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문제 정의
- ATX가 LPS로 유도된 NF-κB transcriptional activity에 미치는 영향을 조사하였다.
- 결론적으로, 미세조류 유래 생리활성물질인 ATX가 우수한 superoxide radical 소거제이며, LPS로 유도된 대식세포에서 ROS의 생성 및 NF-κB 활성을 저해하므로 iNOS의 발현 및 NO, IL-6, TNF-α 의 생성이 억제됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 ATX를 이용한 항염증제, 항산화제 및 항암치료제 등의 개발가능성을 제시한다.
- 따라서, 본 연구에서는 미세조류로부터 유래한 ATX를 이용하여 항염 및 항산화작용에 대한 기작 및 효과를 검증하고, 류마티스관절염, 알러지, 천식, 암 등의 주요조절인자인 NF-κB의 활성억제를 검증하여 항염증제, 항산화제 및 항암치료제로서의 가능성을 타진하고자 한다.
제안 방법
- 190 μl의 PBS와 50 μl의 125 μM DCFH-DA와 10 μl의 시료를 96 well plate (black)에 넣고 잘 혼합하여 30분 동안 배양하였으며 그 후, fluorescence spectrophotometer (Tecan, USA)를 이용하여 Ex: 485 nm와 Em: 530 nm에서 측정한 후, ROS 생성수준을 fluorescence/mg protein으로 계산하였다.
- 2차 antibody로는 goat anti-mouseIg G-horseradish peroxidase (HRP)를 사용하였으며, iNOS와 NF-κB의 band는 ECL immuno blotting detection reagents(Amersham)를 이용하여 발색하였다.
- ATX가 LPS로 유도된 NF-κB 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 immunoblot analysis로 NF-κB (p65 subunit)의 발현수준을 조사하였다.
- 0, 조도는 3,000-3,500 lux를 선정하였다. ATX의 생산유도를 위해 vegetative cell로부터 cyst cell을 만드는 배양조건을 23℃, 150 rpm, 14,000 lux로 하여 15일째 붉은 색의 배양액을 확인하였다. 균체를 원심분리하여 균을 모으고 25 ml의 아세톤을 첨가하여 파쇄한 후 냉각추출을 반복하였다.
- ATX의 생산을 위해 기본적으로 NB/2 배지(효율적인 성장을 위해 다른 질소원을 추가적으로 첨가)에서 Haematococcusnpluvialis CCAP-34/1F 균주를 배양하였으며, 다른 배양조건으로는 25℃, 160 rpm, 10% inoculum, 초기 pH는 7.0, 조도는 3,000-3,500 lux를 선정하였다. ATX의 생산유도를 위해 vegetative cell로부터 cyst cell을 만드는 배양조건을 23℃, 150 rpm, 14,000 lux로 하여 15일째 붉은 색의 배양액을 확인하였다.
- Inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현은 anti-iNOS antibody를 사용하여 면역화학적 방법으로 분석하였으며, anti-NF-κB p65 monoclonal antibody를 사용하여 NF-κB를 측정하였다.
- LPS로 대식세포를 자극하면 많은 양의 IL-6 및 TNF-α가 방출되며, 이러한 cytokine들에 대한 ATX의 억제효과를 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
- NF-κB reporter construct로 transfection된 RAW264.7 cell인 NGL cell을 ATX의 유무 하에 10 μg/ml의 LPS로 처리하여 실험을 진행하였다.
- NF-κB 매개된 luciferase activity를 총 cell lysates의 단백질함량으로 표준화하였고, 단백질의 양은 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)로 측정하였다.
- NGL cell (5×105 cells/ml)를 16시간 배양한 후, ATX를 농도별(25-100 μM)로 1시간 처리한 후 LPS (1 μg/ml)로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, cell을 분리하여 Promega luciferase assay system (Promega, Madison, CA, USA)과 luminometer (Tecan, USA)를 이용하여 luciferase activity를 측정하였다.
- RAW264.7 cell을 이용하여 LPS로 유도된 NO 생성에 대한 ATX의 억제효과를 측정하였다. 대조군과 비교할 때, LPS군(10 μg/ml, 20 hr)은 약 36배의 NO 생성이 증가하였으며, ATX 처리군(25-100 μM)은 농도의존적으로 LPS로 유도된 NO의 생성을 유의성 있게 억제하였다[25-100 μM (p<0.
- 즉, 세포배양액 100 μl와 Griess 시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 100 μl를 혼합하여 96 well plate에서 15분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 ELISA microplate reader (Tecan, USA)로 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite (NaNO2)로 흡광도를 측정하여 표준곡선을 얻은 후, NO의 농도를 산출하였다.
- 7 cell을 96 well plate에 1×105 cells/well로 분주하여 16시간 배양한 후, ATX를 농도별(25-100 μM)로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후, LPS로 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 20시간 배양하고, NO의 양을 Griess 시약으로 측정하였다. 즉, 세포배양액 100 μl와 Griess 시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 100 μl를 혼합하여 96 well plate에서 15분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 ELISA microplate reader (Tecan, USA)로 흡광도를 측정하였다.
- 균체를 원심분리하여 균을 모으고 25 ml의 아세톤을 첨가하여 파쇄한 후 냉각추출을 반복하였다. 그 후, 감압농축을 하였고 n-Hexane으로 다시 추출한 후, 물로 3번 세척하였고, sodium sulfate anhydrous를 이용하여 잔류수분을 제거한 후 ATX 추출물을 제조하였다. 본 실험에서는 ATX를 0.
- 그 후, 상등액을 제거하고 crude nuclei가 함유된 pellet에 20mM HEPES (pH 7.9), 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 1 mM PMSF를 함유하는 추출용 buffer 50 μl를 넣어 30분간 얼음 위에 방치한 후, 10분간 15,800× g로 원심분리하여 핵분획이 포함된 상등액을 얻어 실험에 이용하였다.
- 세포배양액 안에 존재하는 IL-6와 TNF-α 생성량을 ELISA Kit (Pierce Endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 그 후, lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 20시간 배양하였다. 세포배양액을 제거한 후, 세포에 MTT를 0.5 mg/ml의 농도로 처리하여 4시간 배양한 후, 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 DMSO에 녹여 ELISA microplate reader (Tecan, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 구하였다. 세포의 생존율은 control cell에 대한 백분율로 표시하였다.
- 즉, 세포배양액 100 μl와 Griess 시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 100 μl를 혼합하여 96 well plate에서 15분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 ELISA microplate reader (Tecan, USA)로 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- ATX의 항산화작용(Fig. 7)이 세포 내에서 발생하는 ROS수준에 있어서도 동일한 양상을 나타내는 지를 조사하기 위해 대식세포인 RAW264.7 cell을 이용하여 실험을 수행하였다. LPS 처리군은 대조군에 비해 약 3.
- Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 세포를 배양하여 실험에 이용하였다.
- Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)은 Hyclone(Thermo Scientific Inc., Bremen, Germany)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)은 Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터, penicillin 및 streptomycin은 Gibco/BRL (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
- RAW264.7 cell 내에 생성되는 산소라디칼 ROS를 측정하기 위하여 2',7'-dichloro-dihydrofluorescin diacetate (DCFHDA)를 이용하였다.
- 대식세포주인 RAW264.7 cell은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, NF-κB 전사활성을 측정하기 위하여 NF-κB reporter construct로 transfection된 RAW264.7 cell (이하 NGL cell)은 주명수 교수로부터 분양 받아 사용하였다.
- 그 후, 감압농축을 하였고 n-Hexane으로 다시 추출한 후, 물로 3번 세척하였고, sodium sulfate anhydrous를 이용하여 잔류수분을 제거한 후 ATX 추출물을 제조하였다. 본 실험에서는 ATX를 0.01% dimethyl sulphoxide (DMSO)에 용해하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 3회 이상 실험을 반복하여 얻은 자료를 이용하여 평균±표준편차로 나타내었고 통계학적 분석에는 SPSS version 14.0을 이용하였다.
- 실험 군 간 비교에는 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 independent t-test를 이용하였고, p<0.05를 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- 190 μl의 PBS와 50 μl의 125 μM DCFH-DA와 10 μl의 시료를 96 well plate (black)에 넣고 잘 혼합하여 30분 동안 배양하였으며 그 후, fluorescence spectrophotometer (Tecan, USA)를 이용하여 Ex: 485 nm와 Em: 530 nm에서 측정한 후, ROS 생성수준을 fluorescence/mg protein으로 계산하였다. 시료의 protein 함량은 BCA protein assay를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- LPS 처리군은 대조군에 비해 약 3.3배의 ROS 생성량이 증가하였으며, 이러한 ROS의 증가는 ATX에 의해 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 8).
- ATX가 superoxide radical과 반응하여 이를 얼마나 감소시키는 지를 조사한 결과, 5 mg/ml의 ATX가 동일농도의 α-tocopherol에 비해 superoxide radical 소거능이 더욱더 높은 것으로 나타났으며, 이는 ATX가 강력한 항산화 제인 α-tocopherol 보다 더 우수한 항산화제라는 것을 의미한다.
- ATX를 이용하여 염증인자 NO의 생성억제와 iNOS 단백질 발현억제와의 상관관계를 알아보기 위하여 immunoblot analysis로 단백질발현을 조사한 결과, LPS에 반응한 iNOS 단백질은 현저하게 증가하였으며, ATX는 50 및 100 μM의 농도에서 iNOS 단백질발현을 억제하였다(Fig. 3).
- 이는 항산화제가 세포의 신호전달체계에서 항염증제와 거의 같은 역할을 담당할 수도 있다는 것을 시사한다. DCFH-DA를 이용한 ROS 측정결과, ATX는 세포내부의 ROS 축적을 강력하게 제거하였다. 이러한 ATX의 항산화효능이 NF-κB 활성을 억제시키는 이 물질의 항염증효능과 상호 깊은 연관성이 있을 것으로 사료된다.
- LPS 처리 후, 30 및 60분에서 NF-κB 활성이 나타났으며, 100 μM의 ATX 처리로 억제되었다(Fig. 6).
- LPS는 IL-6 및 TNF-α의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, ATX (100 μM)는 LPS로 유도된 IL-6 및 TNF-α의 생성을 유의성 있게 억제시켰다.
- LPS로 유도된 IL-6 및 TNF-α의 생성에 대한 ATX의 억제효과는 enzyme immunoassay 방법을 이용하여 확인하였으며 LPS 처리군(10 μg/ml, 20 hr)은 대조군과 비교해 약 11배의 IL-6 (p<0.05) 및 약 23배의 TNF-α (p<0.01)를 생성함으로 유의성 있는 증가를 보였다.
- NO, IL-6 및 TNF-α를 억제하는 분자적인 기작을 이해하기 위해 LPS로 유도된 NF-κB 활성에 대한 ATX의 효능을 immunoblot으로 분석한 결과, ATX가 LPS로 유도된 NF-κB 활성을 효과적으로 억제하였다.
- 결과를 종합해 볼 때, ATX로 NF-κB transcriptional activity를 억제시키는 것이 NF-κB의 활성억제와 연계됨을 시사한다.
- 결론적으로, 미세조류 유래 생리활성물질인 ATX가 우수한 superoxide radical 소거제이며, LPS로 유도된 대식세포에서 ROS의 생성 및 NF-κB 활성을 저해하므로 iNOS의 발현 및 NO, IL-6, TNF-α 의 생성이 억제됨을 확인 할 수 있었다.
- 대조군과 비교할 때, LPS군(10 μg/ml, 20 hr)은 약 36배의 NO 생성이 증가하였으며, ATX 처리군(25-100 μM)은 농도의존적으로 LPS로 유도된 NO의 생성을 유의성 있게 억제하였다[25-100 μM (p<0.01)](Fig. 1).
- 더욱이 NF-κB dependent luciferase assay로 측정한 결과, ATX (100 μM)는 LPS로 유도된 luciferase 활성을 현저히 억제하였다.
- 또한 LPS로 유도된 IL-6 및 TNF-α 생성에 대한 ATX의 억제효과가 100 μM의 ATX 농도에서 모두 유의성 있게(p<0.05) 나타났다.
- 또한, ATX의 세포독성효과를 MTT 방법을 이용하여 측정한 결과, 세포생존율은 100 μM의 농도에 이르기까지 영향을 받지 않았다(Fig. 2).
- 생성된 NO 양을 Griess 시약으로, iNOS 단백질발현을 immunoblot으로 분석한 결과, ATX는 LPS로 유도된 NO 생성 및 iNOS 단백질발현 수준을 현저히 억제시켰다.
- 이 결과는 ATX가 NF-κB 활성을 억제한다는 것을 나타내며, 이는 ATX가 IκBα 분해를 저해하여 NF-κB가 핵으로 전위하는 것을 억제함을 의미한다.
- 이러한 결과는 ATX가 LPS로 유도된 대식세포에서 NF-κB 경로를 조절할 수 있다는 것을 의미한다.
- 즉, ATX 처리군(25-100 μM)은 농도의존적으로 LPS로 유도된 ROS 생성을 유의성 있게 억제하였다(p<0.01).
- 특히, 이 농도에서 ATX는 LPS로 유도된 IL-6 및 TNF-α 생성을 각각 65.2%, 21.2% 억제시킴으로 IL-6에 있어 약 3배 더 높은 억제효과를 보였다.
- 특히, 이 농도에서 ATX는 LPS로 유도된 IL-6의 생성을 65.2% 억제시켰고, TNF-α의 생성을 21.2% 억제시킴으로 IL-6에 있어 약 3배 더 높은 억제효과를 보였다(Fig. 4).
후속연구
- 생성된 NO 양을 Griess 시약으로, iNOS 단백질발현을 immunoblot으로 분석한 결과, ATX는 LPS로 유도된 NO 생성 및 iNOS 단백질발현 수준을 현저히 억제시켰다. 이는 ATX가 iNOS의 기능을 제어하여 NO 생성을 감소시키므로 신경질환[2]을 포함하는 염증성 질병의 치료에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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