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문제 정의
- Probiotics의 한 종류로 분류되는 L. acidophilus의 급여가 마우스의 건강증진과 생체 면역체계에 어떤 영향을 미치는지 밝히기 위해 일련의 실험을 수행하여 다음과 같이 결론을 얻을 수 있었다.
- acidophilus는 장내에서 정상적으로 서식하면서 오랫 동안 발효산업에서 사랑받아온 균주이며 probiotic의한 분야를 차지하고 있다. Probiotic에 대한 연구에서 발효균주의 효과가 다양한 분야에서 밝혀지자 축산업에서도 이를 산업적으로 여러각도로 사용하고 있으나 현장에서의 결과에서 악취제거를 위한 이용에서는 전혀 효과를 보지 못하거나 오히려 더 역겨운 악취를 유발하는 경우가 있고, 성장촉진을 위한 사용에서는 생균제 이용을 통한 성장 촉진 보다는 탄수화물 또는 단백질의 섭취량 증가로 인한 성장촉진이 더 빠르며 질병예방 차원에서는 오히려 백신접종을 통한 예방이 더 효과적으로 나타나고 있어 축산 현장에서의 생균제를 활용에 대한 의문이 증폭되고 있으며 농가에서도 정부지원에 의존하고 개인별 생균제 구매를 통한 이용은 저조한 실정인바 발효균주에 대한 현장 적용의 방법을 찾고자 이 실험을 하였다. 이 실험에서 나타난 바와 같이 체중 관리 측면에서는 L.
- 축산업에서 probiotic을 이용한 산업은 그다지 많지 않으며 축산 생산물에서 probiotic을 이용한 산업으로 대표적인 것이 요구르트 생산이며 직접적으로 축산에 이용하는 방법은 현재 축산 규모의 거대화 때문에 발생하는 악취제거를 위한 생균제 이용, 일부 바이러스성, 세균성에 의한 소화기 질병을 줄이기 위하여 생균제를 이용하고 있으나 현장에서는 실험실에서의 결과와 달리 큰 효과를 보지 못하고 있다. 이에 생균제의 하나 L. acidophilus를 이용하여 그 효과를 검정하고 현장에서의 생균제 이용에 대한 기준을 제시하고자 하는데 이번 실험의 목적이 있다.
제안 방법
- 이후 용액 A (16 ml)와 용액 B (4 ml)를 균질하게 섞어 눈금이 새겨진 4각형 페트리디시에 부어 높이가 일정하게 굳혔다. Gel이 굳으면 정중앙에 구멍을 내어 정량이 끝난 cationic peptide를 균일한 함량으로 넣고 실온에서 18시간 방치 후 지름을 측정하였다.
- L. acidophilus를 10일간 급여한 후 운동능력의 향상을 관찰하기 위한 방법으로 수영 능력을 측정하였으며 수영 능력에 대한 측정은 마우스가 물속에서 5초 이상 정지된 시간을 기준으로 측정하였다.
- L. acidophilus를 10일간 급여한 후 체중의 변화를 관찰하기 위하여 그룹별로 체중을 측정하였다.
- L. acidophilus를 투여한 후 3.6% chloral hydrate를 체중 10 g당 0.1 ml를 복강으로 주입하여 마취시킨 후 복강을 절개하여 복대정맥으로부터 혈액을 채취하여 EDTA가 함유된 진공 튜브에서 균질화 시킨 후 HEMA VET (Drew, Italy)를 이용하여 총 백혈구 수, 호중성백혈구, 림프구, 단핵백혈구, 호산성백혈구, 호염기성백혈구, 총 적혈구, 혈색소, 혈소판 등 9종을검사하였으며 또 다른 혈액은 혈청 내 화학치를 측정 하기 위하여 응고시킨 후 혈청을 분리하여 혈청분석기를 이용하여 cholesterol, triglyceride, albumin, total protein, calcium 등 5종을 측정하였다.
- BCA Protein assay kit에서 A 시약에 B 시약을 1/50의 비율로 만들어 반응액 200 μl를 각 well에 넣었다. Microplate의 표면을 밀폐되게 덮고 37℃에서 30분간 반응시킨 후, microplate를 꺼내어 70% 에탄올로 microplate 바닥을 닦아준 다음 스펙트로미터(550 nm)에서 OD값을 읽어 cationic peptide 양을 계산하였다.
- 면역염색은 Histostain-sp kit (Invitrogen, USA)를 사용하였으며 그 과정은 조직표본을 자이렌에 5분간씩 3번 동안 담가 조직 내 파라핀을 제거하고, 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 50% 에탄올 순으로 각기 5분간씩 두어 함수 시켜 조직이 마르지 않도록 한 다음 제조사에서 제공하는 serum blocking reagent로 10분간 처리하여 조직 내 비 특이 반응을 없게 하고, 1차 anti-rabbit human lysozyme (Dako, Denmark)을 PBS로 200배 희석하여 1시간 동안 감작시켰다. 감작시킨 조직은 PBS로 5분씩 2회 씻어낸 다음 제조사에서 제공하는 2차 항체를 30분간 조직에 감작시킨 다음 발색제로 30분간 반응시킨 후 현미경에서 검사하였다.
- 장에 대한 선천성 면역물질인 lysozyme을 확인하기 위하여 마우스의 십이지장을 10% 중성 포르말린에 고정 후 조직표본 제작 과정을 거친 후 조직을 절편 후 통상적인 H&E 염색을 하였으며, 일부는 면역 조직화학염색을 하였다. 면역염색은 Histostain-sp kit (Invitrogen, USA)를 사용하였으며 그 과정은 조직표본을 자이렌에 5분간씩 3번 동안 담가 조직 내 파라핀을 제거하고, 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 50% 에탄올 순으로 각기 5분간씩 두어 함수 시켜 조직이 마르지 않도록 한 다음 제조사에서 제공하는 serum blocking reagent로 10분간 처리하여 조직 내 비 특이 반응을 없게 하고, 1차 anti-rabbit human lysozyme (Dako, Denmark)을 PBS로 200배 희석하여 1시간 동안 감작시켰다. 감작시킨 조직은 PBS로 5분씩 2회 씻어낸 다음 제조사에서 제공하는 2차 항체를 30분간 조직에 감작시킨 다음 발색제로 30분간 반응시킨 후 현미경에서 검사하였다.
- 선천성 면역물질인 lysozyme의 활력도를 측정하기 위하여 이 실험을 수행하였으며 Osserman과 Lawlor (1966)의 방법을 변형하여 사용하였다. 용액 A는 66 mM sodium phosphate buffer (pH 7.
- 실험군 1에는 배양된 L. acidophilus를 1×106 CFU, 실험군 2에는 1×1010 CFU를 1회/1일, 총 10일간 투여하였으며 투여 10일 후 공시동물을 해부하여 각 실험에 사용하였다.
- 장에 대한 선천성 면역물질인 lysozyme을 확인하기 위하여 마우스의 십이지장을 10% 중성 포르말린에 고정 후 조직표본 제작 과정을 거친 후 조직을 절편 후 통상적인 H&E 염색을 하였으며, 일부는 면역 조직화학염색을 하였다.
대상 데이터
- L. acidophilus strain CECT 4529 16S ribosomal RNA gene (FJ 556999, Genbank)으로 primer 염기서열은 forward 5'-cat ggg tag cga aca gga tt-3', reverse 5'-taa ggt tct tcg cgt tgc tt-3'으로 자체 제작하여 사용 하였다.
- 공시동물은 ICR 마우스(대한바이오링크, Korea)를 구매하여 실험에 사용하였으며 동물은 그룹별로 수컷 5 마리씩 대조군, 실험군 1 그리고 실험군 2로 분류하였다. 체중은 23∼26 g 사이의 마우스를 사용하였고 사료는 마우스 사료를 무제한으로 공급하고 음용수로는 일반 수돗물을 제공하였다.
- acidophilus 314 (ATCC, USA)를 사용하였다. 균주는 ATCC사에서 권장하는 MRS broth (MB cell, Korea)와 MRS agar (MB cell, Korea)를 이용하여 배양하였으며, 배지 조제는 MRS broth의 경우 증류수 1 L에 MRS broth powder 54.3 g을 넣은 후 Tween 80, 1 ml를 넣은 후 powder를 완전히 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균 후 사용하였다. MRS agar는 증류수 1 L에 MRS agar powder 67.
- 이 실험에서 사용한 균주는 L. acidophilus 314 (ATCC, USA)를 사용하였다. 균주는 ATCC사에서 권장하는 MRS broth (MB cell, Korea)와 MRS agar (MB cell, Korea)를 이용하여 배양하였으며, 배지 조제는 MRS broth의 경우 증류수 1 L에 MRS broth powder 54.
- 체중은 23∼26 g 사이의 마우스를 사용하였고 사료는 마우스 사료를 무제한으로 공급하고 음용수로는 일반 수돗물을 제공하였다.
이론/모형
- Cationic peptide는 Lowry법을 응용한 BCA Protein assay kit (Pierce, USA)를 이용하여 제조사가 지시하는 방법으로 실시하였다(Lowry 등, 1951). 요약하면, 바닥이 평평한 Microplate에 제조사가 제공하는 표준단백질 용액을 이용하여 표준곡선 제작용과 추출한 cation peptide 각 well에 25 μl씩 분주하였다.
- L. acidophilus는 장에서 정상적으로 서식하는 균속들 중 하나이므로 마우스의 주령에 따라 발현이 어떻게 달라지는지를 보기 위하여 PCR법을 이용하여 검사하였다. L.
- 선천성 면역물질을 관찰하기 위해서 cationic peptide를 추출하여 사용하는데 추출은 Cole 등(1999)의 방법을 응용하였다. 추출과정은 각 장기를 200 mg씩 잘라 1.
- acidophilus strain CECT 4529 16S ribosomal RNA gene (FJ 556999, Genbank)으로 primer 염기서열은 forward 5'-cat ggg tag cga aca gga tt-3', reverse 5'-taa ggt tct tcg cgt tgc tt-3'으로 자체 제작하여 사용 하였다. 총 genomic DNA 추출은 AccurePrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 이용하였으며 추출방법은 제조사에서 지시하는 것에 따랐다. 요약 하면, 약 30 mg의 십이지장 조직을 채취하여 tissue lysis buffer 200 μl를 넣어 조직을 파쇄한 다음, proteinase 20 μl를 넣어 조직이 완전히 lysis될 때 까지 60℃ 항온수조에서 1시간 동안 보존하였다.
성능/효과
- acidophilus를 급여의 경우 대조군에서 높게 나타났다. Hemoglobin 및 thrombocytes 수치에서도 L. acidophilus 투여군이 L. acid ophilus를 투여하지 않은 대조군 보다 높게 나타났다.
- 간, 십이지장, 고환은 대조군보다 L. acidophilus 를 급여한 경우 cationic peptide의 활력도가 육안으로 관찰될 수 있을 정도로 좋게 나타났으며 L. acidophilus (1×1010 CFU)의 경우에는 현저하게 활력도가 좋았다.
- 넷째, 생체 면역시스템에 있어서는 선천성 면역물질인 cationic peptide의 분비가 각 장기에서 L. acidophilus (1×1010 CFU) 투여군이 가장 많았으며 특히 십이장에서는 대조군에 비하여 2배 정도 분비 되었으며, cationic peptide의 하나인 lysozyme의 발현에서도 L. acidophilus (1×1010 CFU) 급여군에서 가장 많았다.
- 대조군에서는 수영 지속 시간이 평균 145초로 나타났으며, L. acidophilus (1×106 CFU)를 먹인 경우에는 수영 지속 시간이 평균 248초, L. acidophilus (1×1010 CFU)를 먹인 실험군에서는 평균 446초로 나타났다.
- 둘째, 체중 변화에 대한 실험에서 L. acidophilus (1×1010 CFU)를 급여할 경우 평균 체중이 감소되었고, L. acidophilus (1×106 CFU)를 급여한 실험군에서는 평균 체중이 증가하였다.
- 선천적 면역 물질 분비에 대한 실험에서 간, 폐, 비장, 고환 및 십이지장에서의 cationic peptide 활력도를 측정한 결과 대조군보다 L. acidophilus를 먹인 양에 따라 그 활력도에 있어 증가하는 것을 알 수 있었으며 특히 십이지장에서는 L. acidophilus (1×1010 CFU)를 급여한 경우 대조군과 L. acidophilus (1×106 CFU)를 먹인 것에 비하여 2배 정도의 cationic peptide의 활력도가 증가한 것으로 나타나 발효균주가 장에 도달할 수 있을 정도의 양을 섭취할 경우 건강 증진 뿐만 아니라 선천성 면역물질의 활력도 증가에도 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 셋째, 혈액분석에서는 L. acidophilus (1×1010 CFU) 를 먹인 실험군은 L. acidophilus를 먹이지 않은 대조 군에 비하여 총 백혈구수가 증가하였다.
- 수영 능력면에서는 L. acidophilus (1×1010 CFU) 를 먹인 실험군에서는 446초를 나타나 L. acidophilus (1×106 CFU) 248초, 대조군 145초로 나타나 이는 L. acidophilus의 섭취량이 증가할수록 운동능력이 향상하는 것으로 보이며 이는 운동능력 향상 뿐만 아니라 개체의 건강 증진에도 도움이 된다는 것을 알 수 있 었다.
- acidophilus (1×1010 CFU)를 먹인 경우에서는 대조군보다 301초 더 오랫 동안 수영 시간을 유지하였다. 수영 능력에서 대조군과 비교할 때 L. acidophilus를 섭취한 실험군에서 모두 P＜0.05로 그 유의성이 인정되었다.
- 이 실험에서 나타난 바와 같이 체중 관리 측면에서는 L. acidophilus의 섭취량에 따라 다르게 나타났는데 L. acidophilus를 1×106 CFU 수준으로 섭취할 때 사람에 있어 체중 감소 보다는 체중 증가의 역작용을 가져올수 있으나 단기 비육을 목적으로 하는 축산에는 발효 균주의 급여가 오히려 긍정적인 효과를 가져올 것으로 추정된다.
- acidophilus는 장에서 장내 세균총의 하나로 서식하는 관계로 숙주의 생존시간이 경과함에 따라 그 분포도 줄어들 것이라고 생각된다. 이를 알아보기 위한 실험으로 마우스의 생존기간에 따른 L. acidophilus 의 장내 생존율을 유전자 검사법으로 조사한 결과 마우스의 경우 12주령이 경과하면 L. acidophilus의 분포량이 반 이하로 감소함을 알 수 있어 어린 동물에서의 probiotics의 급여는 큰 효과를 볼 수 없다는 것을 알 수 있었다. 축산 현장에서 사용되는 생균제의 함량은 현재 판매되고 있는 생균제의 경우 평균 2.
- 이번 실험에서 또 하나의 결과는 정상적으로 분포 하는 L. acidophilus의 감소하는 경향에 관한 것으로 생체가 포유를 하고 있거나 포유 후 일정 기간은 L. acidophilus가 정상적으로 상존하며, 생존시간이 연장 되고 발효가 어려운 사료 섭취 및 비발효성 세균의 침입기회 증가 등으로 인하여 L. acidophilus의 분포는 점차 감소하며 마우스는 12주가 지나면서 현저하게 감소하는 경향을 보이고 있어서 지속적인 발효균의 섭취가 건강 유지에 중요한 것으로 보인다.
- 장에서 Lactobacillus acidophilus의 발현은 Fig. 2에서 보는 바와 같이 유전자를 215 bp에서 증폭된 것을볼 수 있었으며 1주령에서 가장 많이 나타났으며 3주령, 6주령, 12주령, 24주령으로 갈수록 점차 감소하는 경향을 보이고 있어 주령이 증가할수록 장내 발효기능이 떨어지는 것을 나타내고 있다.
- 적혈구에 대한 분석에서도 L. acidophilus (1×106 CFU)를 급여한 실험군에서는 대조군과 비슷한 결과를 보이고 있지만 L. acidophilus (1×1010 CFU)를 급여한 경우에서는 총 적혈구와 헤모글로빈의 수치가 증가하여 영양분의 공급이 활발하게 이루어져 대조군에서 비하여 더 건강한 상태라는 것을 보여주고 있다.
- 지방의 전구물질인 triglyceride는 대조군이 173 mg/dl이고, L. acidophilus (1×106 CFU) 급여군이 171 mg/dl이며, L. acidophilus (1×1010 CFU) 급여군에서는 56 mg/dl로 대조군에 비하여 매우 낮은 것으로 분석되었다.
- 첫째, 운동능력 향상 여부를 알아보기 위한 수영지속 능력에 대한 실험에서 1×106 CFU 또는 1×1010 CFU의 L. acidophilus를 10일 동안 먹인 경우 모두 수영 지속 시간 증가 하였으며, L. acidophilus 급여량이 증가 할수록 운동능력도 같이 향상 되는 것을 알 수있었다.
- 총 백혈구 수에서 L. acidophilus (1×1010 CFU)를 급여한 경우 대조군보다 림프구가 감소했지만 호중성백혈구, 단핵백혈구, 호산성백혈구및 호염기성백혈구만 다소 증가하는 수준에 그쳤으며 그 범위는 질병에 감염된 수치가 아닌 정상적인 경우와 유사하였다.
- 평균 체중에서 실험을 시작할 당시 24.44 g에 비하여 투여 후에는 대조군이 33.56 g으로 37% 증가했지만 1×106 CFU를 먹인 실험 군에서는 35.28 g으로 44% 증가했고, 1×1010 CFU를 공급한 실험군에서는 30.08 g으로 23% 증가에 머물렀으며, 1×1010 CFU를 먹인 경우 체중 변화에서 대조군보다 평균 3.48 g이 줄었으나 1×106 CFU를 공급한 경우에는 오히려 체중이 평균 1.72 g이 더 증가하여 1×106 CFU 정도는 오히려 체중 관리 측면에서는 급여하지 않는 것이 좋은 것으로 나타났다.
- 혈청화학치에서 혈청내 콜레스테롤 측정에서도 L. acidophilus (1×1010 CFU)를 급여한 경우 76 mg/dl인데 비하여 대조군은 137 mg/dl를 나타내 L. acidophilus (1×1010 CFU)를 급여한 경우 대조군보다 약 2배 정도 콜레스테롤이 감소하는 것으로 나타났으며 고혈압 관리에서도 아주 효과적일 것으로 생각되어진다.
후속연구
- 5 ×106 CFU/g정도인데 이것을 또한 사료에 혼합하여 사용하는 관계로 실제로 동물에게 급여되는 수준은 훨씬 낮아 이들 발효균주가 위산에 의한 사멸 등으로 인하여 위장을 통하여 십이지장 등 소장이나 대장으로의 전달은 어려운 것으로 판단된다. 고로 생균제를 이용한 동물의 건강유지와 질병 예방 효과를 가져오기 위해서는 더욱 많은 발효균이 장에 도달할 수있도록 급여 방법 및 생산 방법을 바꾸어야 할 것으로 보인다.
- acidophilus의 분포량이 반 이하로 감소함을 알 수 있어 어린 동물에서의 probiotics의 급여는 큰 효과를 볼 수 없다는 것을 알 수 있었다. 축산 현장에서 사용되는 생균제의 함량은 현재 판매되고 있는 생균제의 경우 평균 2.3∼2.5 CFU/g인 것으로 포기되고 있어 본 실험의 결과와 비교할 때 그 효과가 미미하거나 동물의 건강증진과 질병예방보다는 단기 비육 등에 효과가 있을 것으로 보이며 질병예방을 위해서는 높은 농도의 생균제를 지속적으로 투여할 필요가 있다고 생각된다.
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