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문제 정의
- 따라서 본 연구는 한국재래염소 3개 집단을 대상으로 30개 MS 마커의 유전자형을 분석하고 이를 토대로 유전적 다양성 파악 및 집단의 유전적 특성을 구명함으로써 외래품종과의 차별화와 함께 유전자원으로서 한국재래염소의 보존 및 활용에 필요한 과학적인 기초 자료를 제시하고자 한다.
- 본 연구는 MS 마커를 이용한 대립유전자형 분석결과를 토대로 한국재래염소 집단에 대한 유전적 다양성, 계통유전학적 분석 및 집단 균일도 분석을 실시하였다. 본 연구에서 이용된 30개 MS 마커에 대해 PIC를 토대로 분석효율성을 확인하였다.
제안 방법
- 각각의 MS 마커는 증폭 조건, 증폭산물 크기, 형광표지를 고려하여 2~4개씩 multiplex 조합을 만든 후 Accupower-Dye PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 증폭하였다. Multiplex-PCR은 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 수행하였으며, 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation을 실시하고, 94℃에서 60초 denaturation, 55~60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 35회 반복 후 72℃에서 15분 동안 final extension을 실시하였다. PCR 산물은 Hi-Di Formamide와 GeneScan 500 Liz size standard (Applied Biosystems, USA)를 혼합하여 95℃에서 10분간 denaturation 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하였다.
- Multiplex-PCR은 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 수행하였으며, 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation을 실시하고, 94℃에서 60초 denaturation, 55~60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 35회 반복 후 72℃에서 15분 동안 final extension을 실시하였다. PCR 산물은 Hi-Di Formamide와 GeneScan 500 Liz size standard (Applied Biosystems, USA)를 혼합하여 95℃에서 10분간 denaturation 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하였다. MS 마커에 대한 대립유전자의 크기 결정은 GeneMapper (version 4.
- 혈액으로부터의 DNA 추출은 Boom 등[1]의 방식을 따랐으며, magnetic bead 기반의 DNA추출 KIT인 MagExtractor(TOYOBO, Japan)를 사용하였다. 각각의 MS 마커는 증폭 조건, 증폭산물 크기, 형광표지를 고려하여 2~4개씩 multiplex 조합을 만든 후 Accupower-Dye PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 증폭하였다. Multiplex-PCR은 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 수행하였으며, 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation을 실시하고, 94℃에서 60초 denaturation, 55~60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 35회 반복 후 72℃에서 15분 동안 final extension을 실시하였다.
- 한국재래염소 3개 집단 및 농가집단 간의 유연관계를 구명하기 위하여 30개 MS 마커의 대립유전자의 출현빈도를 근거로 집단간 DA 유전거리를 산출하고(Table 3), Neighbor-joining (NJ) tree를 작성하였다(Fig. 1). 재래염소 3개 집단 간에는 가까운 유전거리(0.
대상 데이터
- 국립축산과학원 가축유전자원시험장에서 보존 및 육성 중인 한국재래염소 3개 집단 중 2011년에 출생한 당진 집단 46두, 장수 집단 29두, 통영 집단 34두 등 109두의 혈액을 시료로 공시하였다. 또한 한국재래염소와의 유전적 특성 비교를 위하여 흑염소 사육농가에서 수집한 1개 집단 44두를 함께 공시하였다.
- 국립축산과학원 가축유전자원시험장에서 보존 및 육성 중인 한국재래염소 3개 집단 중 2011년에 출생한 당진 집단 46두, 장수 집단 29두, 통영 집단 34두 등 109두의 혈액을 시료로 공시하였다. 또한 한국재래염소와의 유전적 특성 비교를 위하여 흑염소 사육농가에서 수집한 1개 집단 44두를 함께 공시하였다. 본 실험에 사용된 MS 마커는 FAO [10]에서 권고한 염소 MS 마커 14종(BM6444, CSRD0247, DRBP1, ETH10, ILSTS029, INRA023, INRA063, McM527, OarFCB020, OarFCB048, SRCRSP005, SRCRSP023, SRCRSP008, TGLA53)과 NCBI(http://www.
- 또한 한국재래염소와의 유전적 특성 비교를 위하여 흑염소 사육농가에서 수집한 1개 집단 44두를 함께 공시하였다. 본 실험에 사용된 MS 마커는 FAO [10]에서 권고한 염소 MS 마커 14종(BM6444, CSRD0247, DRBP1, ETH10, ILSTS029, INRA023, INRA063, McM527, OarFCB020, OarFCB048, SRCRSP005, SRCRSP023, SRCRSP008, TGLA53)과 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 수집 및 선정된 16종(BM1258, BM1329, BM1818, BOBT24A, ILSTS008, ILSTS019, ILSTS087, INRA005, INRA006, INRA049, INRA172, INRA185, OarFCB193, RM006, SRCRSP001, SRCRSP024) 등총 30종을 이용하였다.
- 본 연구는 MS 마커를 이용한 대립유전자형 분석결과를 토대로 한국재래염소 집단에 대한 유전적 다양성, 계통유전학적 분석 및 집단 균일도 분석을 실시하였다. 본 연구에서 이용된 30개 MS 마커에 대해 PIC를 토대로 분석효율성을 확인하였다. 또한 집단간의 유전적인 분류가 가능하였고, 집단-특이적인 계통유전학적 특성도 존재함을 확인하였다.
데이터처리
- PCR 산물은 Hi-Di Formamide와 GeneScan 500 Liz size standard (Applied Biosystems, USA)를 혼합하여 95℃에서 10분간 denaturation 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하였다. MS 마커에 대한 대립유전자의 크기 결정은 GeneMapper (version 4.0) software (Applied Biosystems, USA)를 이용하였고, 그 결과는 Microsoft Excel (Microsoft, ver 2007, USA)을 이용하여 개체별로 취합하였다.
- 개체별 유연관계는 MS ToolKit의 Bowcock 등[3]의 방법으로 산출된 개체별 유전적 거리를 토대로 PHYLIP program [11]을 이용하여 Neighbor-joining (NJ) tree를 작성하였다. 공시된 한국재래염소 3개 집단에 대한 유전적 균일성은 STRUCTURE software [8,23]를 이용하여 분석하였다. 먼저 실제 집단수(K 값)를 추정하기 위한 Bayesian 통계분석을 수행하여 각각의 K (K=2~5) 값에 대한 평균 추정치 Pr(X|K)와 표준편차를 계산하고(burn-in 50,000회, MCMC 반복수 100,000회), 이 결과를 Evanno 등[7]의 방법이 적용된 STRUCTURE HARVESTER program [6]을 이용하여 ΔK 값을 계산하고 최적의 K 값을 결정하여 각각의 클러스터에 대한 각 집단의 실제 분포를 추정하였다.
- 먼저 실제 집단수(K 값)를 추정하기 위한 Bayesian 통계분석을 수행하여 각각의 K (K=2~5) 값에 대한 평균 추정치 Pr(X|K)와 표준편차를 계산하고(burn-in 50,000회, MCMC 반복수 100,000회), 이 결과를 Evanno 등[7]의 방법이 적용된 STRUCTURE HARVESTER program [6]을 이용하여 ΔK 값을 계산하고 최적의 K 값을 결정하여 각각의 클러스터에 대한 각 집단의 실제 분포를 추정하였다.
이론/모형
- MS 좌위의 유전적 다형성은 GeneAlEx 6.4 program [22]을 이용하였으며, 이 때 Nei [19]의 방법을 토대로 이형접합도의 관측치(HO)와 이론치(HE)를 추정하였다. 각 집단에 대한 좌위별 다형정보량(Polymorphic Information Content; PIC)은 MS ToolKit [21]를 이용하여 Bostein 등[2]의 방법으로 산출 하였으며, CONVERT package [13]를 이용하여 MS 좌위-특이 대립유전자의 수를 확인하였다.
- 4 program [22]을 이용하였으며, 이 때 Nei [19]의 방법을 토대로 이형접합도의 관측치(HO)와 이론치(HE)를 추정하였다. 각 집단에 대한 좌위별 다형정보량(Polymorphic Information Content; PIC)은 MS ToolKit [21]를 이용하여 Bostein 등[2]의 방법으로 산출 하였으며, CONVERT package [13]를 이용하여 MS 좌위-특이 대립유전자의 수를 확인하였다. 집단간 유연관계는 DISPAN software [20]를 이용하여 Nei 등[18]의 방법에 따라 DA 유전 거리를 산출하여 확인하였다.
- 집단간 유연관계는 DISPAN software [20]를 이용하여 Nei 등[18]의 방법에 따라 DA 유전 거리를 산출하여 확인하였다. 개체별 유연관계는 MS ToolKit의 Bowcock 등[3]의 방법으로 산출된 개체별 유전적 거리를 토대로 PHYLIP program [11]을 이용하여 Neighbor-joining (NJ) tree를 작성하였다. 공시된 한국재래염소 3개 집단에 대한 유전적 균일성은 STRUCTURE software [8,23]를 이용하여 분석하였다.
- 각 집단에 대한 좌위별 다형정보량(Polymorphic Information Content; PIC)은 MS ToolKit [21]를 이용하여 Bostein 등[2]의 방법으로 산출 하였으며, CONVERT package [13]를 이용하여 MS 좌위-특이 대립유전자의 수를 확인하였다. 집단간 유연관계는 DISPAN software [20]를 이용하여 Nei 등[18]의 방법에 따라 DA 유전 거리를 산출하여 확인하였다. 개체별 유연관계는 MS ToolKit의 Bowcock 등[3]의 방법으로 산출된 개체별 유전적 거리를 토대로 PHYLIP program [11]을 이용하여 Neighbor-joining (NJ) tree를 작성하였다.
- 혈액으로부터의 DNA 추출은 Boom 등[1]의 방식을 따랐으며, magnetic bead 기반의 DNA추출 KIT인 MagExtractor(TOYOBO, Japan)를 사용하였다. 각각의 MS 마커는 증폭 조건, 증폭산물 크기, 형광표지를 고려하여 2~4개씩 multiplex 조합을 만든 후 Accupower-Dye PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 증폭하였다.
성능/효과
- 30개 MS 마커에 대한 평균 PIC는 한국재래염소 집단은 0.462~0.483의 수치를 보인 반면 농가 집단은 상대적으로 높은 0.679을 보였다. 장수집단의 SCRSP024 마커에서 0.
- 4%)가 확인되었다. 4개 MS 마커(BM6444, DRBP1, INRA023, SRCRSP024)에서는 7개 이상의 특이 대립 유전자가 관찰되었고, INRA063에서는 집단-특이 대립유전자가 관찰되지 않았다. 에티오피아 염소[14]와 알바니아 염소[15]의 결과와 비교를 해보면 집단-특이 대립유전자의 수는 분석된 마커에 따라서 상이하게 나타났다.
- 2), 한국재래염소 집단의 정확한 집단 균일도 분석을 위해서 외래종 혼입가능성이 있는 농가 염소집단은 분석에서 제외하였다. Bayesian 방법으로 K값을 2에서 5까지 설정하여 분석한 결과, 실제 집단 수와 동일한 K=3에서는 일부 개체들이 혼재하였지만 3개 집단이 독립적으로 분리되었다. K=4에서는 통영집단이 비교적 높은 유전적 균일성을 보인 반면 당진, 장수집단은 유전적 균일성이 낮게 확인되었다.
- 당진집단의 SCRSP024 마커는 1개 대립유전자만이 관찰되어 HE 및 HO와 PIC 산출이 불가능하였다. HE와 HO의 평균 값은 당진집단이 0.511과 0.461, 장수집단이 0.538과 0.509, 통영집단이 0.518과 0.498로 집단간 유사한 결과를 보인 반면 농가 집단인 경우 0.720과 0.651로 상대적으로 높게 나타났다. 또한 모든 집단에서 HE가 HO보다 근소하나마 낮게 나타났다.
- Bayesian 방법으로 K값을 2에서 5까지 설정하여 분석한 결과, 실제 집단 수와 동일한 K=3에서는 일부 개체들이 혼재하였지만 3개 집단이 독립적으로 분리되었다. K=4에서는 통영집단이 비교적 높은 유전적 균일성을 보인 반면 당진, 장수집단은 유전적 균일성이 낮게 확인되었다. STRUCTURE software 분석 결과를 Evanno 등[7]의 방법으로 산출한 ΔK 값이 K=3에서 가장 높은 수치(4.
- 233)를 나타내었다. NJ tree 상에서 4개 집단 전체 153두 중 23두(당진 6두, 장수 7두, 통영 9두, 농가 1두)가 타 집단 그룹 내부에 존재하였지만, 각 집단별로 독립적인 그룹을 형성하여 4개 집단이 집단-특이 유전적 특징이 있음이 확인되었다.
- STRUCTURE software 분석 결과를 Evanno 등[7]의 방법으로 산출한 ΔK 값이 K=3에서 가장 높은 수치(4.0816)을 보였다(Table 4).
- 2. The results of Bayesian model based clustering among 109 individuals from 3 Korean native populations(Dangjin, Jangsu and Tongyeong). The number of assumed genetic clusters (K) range from 2 to 5.
- 전체 277 개의 대립유전자가 확인되었다. 그 중 102개(36.8%)가 집단-특이 대립유전자로, 한국재래염소 3개 집단은 10개 이하로 나타난 반면 농가 집단은 81개(79.4%)가 확인되었다. 4개 MS 마커(BM6444, DRBP1, INRA023, SRCRSP024)에서는 7개 이상의 특이 대립 유전자가 관찰되었고, INRA063에서는 집단-특이 대립유전자가 관찰되지 않았다.
- 농가 집단은 한국재래염소 집단에 비해 집단-특이 대립유전자수가 거의 8배 이상 많이 발견되었으며, 전체 마커의 평균 PIC 값도 높게 나타났다. 또한 유전적 유연관계 역시 한국재래염소 집단과는 독립된 그룹을 형성하는 등 한국재래 염소 집단과는 다른 유전적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.
- 농가 집단은 한국재래염소 집단에 비해 집단-특이 대립유전자수가 거의 8배 이상 많이 발견되었으며, 전체 마커의 평균 PIC 값도 높게 나타났다. 또한 유전적 유연관계 역시 한국재래염소 집단과는 독립된 그룹을 형성하는 등 한국재래 염소 집단과는 다른 유전적 특성을 갖는 것으로 확인되었다. 이런 결과는 한국재래염소에서 나타날 수 있는 또 다른 유전적 특징이라기 보다는 외래종의 혼입 가능성이 더 높을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 이용된 30개 MS 마커에 대해 PIC를 토대로 분석효율성을 확인하였다. 또한 집단간의 유전적인 분류가 가능하였고, 집단-특이적인 계통유전학적 특성도 존재함을 확인하였다. 본 연구의 결과는 효율적인 관리방안 제시와 추후 한국재래염소의 고유성을 주장할 수 있는 과학적 근거자료로 활용될 수 있을 것이다.
- 에티오피아 염소[14]와 알바니아 염소[15]의 결과와 비교를 해보면 집단-특이 대립유전자의 수는 분석된 마커에 따라서 상이하게 나타났다. 이 결과로 분석에 공시된 품종에 따라 특정 마커의 대립유전자의 특성이 다양하게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 또한 유전적 유연관계 역시 한국재래염소 집단과는 독립된 그룹을 형성하는 등 한국재래 염소 집단과는 다른 유전적 특성을 갖는 것으로 확인되었다. 이런 결과는 한국재래염소에서 나타날 수 있는 또 다른 유전적 특징이라기 보다는 외래종의 혼입 가능성이 더 높을 것으로 판단된다.
- 이상의 결과를 종합하면, 집단 간에 일부 개체들의 유전적 혼입이 존재하지만, 당진, 장수, 통영 등 한국재래염소 3개 집단은 유전적으로 분류가 가능하였다. 이는 Table 1에 제시된 102개 집단-특이 대립유전자의 빈도 차이에 의한 것으로, 특히 오직 한 집단에서만 나타나는 집단-특이 대립유전자의 존재가 당진집단에서는 8개 마커(BM1258, BM6444, DRBP1, ILSTS019, INRA006, INRA049, SRCRSP008, SRCRSP023), 장수집단은 2개 마커(INRA185, OarFCB193) 그리고 통영집단은 6개 마커(BM6444, DRBP1, INRA006, INRA023, OarFCB193, SRCRSP001)가 나타났다.
- 679을 보였다. 장수집단의 SCRSP024 마커에서 0.064로 가장 낮게 나타난 반면 농가집단의 INRA023 마커에서 0.864로 가장 높은 것으로 확인되었다. Botstein 등[2]은 PIC가 0.
- 25 이상인 경우 유전적 분석을 위한 적절한 정보력을 갖는다고 보고 하였다. 적어도 한 집단에서 0.25 이하의 PIC를 보인 마커는 총 7개(BM1818, ETH10, ILSTS029, INRA005, INRA185, OarFCB020, SRCRSP024)였으며, 이 7개 마커를 제외한 23개의 마커는 한국재래염소의 분자유전학적 분석에 활용이 가능할 것으로 판단된다.
후속연구
- 본 연구의 결과는 효율적인 관리방안 제시와 추후 한국재래염소의 고유성을 주장할 수 있는 과학적 근거자료로 활용될 수 있을 것이다. 그러나 기원과 유입경로 등에 대한 명확한 해석과 유전적 다양성의 상대적 비교를 위해서는 과거에 도입되었던 품종들과 중국, 인도 등 동남아시아 지역의 염소품종을 수집하고 이를 이용한 한국재래염소와의 통합적인 추가분석이 필요할 것으로 사료된다.
- 또한 집단간의 유전적인 분류가 가능하였고, 집단-특이적인 계통유전학적 특성도 존재함을 확인하였다. 본 연구의 결과는 효율적인 관리방안 제시와 추후 한국재래염소의 고유성을 주장할 수 있는 과학적 근거자료로 활용될 수 있을 것이다. 그러나 기원과 유입경로 등에 대한 명확한 해석과 유전적 다양성의 상대적 비교를 위해서는 과거에 도입되었던 품종들과 중국, 인도 등 동남아시아 지역의 염소품종을 수집하고 이를 이용한 한국재래염소와의 통합적인 추가분석이 필요할 것으로 사료된다.
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