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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 천년초 꽃잎(Opuntia humifusa petal)을 시료로 하여 항균, 항산화 효과 및 암세포 성장억제효과를 각각 검토하여 향후 천년초의 응용범위를 다양화하기 위한 일환으로 본 연구를 실시하여 보고하고자 하였다.
가설 설정
- 2) The different small letters mean significant difference among the different concentrations(column) in the same solvent(α<0.05).
- 3) The different capital letters mean significant difference among the solvent at the same concentration in the row(α<0.05).
제안 방법
- 48시간동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 200 μL를 첨가하여 천천히 녹인 후 multi-detection microplate를 이용하여 50 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- HepG2, MCF-7, HT29와 B16F10의 각 세포주는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 주 2~3회 정도 배지를 교환하고 세포배양용 petri dish에 각 세포주가 5×104 cells/mL 정도 증식되면 phosphate buffered saline(PBS)로 2번 세척한 후 trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA, Gibco)를 2 mL씩 처리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배지로 세포가 골고루 분산되도록 희석하여 세포배양용 petridish에 10 mL씩 분할하여 주입하고 주 2회 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
- 시료 무첨가구에는 시료 대신 시료를 녹인 용매 50 μL를 첨가하여 시료 첨가구에 대한 흡광도의 감소비율로 나타내었다. Positive control로 vitamin C(ascorbic acid, SIGMA)를 동일한 방법으로 실험하여 흡광도 감소를 측정하였다.
- 추출한 시료를 여과한 후 rotary evaporator로 감압농축시켜 methanol추출물(OHM)을 얻었다. methanol 추출물(OHM)에 dichloromethane(DCM)과 물을 1:1로 첨가하여 dichloromethane(DCM)층과 수층을 얻었으며 dichloromethane(DCM)층은 헥산과 85% methanol을 첨가하여 hexane(OHMH)층과 methanol(OHMB)층으로 분획하였으며, 수층은 butanol을 첨가하여 다시 butanol(OHMB)층과 수층(OHMA)을 얻었다. Hexane, methanol 및 butanol 층은 감압 농축하였고, 수층은 동결건조 후 본 실험에 사용하였다.
- 각 시료 50 μL에 1.5x10-4 M DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액 200 μL를 가하고, vortex mixer로 10초간 진탕한 후 실온에서 30분 동안 방치하여 520 nm에서 흡광도(Absorbance)를 측정하였다.
- 항균용 평판 배지를 멸균 후 각 20 mL씩 petri dish에 분주하여 응고시킨 후 배양한 시험 균을 무균적으로 첨가하여 배지 위에 다시 100~200 μL씩 분주하여 평판배지를 만들었다. 각 용매 분획물의 농도를 2, 5, 10, 20 mg/mL를 가하여 멸균된 disc(직경 6 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)에 흡수, 건조시켜 균주가 도말된 plate표면에 올려놓은 후 37℃ incubator에서 24~48시간 배양하여 paper disc 주위에 생성된 clear zone의 직경(mm)을 5회 반복 측정하여 각각 평균치를 구하였다.
- 그리고 10 μM ONOO‾를 첨가한 후 microplate multi-detection reader를 사용하여 형광광도(Fluorescence)를 측정하였다.
- 48시간동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 200 μL를 첨가하여 천천히 녹인 후 multi-detection microplate를 이용하여 50 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 본 연구는 천년초의 꽃잎을 이용하여 추출, 분획과정을 거쳐서 각각 water, butanol, methanol, hexane 층을 얻었고 각 층의 항균, 항산화 및 암세포 성장억제효과를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 항균실험 결과에서는 3가지의 균주에서 OHMM, OHMH층에서 농도 의존적으로 항균효과가 증가하였고, 특히 다른 균주에 비해 Clostridium perfringens에 대해 뛰어난 항균효과를 나타냈다.
- 본 실험에 사용된 천년초(Opuntia humifusa, OH) 꽃은 2008년 6월 전남 여수시 돌산읍 라파엘 농장에서 구입하여 동결건조 하였다. 이 시료를 추출 ․ 분획하여 항균, 항산화 및 암세포 성장억제 효과의 측정에 사용하였다.
- 이를 위해 각 세포주를 1×104 cells/well의 농도로 맞추고 96 well에 각각 200 μL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl-sulfoxide(DMSO)에 녹여서 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 첨가하였다.
- 전자공여능은 아래의 방법에 의하여 시료의 DPPH의 환원력을 측정하였다. 각 시료 50 μL에 1.
- 천년초(Opuntia humifusa, OH) 꽃잎을 methanol로 추출하여 hexane층, methanol층, butanol층 및 수층의 용매별로 분획하였다. 천년초 꽃잎 223.
- 천년초(Opuntia humifusa, OH) 꽃잎을 동결건조 한 후, 상온에서 methanol을 사용하여 2회 추출하고, 다시 methanol과 dichloromethane(DCM)을 1:1로 섞은 용액으로 2회 추출하였다. 추출한 시료를 여과한 후 rotary evaporator로 감압농축시켜 methanol추출물(OHM)을 얻었다. methanol 추출물(OHM)에 dichloromethane(DCM)과 물을 1:1로 첨가하여 dichloromethane(DCM)층과 수층을 얻었으며 dichloromethane(DCM)층은 헥산과 85% methanol을 첨가하여 hexane(OHMH)층과 methanol(OHMB)층으로 분획하였으며, 수층은 butanol을 첨가하여 다시 butanol(OHMB)층과 수층(OHMA)을 얻었다.
- 항균용 평판 배지를 멸균 후 각 20 mL씩 petri dish에 분주하여 응고시킨 후 배양한 시험 균을 무균적으로 첨가하여 배지 위에 다시 100~200 μL씩 분주하여 평판배지를 만들었다.
대상 데이터
- USA)와 Cayman Chemical Co.(Ann Arbor. MI. USA)로부터 구입한 것을 사용하였다.
- methanol 추출물(OHM)에 dichloromethane(DCM)과 물을 1:1로 첨가하여 dichloromethane(DCM)층과 수층을 얻었으며 dichloromethane(DCM)층은 헥산과 85% methanol을 첨가하여 hexane(OHMH)층과 methanol(OHMB)층으로 분획하였으며, 수층은 butanol을 첨가하여 다시 butanol(OHMB)층과 수층(OHMA)을 얻었다. Hexane, methanol 및 butanol 층은 감압 농축하였고, 수층은 동결건조 후 본 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 암 세포주는 인체 간암세포주인 HepG2(human hepatocellular carcinoma), 유방암세포주인 MCF-7(human breast adenocarcinoma pleural effusion)과 대장암세포주인 HT29(human colon adenocarcinoma)와 마우스 유래의 피부암세포주인 B16-F10(mouse melanoma)를 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하여 배양시킨 후 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 천년초(Opuntia humifusa, OH) 꽃은 2008년 6월 전남 여수시 돌산읍 라파엘 농장에서 구입하여 동결건조 하였다. 이 시료를 추출 ․ 분획하여 항균, 항산화 및 암세포 성장억제 효과의 측정에 사용하였다.
- 천년초(Opuntia humifusa, OH) 꽃잎을 동결건조 한 후, 상온에서 methanol을 사용하여 2회 추출하고, 다시 methanol과 dichloromethane(DCM)을 1:1로 섞은 용액으로 2회 추출하였다. 추출한 시료를 여과한 후 rotary evaporator로 감압농축시켜 methanol추출물(OHM)을 얻었다.
- 항균 활성 검색에 사용된 균은 모두 gram 양성인 4가지 균주 즉 Rhodococcus equi, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens(welchii균), Bacillus cereus를 이용하였으며, 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배지는 nutrient agar, beef extract, peptone을 사용하였다. 항균실험에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받아 활성화시켜 사용하였다.
- 항균 활성 검색에 사용된 균은 모두 gram 양성인 4가지 균주 즉 Rhodococcus equi, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens(welchii균), Bacillus cereus를 이용하였으며, 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배지는 nutrient agar, beef extract, peptone을 사용하였다. 항균실험에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받아 활성화시켜 사용하였다. 각 용매 분획물의 항균효과는 다음과 같이 실험하였다.
데이터처리
- ONOO‾의 바탕용액은 0.3N NaOH를 사용하였고 평균한 값으로 소거율을 계산하였다.
- 본 실험의 연구에서 항균 실험결과는 7~10회 반복 측정하였고, 항산화 및 항암효과에 대한 실험결과는 3회 반복 측정 후 IBM SPSS statistics(version 19)를 사용하여 측정한 결과의 평균과 표준편차를 나타내었고, 시료의 항산화활성은 농도별, 용매별로 ANOVA와 Duncan's multiple range test로검정하였으며, 항암효과는 용매별 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 96 well plate에 시료를 농도별로 취하고 Crow의 방법(Crow JP 1997)에 의해 ONOO‾ 제거능을 측정하였다.
- 천년초 분획물의 암세포 증식 억제 효과는 MTT assay를 사용하여 행하였다. MTT assay는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서 황색수용물질인 MTT가 미토콘드리아내의 탈수소효소 작용에 의하여 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용한다.
성능/효과
- 2000 μg/mL의 농도에서 96.4%의 DPPH 유리기 소거효과를 나타낸 positive control인 비타민 C와 비교하였을 때, OHMM층, OHMB층, OHMA층, OHMH층에서 각각 58.2±0.59%, 49.1±0.41%, 20.7±1.39% 및 5.9±1.09%의 순으로 DPPH 유리기 소거효과를 나타내 메탄올 층에서 가장 높게 나타났으며 용매별로 유의적인(α 0.05) 차이를 나타냈다.
- 4가지 암세포 증식 억제효과 실험에서는 200 μg/mL에서 모두 80% 이상으로 높은 효과를 보였고, 동일농도에서 피부암 세포에 대한 항암억제 효과가 가장 높게 나타났으며, 다음으로 유방암, 대장암, 간암 순으로 나타났으며, 헥산층에서 비교적 높게 나타났다.
- Rhodococcus equi 에 대한 천년초 꽃잎의 각 용매별 분획물의 clear zone의 크기를 측정한 결과, OHMH 층에서는 모든 농도에서 항균효과가 있었으며 2, 5, 10, 20 mg/mL에서 각각 7.0±0.00, 8.5±0.71, 9.0±0.00, 9.75±0.88 mm의 clear zone이 측정되었고, OHMM 층에서는 최고 농도인 20 mg/mL에서 8.35±0.47 mm의 clear zone이 측정되었다.
- 가스괴저균인 Clostridium perfringens 에 대한 결과에서는 OHMA와 OHMB층에서는 항균 효과가 나타나지 않았으나 OHMM 층에서는 10 mg/mL 농도에서는 8.81±0.59 mm로 나타났고, 최고 농도인 20 mg/mL에서 10.28±0.44 mm의 clear zone이 측정되었다.
- 가장 높은 농도인 200 μg/mL에서 헥산층은 93.3±0.9%로 성장억제효과가 가장 높게 나타났으며, 메탄올층은 93.1±0.9%, 수층은 55.9±3.4%, 부탄올층은 21.5±1.9%의 효과가 나타났으며, 헥산층과 메탄올층은 100 μg/mL부터는 차이가 없었으나, 헥산층과 메탄올층이 수층과 부탄올층에 비해 전 농도에서 유의적으로(α 0.05) 높게 나타났다.
- 독소형 식중독 유발균인 Staphylococcus aureus 에 대한 천년초 꽃잎의 각 용매별 분획물의 측정 결과, OHMM층에서는 10 mg/mL부터 항균효과가 있었으며, 특히 최고 농도인 20 mg/mL에서 9.0±0.00 mm의 clear zone이 측정되었다.
- 동일한 농도에서 용매별로 보면 최고농도인 1000 μg/mL에서 positive control인 penicillamine은 97.5%의 ONOO‾제거활성을 나타낸 결과에 대해 천년초 꽃잎의 OHMB층에서는 90.7±1.27%, OHMM층의 경우 80.3±3.28%, 그리고 OHMA층에서는 68.8±3.11%의 제거능이 측정되어 유의적인(α 0.05) 차이를 나타냈다.
- 분획물의 농도가 50 μg/mL부터 헥산층이 다른 분획물에 비해 유의적으로(α<0.05) 높게 나타났으며, 100 μg/mL 농도에서는 메탄올층이 헥산층보다는 낮았으나 수층과 부탄올층에 비해 유의적으로 높았고, 150 μg/mL농도에서는 메탄올층이 헥산층의 수준으로 높아져 차이가 없었고, 가장 높은 농도인 200 μg/mL에서 헥산층은 89.9±1.1%로 성장억제효과가 가장 높게 나타났고, 다음으로 메탄올층은 84.7±2.7%로 나타나 헥산층과 차이가 없었으며, 수층은 39.7±1.5%, 부탄올층은 36.4± 1.4%의 효과가 나타나 두층간의 차이는 없었으나 헥산과 부탄올층에 비해 유의적으로 낮게 나타났다.
- 수층과 부탄올층은 전 농도에서 크게 차이가 없었으며, 헥산층은 낮은 농도에서는 다른 분획물에 비해 효과가 낮았으나 100 μg/mL부터는 수층과 부탄올층보다 증가하기 시작하여 200 μg/mL 농도에서는 모든 분획물에 비해 가장 높게 나타났다.
- 용매 분획별 항산화 활성은 추출물의 농도가 증가할수록 항산화 효과가 유의적으로(α 0.05) 높게 나타났음을 알 수 있었다.
- 4%의 효과가 나타나 두층간의 차이는 없었으나 헥산과 부탄올층에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. 이러한 결과로 볼 때 천년초 꽃잎의 분획물중 4가지 암세포에서 가장 효과가 높게 나타난 것은 헥산층이었고, 다음이 메탄올층으로 나타났고, 간암세포를 제외하고는 다음으로 수층, 부탄올 층으로 나타났으나, 간암세포에서는 부탄올층이 수층보다 약간 높게 나타났다. 전체적으로 대부분의 암세포의 경우 헥산층과 메탄올층간의 차이는 없었으나, 헥산층과 메탄올층이 수층과 부탄올층에 비해 유의적으로(α 0.
- 전 농도를 통하여 각 분획물에 따른 경향이 비슷하게 나타났으며, 분획물 농도가 200 μg/mL에서 헥산층은 88.0±0.2%로 성장억제효과가 가장 높았고, 메탄올층은 85.1±0.5%, 수층은 45.2±0.8%, 부탄올층은 31.5±1.5%의 효과가 나타나 헥산층과 메탄올층이 수층과 부탄올층에 비하여 유의적으로(α0.05) 높게 나타났다.
- 전체적으로 대부분의 암세포의 경우 헥산층과 메탄올층간의 차이는 없었으나, 헥산층과 메탄올층이 수층과 부탄올층에 비해 유의적으로(α 0.05) 높게 나타난 것을 알 수 있었다.
- 즉 200 μg/mL농도에서 헥산층이 85.2±3.4%로 성장억제효과가 가장 높았으며, 메탄올층은 83.1±1.0%, 부탄올층은 36.0±1.3%, 수층은 31.7±1.7%의 효과가 나타나 높은 농도에서 헥산층과 메탄올층의 경우 다른 분획물보다 유의적으로(α 0.05) 높게 나타났다.
- 천년초 꽃잎의 항산화 효과에서 peroxynitrite(ONOO‾) 제거능 측정결과, 부탄올, 메탄올, 수층 순으로 항산화효과가 높게 나타났으며, 특히 부탄올층에서 가장 우수한 항산화 효과가 나타났다.
- 05) 차이를 나타냈다. 천년초를 이용하여 peroxynitrite 제거능을 측정한 결과는 없었으므로 본 연구와 비교하기는 어려웠으나 천년초 꽃잎의 경우 peroxynitrite 제거능을 이용한 항산화연구에서 부탄올층에서 우수한 항산화 효과가 나타난 것을 알 수 있었다.
- 59%)을 얻었다. 천년초의 용매별 분획물의 수득율은 용매의 극성이 높을수록 분획물의 수율이 높다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구는 천년초의 꽃잎을 이용하여 추출, 분획과정을 거쳐서 각각 water, butanol, methanol, hexane 층을 얻었고 각 층의 항균, 항산화 및 암세포 성장억제효과를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 항균실험 결과에서는 3가지의 균주에서 OHMM, OHMH층에서 농도 의존적으로 항균효과가 증가하였고, 특히 다른 균주에 비해 Clostridium perfringens에 대해 뛰어난 항균효과를 나타냈다. 천년초 꽃잎의 항산화 효과에서 peroxynitrite(ONOO‾) 제거능 측정결과, 부탄올, 메탄올, 수층 순으로 항산화효과가 높게 나타났으며, 특히 부탄올층에서 가장 우수한 항산화 효과가 나타났다.
후속연구
- 이와 같은 결과로 볼 때 지금까지 연구되지 않은 천년초 꽃잎 또한 항균, 항산화, 항암효과에 뛰어난 활성을 나타내어 앞으로 여러 가지 유용한 기능성 식품과 제품의 개발을 기대할 수 있을 것으로 보인다.
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