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문제 정의
- 따라서 구멍갈파래를 자원화시켜 환경문제를 해결하고 더 나아가 구멍갈파래 생리활성 효과를 가축에게 적용시키는 연구가 필요하다. 본 연구는 구멍갈파래가 새로운 가축사료 소재로서 항산화, 면역조절 효과가 있는지 확인하고자 실시하였으며, 이를 위해 LPS로 염증반응이 유도된 육계에서 혈액 superoxide dismutase(SOD) 유사 활성, immunoglobulin 농도 및 비장 조직 내 cytokine mRNA 발현을 조사하였다.
제안 방법
- 1 ml을 첨가한 후, 25℃에서 30분간 배양하였다. 1N의 HCl 0.1 ml로 반응을 정지시킨 후, 비색계를 이용하여 420 nm의 흡광도를 측정하였고(At), 동일한 실험방법으로 Tris-HCl buffer와 pyrogallol만 첨가한 후 측정된 흡광도(Ac)와 Tris-HCl buffer와 혈장만 첨가한 후 측정된 흡광도(Ao)를 이용하여 SOD‐like activity를 구하였다.
- 이를 다시 5회 세척한 후, enzyme substrate (TMB peroxidase substrate, peroxidase solution B)를 100 μL씩 넣고 반응시켰다. 5~30분간 반응에 따른 색 변화를 관찰하여 색이 고정되면 2 M H2SO4를 넣고 반응을 정지시킨 후, microplate reader(Benchmark plus, Bio-Rad Laboratories, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하고 작성된 표준곡선을 이용하여 IgA, IgG, IgM의 함량을 산출하였다.
- 5주간의 사양기간이 종료된 후 염증반응을 유도하기 위해 LPS(Excherichia coli ; SIGMA L2630)를 처리당 5수를 선발하여 개체당 1 mg/ml 복강 주사하였다. 혈액은 LPS 주사 전과 후 2회(0, 2 h)에 걸쳐 익하정맥에서 채취하고, 원심분리(2,000 rpm×10 min)를 통해 혈청을 분리하여 분석에 이용하였다.
- DNA marker와 전기영동 후 DNA band를 비교하여 target gene임을 확인한 후, image analyzer(Bio-capt ver. 99.4, Vilber Loumat, France)를 사용하여 β-actin의 DNA band의 OD (optical density) 값과 iNOS, IL-1β, IL-2 및 IL-6의 OD 값을 측정하였으며, β-actin의 DNA band의 OD 값으로 각각의 iNOS, IL-1β, IL-2 및 IL-6 OD 값을 나누어 상대적 비율을 구하여 비교 분석하였다.
- Ross종 6주령 육계 5수를 시판사료로 사육하고 강제급여를 시작하기 직전에 24시간 동안 절식 시켰다. 그 후 구멍갈파래 원료를 각각 10g씩 강제 급여시킨 후 24시간 동안 배설된 모든 배설물을 채취하였다. 또한 기초대사량 측정을 위하여 절식구를 배치하였다.
- 그 후 구멍갈파래 원료를 각각 10g씩 강제 급여시킨 후 24시간 동안 배설된 모든 배설물을 채취하였다. 또한 기초대사량 측정을 위하여 절식구를 배치하였다. 채취된 모든 배설물은 깃털과 이물질 등을 제거한 후 상온에서 48시간 동안 건조시키고 분쇄하여 분석에 이용하였다.
- 매주 동일한 시간에 체중을 측정하여 증체량을 구하였다. 사료는 매일 급여량과 잔량을 조사하였으며, 매주 급여된 사료와 사료 잔량의 수분을 측정하여 보정 계산한 후 사료섭취량을 구하였다.
- 실험사료는 한국사양표준(가금, 2007)에서 제시한 옥수수－대두박 위주의 기초 사료로 구멍갈파래의 TME를 고려하여 전기(CP 21%, ME 3,100 kcal/kg)와 후기(CP 19%, ME 3,150 kcal/kg)로 나누어 동일한 수준으로 급여하였다(Table 3, 4). 물을 니플급수에 의해 자유로이 음수할 수 있도록 하였다
- 매주 동일한 시간에 체중을 측정하여 증체량을 구하였다. 사료는 매일 급여량과 잔량을 조사하였으며, 매주 급여된 사료와 사료 잔량의 수분을 측정하여 보정 계산한 후 사료섭취량을 구하였다. 조사된 사료섭취량과 증체량을 통해 사료요구율을 산출하였다.
- 채취된 모든 배설물은 깃털과 이물질 등을 제거한 후 상온에서 48시간 동안 건조시키고 분쇄하여 분석에 이용하였다. 사료와 분뇨의 총 에너지(gross energy, GE) 함량은 bomb calorimeter (Parr 6200 Instrument, US)를 사용하여 측정하였다. TME는 절식과 사료급이 시험축에서 채취한 분뇨 배설물을 이용하여 다음 공식으로 산출되었으며, 1.
- 시험구 배치는 무첨가구(Negative Control ; NC), 시판 면역증강제 첨가구(Positive Control ; PC, β-glucan 25 ppm), 구멍갈파래 분말 3% 첨가구(Ulva pertusa kjellman Powder ; UlvaP) 및 구멍갈파래 추출물 0.3% 첨가구(Ulva pertusa kjellman Extract ; Ulva E)로 배치하였다.
- 3% 첨가구(Ulva pertusa kjellman Extract ; Ulva E)로 배치하였다. 실험사료는 한국사양표준(가금, 2007)에서 제시한 옥수수－대두박 위주의 기초 사료로 구멍갈파래의 TME를 고려하여 전기(CP 21%, ME 3,100 kcal/kg)와 후기(CP 19%, ME 3,150 kcal/kg)로 나누어 동일한 수준으로 급여하였다(Table 3, 4). 물을 니플급수에 의해 자유로이 음수할 수 있도록 하였다
- 25를 곱하여 산출하였으며, 조지방 함량은 soxhlet 추출법, 조섬유 함량은 H2SO4-NaOH 분해법, 조회분 함량은 직접 회화법으로 측정하였다. 아미노산 함량은 6 N HCl로 110℃에서 16시간 동안 가수분해시킨 후(Mason, 1984), 아미노산 분석기(HITACHI L-8500A, Japan)를 이용하여 분석하였다.
- 위 과정을 통해 얻어진 cDNA로 AccupowerⓇ HotStart PCR-PreMix Bioneer, Korea)를 사용하여 inducible nitric oxide synthase(iNOS), interleukin‐1β(IL-1β), interleukin-2 (IL-2) 및 interleukin6 (IL-6) mRNA에 대한 primer와 β-actin mRNA에 대한 primer를 사용하여 Touch down PCR을 통해 DNA를 증폭하고 1.7% agarose gel (Takara, Japan)에서 전기영동을 수행하였다.
- 사료는 매일 급여량과 잔량을 조사하였으며, 매주 급여된 사료와 사료 잔량의 수분을 측정하여 보정 계산한 후 사료섭취량을 구하였다. 조사된 사료섭취량과 증체량을 통해 사료요구율을 산출하였다.
- 또한 기초대사량 측정을 위하여 절식구를 배치하였다. 채취된 모든 배설물은 깃털과 이물질 등을 제거한 후 상온에서 48시간 동안 건조시키고 분쇄하여 분석에 이용하였다. 사료와 분뇨의 총 에너지(gross energy, GE) 함량은 bomb calorimeter (Parr 6200 Instrument, US)를 사용하여 측정하였다.
- 혈액 내 immunoglobulin 함량은 chicken IgA, IgG, IgM kit(Bethyl Laboratories, Inc. USA)를 사용하여 측정하였다. Goat anti-chicken IgA IgG, IgM을 coating buffer (0.
- 혈액 내 항산화도는 Stefan과 Gudrun (1974)의 방법을 응용하여 superoxide dismutase (SOD) like activity를 구하였다. 먼저 유리 시험관에 pH 8.
대상 데이터
- 에너지 및 아미노산 이용률을 측정하기 위해 Sibbald (1976)가 고안한 강제급여(force-feeding) 방법을 사용하여 실시하였다. Ross종 6주령 육계 5수를 시판사료로 사육하고 강제급여를 시작하기 직전에 24시간 동안 절식 시켰다. 그 후 구멍갈파래 원료를 각각 10g씩 강제 급여시킨 후 24시간 동안 배설된 모든 배설물을 채취하였다.
- 공시계로는 1일령 Ross종 육계수컷 96수를 선별하여, 육계전기(0~3주), 육계후기(3~5주)의 5주 동안 사양시험을 실시하였다. 처리당 24수(3수× 8반복)씩 4처리구에 총 96수를 임의배치하여 실시하였다.
- 구멍갈파래 시료는 제주시 앞바다 주변에 서식하는 것을 채취하고 수 회 세척하여 소금성분을 최대한 제거한 후 건조․분쇄하여 사용하였다. 일반성분은 AOAC 방법(1995)을 기초로 하여 분석하였다(Table 1).
데이터처리
- 실험에서 얻어진 모든 자료들의 통계분석은 Statistical Analysis System (SAS Institute, 2008)의 General Linear Model (GLM) procedure를 이용하여 분산분석을 실시하였고, 처리구간에 유의성은 Duncan’s multiple range-test (Duncan, 1955)를 이용하여 5% 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- LPS 주입 후 채취된 비장은 Chomczynski와 Sacchi (1987)의 acid/guanidium/phenol/chloroform법(TRizolⓇ reagent, InvitrogenTM, USA)을 사용하여 비장 조직으로부터 total RNA을 추출하였으며, 추출한 total RNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRon, Korea)를 이용하여 complementary DNA (cDNA)로 합성하였다. 위 과정을 통해 얻어진 cDNA로 AccupowerⓇ HotStart PCR-PreMix Bioneer, Korea)를 사용하여 inducible nitric oxide synthase(iNOS), interleukin‐1β(IL-1β), interleukin-2 (IL-2) 및 interleukin6 (IL-6) mRNA에 대한 primer와 β-actin mRNA에 대한 primer를 사용하여 Touch down PCR을 통해 DNA를 증폭하고 1.
- TAAA는 Sibbald (1976)가 제시한 TME 측정 방법과 동일한 방법을 사용하여 측정하였다(Table 2).
- 일반성분은 AOAC 방법(1995)을 기초로 하여 분석하였다(Table 1). 수분 함량은 105℃ 상압가열 건조법, 조단백질 함량은 Kjeldahl 법으로 측정된 질소량에 질소계수 6.25를 곱하여 산출하였으며, 조지방 함량은 soxhlet 추출법, 조섬유 함량은 H2SO4-NaOH 분해법, 조회분 함량은 직접 회화법으로 측정하였다. 아미노산 함량은 6 N HCl로 110℃에서 16시간 동안 가수분해시킨 후(Mason, 1984), 아미노산 분석기(HITACHI L-8500A, Japan)를 이용하여 분석하였다.
- 에너지 및 아미노산 이용률을 측정하기 위해 Sibbald (1976)가 고안한 강제급여(force-feeding) 방법을 사용하여 실시하였다. Ross종 6주령 육계 5수를 시판사료로 사육하고 강제급여를 시작하기 직전에 24시간 동안 절식 시켰다.
- 구멍갈파래 시료는 제주시 앞바다 주변에 서식하는 것을 채취하고 수 회 세척하여 소금성분을 최대한 제거한 후 건조․분쇄하여 사용하였다. 일반성분은 AOAC 방법(1995)을 기초로 하여 분석하였다(Table 1). 수분 함량은 105℃ 상압가열 건조법, 조단백질 함량은 Kjeldahl 법으로 측정된 질소량에 질소계수 6.
성능/효과
-
1) Vitamin-mineral mixture provided following nutrients per kg of diet:
vitamin A, 15,000IU; vitamin D3, 1,500IU; vitamin E, 20.0 mg; vitamin K3, 0.70 mg; vitamin B12, 0.02 mg; niacin, 22.5 mg; thiamin, 5.0 mg; folic acid, 0.70 mg; pyridoxin, 1.3 mg; riboflavin, 5 mg; pantothenic acid, 25 mg; choline chloride, 175 mg; Mn, 60mg; Zn, 45 mg; I, 1.25 mg; Cu, 10.0 mg; Fe, 72 mg; Co, 2.5 mg
. - IL-1β, IL-2 및 IL-6에서 처리구별 공통적인 차이를 나타내었는데 구멍갈파래 처리구(Ulva P, Ulva E)의 mRNA 발현 비율이 무첨가구와 면역제제 처리구에 비해 낮았으며, 구멍갈파래 처리 간 비교에서 구멍갈파래 추출물이 분말보다 더 낮았다(P<0.05).
- LPS 접종 전과 후를 비교해보면, 접종 후 전체집단의 IgM과 IgG의 농도가 유의적으로 증가하였음을 확인할 수 있다(P<0.05).
- iNOS의 경우 구멍갈파래 분말 첨가구는 무첨가구와 유의적인 차이가 없었지만 구멍갈파래 추출물 첨가구는 모든 처리구보다 iNOS의 발현이 낮았다(P<0.05).
- IgA는 horse spleen ferritin과 streptococcal antigen에 대하여 항체능력을 가진다고 보고된 바는 있으나 병원성 항원에 대한 임상적 가치에 대해서는 명확하게 규명되지 못한 실정이다(Higgings, 1975). 따라서 LPS 주입으로 IgM과 IgG의 변화를 일으켜 체액성 면역자극을 유도할 수 있었다.
- 또한 구멍갈파래 추출물 첨가구는 구멍갈파래 분말 첨가구보다 증체량이 유의적으로 높았으며(P<0.05), 사료섭취량에서는 구멍갈파래 추출물이 3,893 g으로 무첨가구 3,726 g 보다 유의적으로 높았다(P<0.05).
- 구멍갈파래 분말 첨가구는 유의적인 차이는 없지만 다른 처리구에 비해 수치상 대체로 낮은 생산성을 나타내었다. 본 실험 결과 구멍갈파래는 전반적으로 육계 생산성에 부정적인 영향은 없는 것으로 나타났다. 하지만 생산성 지표를 확인 하기 위한 처리구별 수수가 적었기 때문에 구멍갈파래가 육계 생산성에 미치는 영향과 최적 첨가수준에 대해서는 추가적인 실험이 필요한 것으로 사료된다.
- 05). 위의 결과로 구멍갈파래 분말과 추출물은 LPS 주입에 의한 염증 관련 사이토카인 mRNA 발현을 억제하는 경향을 나타내며, 특히 구멍갈파래 추출물이 발현억제 효과가 더 높은 것으로 확인되었다. 앞선 immunoglobulin 분석결과에서 언급한 바와 같이 구멍갈파래를 가압열수로 추출한 방식이 산성다당의 이용도를 더 높일 수 있는 것으로 사료된다.
- 혈액 내 SOD 유사 활성을 분석한 결과 구멍갈파래 첨가구(Ulva P, Ulva E)는 무첨가구와 면역제제 첨가구보다 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 나타났으며(P<0.05), 구멍갈파래 분말과 추출물 첨가구간의 항산화 활성은 유의적인 차이가 없었다.
후속연구
- 이러한 선행 연구들을 통하여 구멍갈파래는 가축사료 자원으로서 충분한 가능성이 있는 것으로 사료되지만, 현재 국내에서 생산되는 구멍갈파래를 가축에 이용한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 구멍갈파래를 자원화시켜 환경문제를 해결하고 더 나아가 구멍갈파래 생리활성 효과를 가축에게 적용시키는 연구가 필요하다. 본 연구는 구멍갈파래가 새로운 가축사료 소재로서 항산화, 면역조절 효과가 있는지 확인하고자 실시하였으며, 이를 위해 LPS로 염증반응이 유도된 육계에서 혈액 superoxide dismutase(SOD) 유사 활성, immunoglobulin 농도 및 비장 조직 내 cytokine mRNA 발현을 조사하였다.
- 본 실험 결과 구멍갈파래는 전반적으로 육계 생산성에 부정적인 영향은 없는 것으로 나타났다. 하지만 생산성 지표를 확인 하기 위한 처리구별 수수가 적었기 때문에 구멍갈파래가 육계 생산성에 미치는 영향과 최적 첨가수준에 대해서는 추가적인 실험이 필요한 것으로 사료된다.
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