin, daidzin, daidzein 은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였고, 기기분석을 위한 water, acetonitrile, ethanol(SK chemicals, Ulsan, Korea)은 HPLC급을 사용하였다. 그 외는 모두 특급 시약을 사용 하였다.
- 갈근탕 발효에 사용된 유산균은 한국식품연구원(Korea Food Research Institute: KFRI, Seongnam, Korea) 식품미생물 유전자은행에서 분양 받았으며, MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에서 계대 배양한 뒤 초기균수를 1-5×106 CFU/mL로 조절하여 사용하였다.
- , Bedford, MA, USA)로 여과하여 HPLC의 분석 시료로 사용하였다(13). 갈근탕 중 isoflavone의 분석을 위해 사용된 기기는 Jasco HPLC(Tokyo, Japan)로 degasser가 장착된 PU-2089 Plus gradient pump, AS-2075 Plus autosampler, 그리고 UV-2075 Plus UV-vis detector로 구성되었다. 분석 컬럼은 SunfireTM C18(4.
- 발효에 사용된 갈근탕은 한국한의학연구원에서 제공받았다. 갈근탕의 한약재 구성은 갈근(Puerariae Radix), 마황(Ephedrae Herba), 건강(Zingiberis Rhizoma), 대조(Zizyphi Fructus), 계피(Cinnamomi Cortex), 작약(Paeoniae Radix), 감초(Glycyrrhizae Radix)로 생산자 및 재배지역이 명확한 한약재를 구입하여 사용 하였다. 각 한약재의 재배지역은 갈근(경남 거창군), 마황(중국), 건강(충남 태안군), 대조(경북 영천시), 계피(베트남), 작약(경북 의성군), 감초(베트남)이다.
- 발효에 사용된 갈근탕은 한국한의학연구원에서 제공받았다. 갈근탕의 한약재 구성은 갈근(Puerariae Radix), 마황(Ephedrae Herba), 건강(Zingiberis Rhizoma), 대조(Zizyphi Fructus), 계피(Cinnamomi Cortex), 작약(Paeoniae Radix), 감초(Glycyrrhizae Radix)로 생산자 및 재배지역이 명확한 한약재를 구입하여 사용 하였다.
성능/효과
- plantarum KFRI 144균주의 경우 선행 연구결과에서 다른 유산균주들에 비해 높은 β-glucosidase활성을 나타내어 콩 추출물중의 daidzin을 높은 비율로 비배당체인 daidzein으로 전환하였다는 보고(22) 등을 고려해 보았을 때, Lactobacillus 균주에 의한 갈근탕 내 daidzin의 가수분해 활성차이는 각 균주가 생산하는 β-glucosidase의 활성과 관련이 있을 것으로 추정되었다. 갈근탕 유산균 발효 중 daidzin은 가수분해율이 높은 반면, 또 다른 배당체 isoflavone인 puerarin의 가수분해율은 매우 낮았다. Puerarin 과 daidzin은 같은 기본화학구조를 가졌으나, puerarin의 경우 glucose가 C-glucoside 결합을 하고 있는 반면, daidzin의 경우 Oglucoside 결합을 하고 있다.
- 갈근탕을 이용한 유산균 발효에 적합한 균주를 선발하기 위하여 3종의 Lactobacillus균을 이용하여 발효시킨 갈근탕의 특성을 분석해 본 결과, 발효에 의한 유기산의 생성으로 3종의 발효 갈근탕 모두 pH가 3.8 이하로 저하되었다. 또한 각 Lactobacillus들에 의한 갈근탕의 지표물질 중 하나인 isoflavone 배당체 daidzin 의 비배당화 활성을 평가한 결과 L.
- 8 이하로 낮아졌다. 갈근탕의 pH 저하능력이 가장 뛰어난 균주는 L. casei KFRI 127로서 24시간 발효 시 pH 가 3.9 이하로 빠르게 낮아졌고, 48시간 후에는 3.6으로 낮아져 가장 활발한 pH 저하효과를 보였다. 유산균은 발효를 통해 젖산을 포함하는 유기산을 생산하고(18), 생성된 유기산은 발효물의 pH를 저하시켜 잡균의 오염을 방지할 수 있다는 보고(19)를 고려해 보았을 때 Lactobacillus 균주 발효에 의한 pH 저하로 발효 갈근탕의 잡균 오염을 방지할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 8 이하로 저하되었다. 또한 각 Lactobacillus들에 의한 갈근탕의 지표물질 중 하나인 isoflavone 배당체 daidzin 의 비배당화 활성을 평가한 결과 L. plantarum KFRI 144균주가 89.9%의 가수분해율을 보여 가장 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터 L.
후속연구
- 생리활성을 증진시키기 위한 비배당화 방법은 가수분해, 효소적 변화 그리고 미생물에 의한 비배당화를 들 수 있는데, 특히 미생물에 의한 생물전환은 epimerization, hydration, hydroxylation 과 같은 부가반응이 적은 장점이 있다(9). 따라서 비배당화 활성이 높은 유산균을 갈근탕 발효에 응용한다면 발효 갈근탕의 생리활성을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.
- 3배 높았다는 점은 유산균을 포함한 장내 미생물들이 높은 O-glucosidase 활성을 가졌다는 점을 뒷받침해준다(24). 유산균을 이용한 한방처방의 발효는 사람에 따라 구성이 다른 장내세균의 영향을 받지 않고, 유효성분의 흡수율을 높여, 개인차에 의존하지 않는 보편적인 약리 작용을 가질 수 있는 한방처방 제품개발의 가능성을 높여줄 것으로 기대된다.
- 9%의 가수분해율을 보여 가장 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터 L. plantarum KFRI 144균주는 갈근탕 약효성분의 생체이용률을 높일 수 있는 기능성 발효 갈근탕 제조의 starter 균주로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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