본 연구에서는 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS를 처리한 결과 세포 생존율은 다양한 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출물에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 삼채 뿌리 메탄올 추출물은 다양한 농도에서 LPS만을 처리한 대조군과 비교하였을 때, NO 생성을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한 염증성 사이토카인인 TNF-${\alpha}$와 IL-6의 생성양 역시 LPS만을 처리한 군과 비교했을 때, 각각의 농도에서 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 본 연구에 사용된 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 염증 억제 기작에 관한 추가적인 연구의 수행과 활성물질의 동정에 관한 연구가 추가로 이루어져야겠지만, 본 연구의 결과는 삼채 뿌리 메탄올 추출물은 NO 및 염증성 사이토카인의 생성을 조절함으로써 대식세포 유래의 염증 반응을 효과적으로 억제하고, 염증성 매개질환에 탁월한 효능이 있을 것으로 사료되며, 예방물질로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS를 처리한 결과 세포 생존율은 다양한 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출물에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 삼채 뿌리 메탄올 추출물은 다양한 농도에서 LPS만을 처리한 대조군과 비교하였을 때, NO 생성을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한 염증성 사이토카인인 TNF-${\alpha}$와 IL-6의 생성양 역시 LPS만을 처리한 군과 비교했을 때, 각각의 농도에서 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 본 연구에 사용된 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 염증 억제 기작에 관한 추가적인 연구의 수행과 활성물질의 동정에 관한 연구가 추가로 이루어져야겠지만, 본 연구의 결과는 삼채 뿌리 메탄올 추출물은 NO 및 염증성 사이토카인의 생성을 조절함으로써 대식세포 유래의 염증 반응을 효과적으로 억제하고, 염증성 매개질환에 탁월한 효능이 있을 것으로 사료되며, 예방물질로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Allium hookeri, a member of the onion family, has long been mainly cultivated for food and medicinal use in Southeast Asia countries owing to its various biological properties. However, no studies of the anti-inflammatory effects of A. hookeri extracts have been conducted to date. Therefore, this st...
Allium hookeri, a member of the onion family, has long been mainly cultivated for food and medicinal use in Southeast Asia countries owing to its various biological properties. However, no studies of the anti-inflammatory effects of A. hookeri extracts have been conducted to date. Therefore, this study was investigated the potential of the methanol extract of A. hookeri to suppress the inflammation in lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse macrophage RAW264.7 cells. This study was performed on macrophage cells that were pretreated with $0{\sim}500{\mu}g/mL$ of methanol extract of A. hookeri root prior to LPS treatment. Treatment with methanol extract of A. hookeri root significantly inhibited LPS-induced nitric oxide formation in dose-dependent manner. Treatment of A. hookeri root also significantly decreased LPS-induced TNF-${\alpha}$ and IL-6 production. The results of this study provide new evidence of the anti-inflammatory properties of A. hookeri and indicate that it may have a potential therapeutic use for the prevention and treatment of macrophage derived chronic immune diseases.
Allium hookeri, a member of the onion family, has long been mainly cultivated for food and medicinal use in Southeast Asia countries owing to its various biological properties. However, no studies of the anti-inflammatory effects of A. hookeri extracts have been conducted to date. Therefore, this study was investigated the potential of the methanol extract of A. hookeri to suppress the inflammation in lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse macrophage RAW264.7 cells. This study was performed on macrophage cells that were pretreated with $0{\sim}500{\mu}g/mL$ of methanol extract of A. hookeri root prior to LPS treatment. Treatment with methanol extract of A. hookeri root significantly inhibited LPS-induced nitric oxide formation in dose-dependent manner. Treatment of A. hookeri root also significantly decreased LPS-induced TNF-${\alpha}$ and IL-6 production. The results of this study provide new evidence of the anti-inflammatory properties of A. hookeri and indicate that it may have a potential therapeutic use for the prevention and treatment of macrophage derived chronic immune diseases.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 마우스 대식세포 RAW264.7에서 LPS를 이용하여 인위적인 활성화 및 염증 반응을 유도한 후, 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 항염증 효과를 알아보고자하였다.
본 연구에서는 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS를 처리한 결과 세포 생존율은 다양한 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출물에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 삼채뿌리 메탄올 추출물은 다양한 농도에서 LPS만을 처리한 대조군과 비교하였을 때, NO 생성을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 확인되었다.
제안 방법
1 mL(500,000 cells/ well)의 세포 부유액을 24 well plate에 분주 후, CO2배양기 안에서 4시간 동안 전 배양(pre-incubation)을 한 후, 0(0.1% DMSO), 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 μg/mL 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출물과 positive control인 allyl disulfide(ADS) 1 ng/mL를 처리한 후, 2 μg/mL 농도의 LPS를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지(without phenol red)와 함께 20시간 반응했다.
100 μL(10,000 cells/well)의 세포 부유액을 96 well plate 에 분주 후, CO2 배양기 안에서 4시간 동안 전 배양(pre-incubation)을 한 후, 0(0.1% DMSO), 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 μg/mL 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출액, 2 μg/mL 농도의 LPS를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지와 함께 20시간 배양했다.
20시간 후, 상층액 50 μL를 회수하여 Griees reagent(Promega, Madison, WI, USA)를 이용한 NO assay를 수행하였다.
NO 측정과 같은 방법으로 세포를 배양한 후, 각 well에서 상층액을 회수하였다. 상층액 내 TNF-α와 IL-6의 양은 각각 ENZO(ENZO bioscience, Farmingdale, NY, USA)에서 구입한 Mouse IL-6 ELISA kit와 Mouse TNF-α ELISA kit를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader로 흡광도를 측정한 후 standard curve를 바탕으로 TNF-α와 IL-6의 생성량을 계산하였다.
다음은 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 대표적인 염증성 cytokine인 TNF-α와 IL-6의 생성양에 미치는 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 영향을 조사하였다.
삼채 뿌리 메탄올 추출물의 농도에 따른 RAW264.7 세포의 생존율을 측정하기 위해 cell viability assay를 실시하였다. 100 μL(10,000 cells/well)의 세포 부유액을 96 well plate 에 분주 후, CO2 배양기 안에서 4시간 동안 전 배양(pre-incubation)을 한 후, 0(0.
삼채 뿌리 메탄올 추출물이 LPS가 유도된 RAW264.7 세포에서 농도별 항염증 효과를 측정하기 위해 삼채 뿌리 메탄올 추출물을 처리 후, NO assay를 시행하였다. 1 mL(500,000 cells/ well)의 세포 부유액을 24 well plate에 분주 후, CO2배양기 안에서 4시간 동안 전 배양(pre-incubation)을 한 후, 0(0.
삼채 뿌리 메탄올 추출물이 마우스 대식세포 RAW264.7에 미치는 영향을 측정하기 위하여 세포독성 실험을 하였다. 다양한 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출물 0, 50, 150, 100, 200, 300, 400, 500 μg/mL를 처리한 후, 세포 생존률을 CCK-8 kit로 측정하였을 때, 각 농도별 대조군과 비교하여 모든 농도에서 100% 이상의 생존률을 보여 어떠한 독성 효과도 없는 것으로 확인되었다(Fig.
상층액 내 TNF-α와 IL-6의 양은 각각 ENZO(ENZO bioscience, Farmingdale, NY, USA)에서 구입한 Mouse IL-6 ELISA kit와 Mouse TNF-α ELISA kit를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader로 흡광도를 측정한 후 standard curve를 바탕으로 TNF-α와 IL-6의 생성량을 계산하였다.
대상 데이터
세포는 습윤한 5% CO2, 37oC 배양기(SANYO, San Diego, CA, USA)에서 배양하였으며 배양액은 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-streptomycin을 함유한 DMEM 배지를 사용하였다. FBS, penicillin-streptomycin 및 배지는 Gibco(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 배지는 2～3일마다 교환하였으며 세포가 80% 이상 자랐을 때 phosphate buffered saline solution(PBS)로 세척한 후 cell scraper를 사용하여 계대배양 하였다.
본 실험에 사용한 삼채는 경남 고성에서 구입하여 뿌리부분을 동결 건조하여 분쇄한 후 분말은 메탄올과 1:9 비율로 취하여 상온에서 24시간씩 3회 추출하였다. 추출액은 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축한 후 세포실험에 사용하였다.
7은 한국세포주은행(Seoul)에서 구입하였다. 세포는 습윤한 5% CO2, 37oC 배양기(SANYO, San Diego, CA, USA)에서 배양하였으며 배양액은 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-streptomycin을 함유한 DMEM 배지를 사용하였다. FBS, penicillin-streptomycin 및 배지는 Gibco(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 마우스 대식 세포 RAW264.7은 한국세포주은행(Seoul)에서 구입하였다. 세포는 습윤한 5% CO2, 37oC 배양기(SANYO, San Diego, CA, USA)에서 배양하였으며 배양액은 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-streptomycin을 함유한 DMEM 배지를 사용하였다.
본 실험에 사용한 삼채는 경남 고성에서 구입하여 뿌리부분을 동결 건조하여 분쇄한 후 분말은 메탄올과 1:9 비율로 취하여 상온에서 24시간씩 3회 추출하였다. 추출액은 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축한 후 세포실험에 사용하였다. 농축된 샘플은 DMSO에 녹여서 각 농도별 세포에 처리하였다.
데이터처리
각 시료 농도군에 대한 유의 검정은 대조군과 비교하여 Student's t-test 한 후, p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
각 실험은 3회 이상 반복 실험을 통하여 결과를 얻어 각각의 시료 농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
hookeri extracts are 0, 50, 100, 150, 200, 300, 400 and 500 μg/mL. The rates of cell viability were measured by CCK-8 assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
삼채 뿌리 메탄올 추출물을 이용한 NO assay는 Griess's method(11)를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
LPS만을 처리한 군에서 TNF-α는 1,378 pg/mL로 높은 증가를 보였으나, 삼채 뿌리 메탄올 추출물 0, 50, 150, 100, 200, 300, 400, 500 μg/mL 처리군에서는 농도의존적으로 TNF-α의 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(Fig. 3).
삼채 뿌리 메탄올 추출물을 이용한 NO assay는 Griess's method(11)를 이용하여 측정하였다. LPS의 처리에 의한 RAW 264.7 세포에서 NO 생성의 증가는 삼채 뿌리 메탄올 추출물 처리군에서 농도의존적으로 감소되는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 특히 삼채 뿌리 메탄올 추출물 300 μg/mL 처리군에서는 LPS만을 처리한 군과 비교했을 때, 50% 수준까지 NO 생성이 감소되는 것으로 확인되었으며, 특히 500 μg/mL 처리군에서는 거의 대조군 수준까지 감소되는 것으로 확인되었다.
다양한 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출물 0, 50, 150, 100, 200, 300, 400, 500 μg/mL를 처리한 후, 세포 생존률을 CCK-8 kit로 측정하였을 때, 각 농도별 대조군과 비교하여 모든 농도에서 100% 이상의 생존률을 보여 어떠한 독성 효과도 없는 것으로 확인되었다(Fig. 1)
또한 염증성 사이토카인인 TNF-α 와 IL-6의 생성양 역시 LPS만을 처리한 군과 비교했을 때, 각각의 농도에서 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
7 세포에 LPS를 처리한 결과 세포 생존율은 다양한 농도의 삼채 뿌리 메탄올 추출물에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 삼채뿌리 메탄올 추출물은 다양한 농도에서 LPS만을 처리한 대조군과 비교하였을 때, NO 생성을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한 염증성 사이토카인인 TNF-α 와 IL-6의 생성양 역시 LPS만을 처리한 군과 비교했을 때, 각각의 농도에서 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
특히 300, 400, 500 μg/mL 처리군에서 각각 1,023 pg/mL, 886 pg/mL, 721 pg/mL로 30%, 39%, 50% 감소효과를 보였다(Fig 4.).
특히 삼채 뿌리 메탄올 추출물 300 μg/mL 처리군에서는 LPS만을 처리한 군과 비교했을 때, 50% 수준까지 NO 생성이 감소되는 것으로 확인되었으며, 특히 500 μg/mL 처리군에서는 거의 대조군 수준까지 감소되는 것으로 확인되었다.
후속연구
또한 염증성 사이토카인인 TNF-α 와 IL-6의 생성양 역시 LPS만을 처리한 군과 비교했을 때, 각각의 농도에서 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 본 연구에 사용된 삼채 뿌리 메탄올 추출물의 염증 억제 기작에 관한 추가적인 연구의 수행과 활성물질의 동정에 관한 연구가 추가로 이루어져야겠지만, 본 연구의 결과는 삼채뿌리 메탄올 추출물은 NO 및 염증성 사이토카인의 생성을 조절함으로써 대식세포 유래의 염증 반응을 효과적으로 억제하고, 염증성 매개질환에 탁월한 효능이 있을 것으로 사료되며, 예방물질로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Allium속 식물은 어떤 생리활성을 가지고 있는가?
또한 삼채는 단백질, 당, 섬유소, ascorbic acid, phytosterol, total phenol 등이 양파보다 많이 함유되어 있어 양파 대체양념으로 널리 사용되어지는 의학식품(medicinal food)이다(1). 유황화합물을 많이 포함하는 파, 마늘, 양파 등 Allium속 식물은 항산화, 항암, 항 혈액응고, 항 콜레스테롤, 항균작용 및 혈당 강하 작용 등 다양한 생리활성을 가지고 있음이 보고되었으나(2-7), 삼채의 생리활성에 관한 연구는 미비한 실정이다.
항염증제로서 개발된 것 중 사용이 일부 제한된 제제는 어떤 문제점을 가지고 있는가?
내독소로 알려진 lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성균의 세포 외막에 존재하여, 대식세포 또는 단핵세포에서 세포내 전사요소인 nuclear factor-κB(NF-κB)의 활성화를 유도하여 염증성 cytokine, inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)의 유전자 발현을 유도하며, 염증 매개물질을 생성하므로 이들 효소의 발현을 저해하거나, 이들 유전자의 발현에 있어 주요 신호전달 분자인 전사인자들의 활성을 조절하는 물질은 항염증제로서 개발 가능성이 높다(11). 지금까지 개발된 항염증제는 위염, 신장염 및 심장질환 등을 초래함으로써 인체 안전성면에서 문제점을 안고 있어 그 사용이 일부 제한되고 있기에 현재 천연물로부터 보다 안전한 항염증 물질을 검색하는 연구가 활발하게 진행되고 있을 뿐 아니라 일상 식생활에서 섭취하는 식품 중 항염증제로 이용하기 위한 물질이 계속 탐색되고 있다.
염증 반응은 어떤 질환의 원인이 되는가?
염증 반응은 외부 자극에 대한 생체의 정상적인 방어 기작이며, 지속적인 염증반응은 조직의 손상을 유발하여 결과적으로 관절염, 당뇨병, 동맥경화 및 암 등의 여러 가지 질환의 원인이 된다(8,9). 염증반응이 일어나면 대식세포와 같은 염증세포들은 nitric oxide(NO), prostagladin E2(PGE2), tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) 등 염증 매개물질을 분비한다(10).
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