[논문]사자발쑥 추출물의 항산화 및 항균 활성

양현갑; 김혜진; 김해수; 박수남

doi:10.4014/kjmb.1207.07014

사자발쑥 추출물의 항산화 및 항균 활성
Antioxidative and Antibacterial Activities of Artemisia princeps Pampanini Extracts 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.40 no.3, 2012년, pp.250 - 260

양현갑 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 나노바이오화장품연구실, 화장품종합기술연구소) , 김혜진 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 나노바이오화장품연구실, 화장품종합기술연구소) , 김해수 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 나노바이오화장품연구실, 화장품종합기술연구소) , 박수남 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 나노바이오화장품연구실, 화장품종합기술연구소)

초록
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본 연구에서는 화장품에 응용 가능한 천연 소재를 찾고자, 사자발쑥 추출물의 항산화 활성, 타이로시네이즈 저해 효과 및 피부 상재균에 대한 항균작용을 측정하였다. 사자발쑥 추출물의 수득율의 경우 50% 에탄올 추출물은 23.92%, 에틸아세테이트 분획은 2.66%, 아글리콘 분획은 1.60%으로 나타났다. 사자발쑥 추출물의 free radical 소거능력($FSC_{50}$)은 에틸아세테이트 분획($12.27{\mu}g/m$)에서 비교적 큰 소거활성을 나타내었고, 활성산소 소거활성($OSC_{50}$)은 에틸아세테이트 분획($0.33{\mu}g/mL$)에서 비교물질로 사용한 L-아스코르빅산($1.50{\mu}g/mL$)의 총항산화능보다 약 5배 더 높은 활성을 보였으며, 나머지 추출물 역시 비교물질과 비슷한 활성을 보였다. 또한, $^1O_2$으로 유도된 적혈구의 광용혈 실험에서 추출물의 ${\mu}g/mL$ 농도 범위($5{\sim}50{\mu}g/mL$)에서 농도-의존적으로 세포 보호 효과를 나타내었으며, $25{\mu}g/mL$의 농도에서 아글리콘 분획은 비교물질인 (+)-${\alpha}$-토코페롤과 비교했을 때, 약 3 배정도 높은 세포보호활성을 나타내었다. 사자발쑥 추출물 에틸아세테이트 분획의 타이로시네이즈 저해 활성($IC_{50}$)은 $29.20{\mu}g/mL$로 미백제로 알려진 알부틴($226.88{\mu}g/mL$)보다도 약 7배 정도 더 높은 활성을 나타내었다. 사자발쑥 추출물의 항균활성 측정결과, 에틸아세테이트 분획의 피부 상재균에 대한 MIC는 Gram (+) 세균에서 높은 활성을 보였으며, 화장품에 사용되고 있는 방부제인 methyl paraben 보다 높은 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다. 이를 통해 천연 방부제, 항균제로서 역할이 충분히 기대된다. 항산화 활성과 항균활성 및 미백효과가 뛰어난 에틸아세테이트 분획에서 TLC 및 HPLC 크로마토그램을 통한 다양한 성분의 peak 중에서 2개의 peak (TLC, AP 1-1 및 AP 1-3)를 확인하였으며, LC/ESI-MS/MS의 negative ion 모드에서 HPLC peak 1 (AP 1-3)은 분자 이온 $[M-H]^-$이 m/z 329.1, HPLC peak 2 (AP 1-1)는 m/z 343.3로 나타났다. 따라서 AP 1-1은 eupatilin으로, AP 1-3은 jaceosidin 임을 확인하였다. 이상의 결과들은 사자발쑥 추출물의 항산화 작용과 더불어 타이로시네이즈 저해활성으로부터 미백효능 그리고 피부 상재군에 대한 항균활성 등 기능성원료로서 응용 가능성이 큼을 시사된다. 추가적으로 화장품에 이용하기 위해서는 활성 성분을 이용한 피부 흡수 증진 시스템 개발과 제형 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In the present study, the antioxidative and antibacterial activities of Artemisia princeps Pampanini (A. princeps Pamp.) extract were investigated. The ethyl acetate fraction of A. princeps Pamp. showed the most prominent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity ($FSC_{50}=12.27{\mu}g/mL$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of A. princeps Pamp. extract on $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ systems were investigated using a luminol-dependent chemiluminescence assay. The ethyl acetate fraction of the extract ($OSC_{50}=0.33{\mu}g/mL$) had a 5 times greater ROS scavenging activity than L-ascorbic acid ($1.50{\mu}g/mL$), known as a water soluble antioxidant. The cellular protective effects of fractions of A. princeps Pamp. on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were examined. The aglycone fraction of extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner. The inhibitory effects of A. princeps Pamp. extract on tyrosinase were investigated to assess their whitening efficiency. The ethyl acetate fraction demonstrated a 7 times higher tyrosinase inhibitory effect ($IC_{50}=29.20{\mu}g/mL$) than albutin, known as a whitening agent. The antibacterial activity of ethyl acetate fractions against various normal skin flora were measured. The results showed that the antibacterial activity of the fraction was the highest on Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, and Propionibacterium acnes. Antioxidant substances were isolated and purified from the ethyl acetate fractions. Eupatilin and jaceosidin were identified. These results indicate that the extract/fractions of A. princeps Pamp. can function as antioxidant and/or antibacterial agents for the skin.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 사자발쑥 추출물을 대상으로 ¹O₂으로 유도된 세포손상에 대한 보호활성과 free radical 소거활성, Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에서 생성된 활성산소에 대한 총항산화능, 타이로시네이즈 활성 저해효과와 피부 상재균의 항균 활성을 측정함으로써 사자발쑥 추출물에 대한 항산화, 항노화 및 항균 등의 기능성 화장품 소재로서의 활성과 효능을 확인하고, ROS에 의한 피부 노화를 방지하는데 효과가 있는 기능성 화장품 소재로서의 개발 가능성이 있는지 검토하였다.
본 연구에서는 화장품에 응용 가능한 천연 소재를 찾고자, 사자발쑥 추출물의 항산화 활성, 타이로시네이즈 저해 효과 및 피부 상재균에 대한 항균작용을 측정하였다. 사자발쑥 추출물의 수득율의 경우 50% 에탄올 추출물은 23.
사람 적혈구를 대상으로 활성산소(특히 ¹O₂)에 의한 세포 손상(또는 파괴)을 모델로 한 적혈구 광용혈 실험을 통해서 세포 보호 효과를 측정하는 실험이다. 빛과 광증감제인 rosebengal에 의해 유도된 적혈구의 용혈 정도를 측정하여 추출물이 자외선에 의한 피부 보호 물질로서 적합한 지에 대한 가능성을 판단할 수 있다고 사료된다.

제안 방법

λ=340 nm에서 HPLC는 5개의 분리된 peak이 나타났으며, 각각의 peak은 Fig. 6에 나타난 2차 분리를 한 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 50% 에탄올로 추출·여과하여 용매를 감압·건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올 용액으로 녹여 HPLC로 분석하여 확인하였다.
중화 적정 후 다시 에틸아세테이트 층을 분획하고 이를 감압·농축 하 당이 제거된 아글리콘 파우더(deglycosylated 분획)를 실험에 사용하였다. 3가지 형태의 사자발쑥 추출물(50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획)은 모두 화장품의 원료로 이용 가능한 형태의 추출물로 이들의 활성을 측정하여 그 응용 가능성을 검토하였다. 특히 에틸아세테이트 분획은 활성을 나타내는 플라보노이드 등의 성분이 다수 포함되어 있으며, 아글리콘 분획은 피부 흡수를 증진 시켜 효능을 향상시키는데 적합하다.
HPLC 분석은 C18로 충진된 column (250×4.6 mm, 5 µm, Phenomenex)을 이용하였고, 주입량은 20 µL였다.
이동상은 HPLC 분석 조건과 일치하였다. MS/MS 분석은 ion spray source을 사용하였고, negative ion mode로 capillary voltage는 -3500 V, nebulizer gas (N₂) 10 (arbitraryunits), collisiongas (N2) 그리고 ion source temperature는 400℃에서 행하였다.
TLC 및 HPLC를 이용한 사자발쑥 추출물의 플라보노이드 분석: 플라보노이드 분석을 위한 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획을 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Millipore 0.45 µm)를 이용하여 여과하고 이 여액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다.
, Tokyo, Japan)에 천천히 흡수시킨 뒤, 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시켰다. 각각의 시료가 흡수된 paper disc를 도말한 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 배양한 후 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50×20×25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15분 동안 광조사를 하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50×20×25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15분 동안 광조사를 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 용혈정도를 15분 간격으로 700 nm에서 투광도 (transmittance, %)를 측정하여 구하였다. 이 700 nm의 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10분 동안 방치 후, spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고, 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하였다. DPPH 소거 활성은 아래의 식에 의하여 계산되었으며, DPPH 소거 활성에 따른 추출물의 항산화능은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity concentration, FSC₅₀, µg/mL)로서 표기하였다.
이는 짧은 시간에 결과를 알 수 있으며, 비교적 간단하다. 그러므로, 사자발쑥 추출물을 통해 free radical 소거활성을 DPPH법으로 확인하였으며, 실험방법은 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10분 동안 방치 후, spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고, 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하였다.
대조군(control)은 추출물 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3·6H2O를 첨가하지 않고 증류수를 넣은 것으로 하였다.
사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획의 경우 기울기 용리법은 0~10분까지 50% A에서 70% A; 10~30분까지 70% A에서 70% A이며, 검출파장은 340 nm, 유속은 1 mL/min로 분리하였다[23]. 또한 사자발쑥 추출물의 성분 분석을 위하여 TLC로 분리된 각각의 띠를 긁은 후 50% 에탄올에 추출, 여과한 뒤 감압 농축하여 파우더를 얻었다. 이 때 얻어진 파우더 중 일부는 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milli-pore 0.
사자발쑥 Ethyl acetate 분획물의 최소저해농도(MIC): Disc diffusion assay의 결과를 바탕으로 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획과 아글리콘에 높은 항균활성을 나타내었던 Gram (+) 세균인 S. aureus, B. subtilis 및 P. acnes 총 3가지 균주를 바탕으로 최소저해농도를 측정하였다. Table 2에 나타난 바와 같이, Gram (+) 세균에서 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획의 최소저해농도는 모두 625 µg/mL 로 나타났고, 아글리콘에서의 최소저해농도는 S.
사자발쑥 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 후암반응(postincubation) 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획에서 다양한 성분이 존재함을 TLC, HPLC를 통해서 확인하였으며, 다양한 성분 중에 ROS 소거활성과 항산화 효과가 있는 eupatilin 및 jaceosidin을 분리하였다[7, 13].
사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획을 위에 제시된 조건으로 HPLC를 실시하였다. λ=340 nm에서 HPLC는 5개의 분리된 peak이 나타났으며, 각각의 peak은 Fig.
사자발쑥 추출물의 활성산소에 의한 세포 손상에 대한 보호 효과를 적혈구 광용혈법을 사용하여 rose-bengal 존재 하에서 사람 적혈구 현탁액에 15분 광 조사 후 ¹O₂으로 유도된 적혈구의 용혈정도를 암반응 시간에 따라 측정하였다. 대조군의 경우 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간 (τ₅₀)은 약 30±1분으로 나타났다.
사자발쑥의 에틸아세테이트 분획에서 2차 분리한 단일 성분인 AP 1-1과 AP 1-3의 성분 및 구조를 확인하기 위하여 LC/ESI-MS/MS를 통해 측정하였다. 그 결과, AP 1-1은 negative ion mode에서 분자 이온 [M-H]−는 m/z 343.
산 가수분해 방법으로 에틸아세테이트 가용분 일정량에 H2SO4 및 아세톤 용액을 넣고, 4시간 동안 중탕 가열하면서 환류·냉각시킨 후, 환류 시킨 용액을 5% KOH/MeOH 용액으로 중화 적정하였다.
1을 사용하였고, 2차 분리의 경우는 chloroform:methanol = 10:1를 사용하였다. 성분확인은 각 성분들의 Rf치와 자외선을 이용한 분리된 띠 등으로 확인하였다.
암소에서 30분 동안 사전반응 (pre-incubation)시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL 를 가하고 15분 동안 광조사를 하였다.
각각의 균주는 농도를 1×10⁷CFU/mL로 조절한 후 본 실험에 사용하였다. 에틸아세테이트 분획물과 대조군으로써 화장품에 방부제로 사용되는 methyl paraben을 DMSO를 사용하여 2배 희석법을 이용하여 농도를 희석하였다. 그 후에 샘플을 2 mL씩 함유한 배지 20 mL를 Petri dish에 주입하였고, 시험 균을 평판배지 위에 100 µL씩 도말하여 배양하였다.
에틸아세테이트 분획으로부터 아글리콘 제조하는 방법으로는 에틸아세테이트 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수 분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 아글리콘 파우더를 실험에 사용하였다. 산 가수분해 방법으로 에틸아세테이트 가용분 일정량에 H₂SO₄ 및 아세톤 용액을 넣고, 4시간 동안 중탕 가열하면서 환류·냉각시킨 후, 환류 시킨 용액을 5% KOH/MeOH 용액으로 중화 적정하였다.
그 후에 샘플을 2 mL씩 함유한 배지 20 mL를 Petri dish에 주입하였고, 시험 균을 평판배지 위에 100 µL씩 도말하여 배양하였다. 육안으로 관찰하였을 때, 각각의 균들이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.
이 4개의 띠를 TLC 크로마토그램에서 각각 긁어서 추출·여과하고 여액을 감압·건조시켜 얻은 띠들의 파우더를 성분 분석에 사용하였다.
따라서 이 계를 이용하면 각종 ROS의 소거 활성을 측정할 수 있으며, 이 총 항산화능에는 활성산소의 생성을 막아주는 킬레이트 작용도 포함된다. 추출물의 총 항산화능은 luminol이 활성산소종에 의해 산화되어 나타나는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였으며 방법은 다음과 같다. 먼저 화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.
45 µm)를 이용하여 여과하고 이 여액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다. 플라보노이드의 단일물질을 분리하기 위해서 TLC 분석은 2차분리를 통해서 분리하였다. TLC 분석의 전개용매로는 1차 분리의 경우 ethyl acetate:formic acid:chloroform:water = 8:1:1:0.

대상 데이터

(+)-α-토코페롤, L-아스코르빅산, 알부틴, EDTA, luminol, 광증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거 활성에사용한1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma사 (USA)에서 구입하여 사용하였다.
플라보노이드의 단일물질을 분리하기 위해서 TLC 분석은 2차분리를 통해서 분리하였다. TLC 분석의 전개용매로는 1차 분리의 경우 ethyl acetate:formic acid:chloroform:water = 8:1:1:0.1을 사용하였고, 2차 분리의 경우는 chloroform:methanol = 10:1를 사용하였다. 성분확인은 각 성분들의 Rf치와 자외선을 이용한 분리된 띠 등으로 확인하였다.
UV-VIS spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, HPLC는 Dionex사, LC/ESI-MS/MS는 Thermo Finniga사의 LCQ 제품을 사용하였고, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH meter는 Hanna (Korea)사 제품을 사용하였다.
완충용액 제조에 사용된 Na₂HPO₄·12H₂O, NaH₂PO₄·2H₂O, NaCl, 그리고 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 L-타이로신과 효소로 사용된 타이로시네이즈(9.3 mg solid, 5,370 units/mg solid)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 플라보노이드의 분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet silica gel 60 F254(0.
기타 FeCl3·6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
aeruginosa는 Mueller-Hinton 배지 (Merck, Germany)를 사용하였으며 균을 접종한 후 37℃ incubator에서 24시간 배양하였다. 또한 비듬균인 P. ovale는 Pityrosporum 배지(Malt extract agar 6%, ox-bile 2%, tween 40 1%, glycerol mono-oleate 0.25%)를 사용하였으며 균을 접종한 뒤 30℃에서 24시간 동안 배양하여 사용하였다.
본 연구에서 사용한 사자발쑥은 강화군 농업기술센터로부터 제공받아 사용하였다. 사자발쑥은 Fig.
이들 사자발쑥 전초 추출물의 수득률은 이들 추출물을 화장품 소재로 이용하기에 적절함을 보여준다. 본 연구에서는 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 실험에 사용하였다.
이 4개의 띠를 TLC 크로마토그램에서 각각 긁어서 추출·여과하고 여액을 감압·건조시켜 얻은 띠들의 파우더를 성분 분석에 사용하였다. 분리된 TLC 띠 성분 확인에는 자외선 흡수 및 NP-PEG 발색법, UV-visible 스펙트럼, HPLC에 의한 분리 및 확인 등의 분광학적 데이터를 이용하였다. TLC 크로마토그램에서 분리된 띠들을 HPLC를 통해서 분석한 결과, 여러 성분이 혼합된 peak를 나타냈으며, 그 중에 Ryu 등[23]에 제시되었던 eupatilin과 jaceosidin의 peak이 AP-1에서 나타났으며 나머지 두 가지 띠에 대해서는 밝혀지지 않았다.
사용균주: 본 실험에 사용된 균주는 피부상재균으로서, Gram (+) 균주 3종, Gram (-) 균주 2종 및 효모균 1종으로 총 6종의 균주이며, 여드름의 원인균인 P. acnes ATCC6919와 비듬균인 P. ovale ATCC12078, 호기성 Gram (+) 균주인 S. aureus ATCC6538, B. subtilis ATCC19659, 호기성 Gram (-) 균주인 E. coli ATCC23736, P. aeruginosa ATCC29336를 한국 미생물 보존센터(KCCM)에서 분양받아 사용하였다.
사자발쑥 추출물들의 세포 보호 효과는 각 농도에서 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획에 비하여 아글리콘 분획에서 우수하게 나타났고, 지용성 항산화제이며 지질과산화반응의 라디칼 연쇄반응의 차단제로 알려진 비타민 E 성분인 (+)-α-토코페롤을 비교물질로 사용하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D. 는 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5×107 cells/mL이었다.
완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, NaCl, 그리고 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
6). 이 분리된 TLC 띠 성분을 확인하기 위하여 UV-visible 스펙트럼, HPLC에 의한 분리, LC/ESI-MS 등에 의한 분자량 등의 분광학적 데이터를 이용하였다.
6 mm, 5 µm, Phenomenex)을 이용하였고, 주입량은 20 µL였다. 이동상으로 MeOH 수용액(A 용매)과 0.4% H₃PO₄수용액(B 용매)을 전개용매로 사용하였다. 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획의 경우 기울기 용리법은 0~10분까지 50% A에서 70% A; 10~30분까지 70% A에서 70% A이며, 검출파장은 340 nm, 유속은 1 mL/min로 분리하였다[23].
적혈구 현탁액 제조: 적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 항응고제인 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
LC/ESI-MS/MS를 이용한 사자발쑥 추출물의 플라보노이드 분석: LC/ESI-MS/MS는 액체 상태의 물질을 이온화(ion spray)하여, 검출기에 의해서 질량/하전량과의 비(m/z)에 따라 분리 검출하여 분석 물질의 질량 및 구조를 확인함으로써, 천연물의 분자량과 구조를 동정한다. 측정방법으로 LC 분석은 autosampler와 diode-array detector (DAD)가 장착된 Agilent (Waldbronn, Germany) Model 1100을 사용하였다. 컬럼은 Pursuit XRs C18 (2.
acnes는 4℃에서 보관하면서 실험 72시간 전에 활성화 시켰으며, 균을 배양 배지에 접종한 후 anaerobic jar에서 Gaspack system(Merck Anaerocult^® Gaspack system, Germany)을 사용하여 밀봉하여 37℃에서 72시간 동안 혐기성 배양하였다. 호기성 Gram (+) 균주인 S. aureus, B. subtilis와 Gram (-) 균주인 E. coli, P. aeruginosa는 Mueller-Hinton 배지 (Merck, Germany)를 사용하였으며 균을 접종한 후 37℃ incubator에서 24시간 배양하였다. 또한 비듬균인 P.

데이터처리

Rosebengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120분까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.

이론/모형

Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정: 각 추출물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 배양된 균주는 1×10⁷CFU/mL으로 조절한 후 본 실험에 사용하였다.
멜라닌 함량을 감소시키거나 표피로 전달되는 과정을 차단하기 위한 미백 효능 평가의 방법으로 타이로시네이즈 저해활성 평가법을 이용하였다. L-타이로신의 기질로부터 멜라닌 생성과정에서 타이로시네이즈가 핵심효소로 작용하여 생성되기 때문에 타이로시네이즈의 저해활성은 미백활성을 측정하는데 중요하다.
최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정: paper disc 실험을 통해서 강력한 항균력을 나타낸 사자발쑥의 에틸아세테이트 분획물에 대한 정확한 최소저해농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 조사하기 위하여 agar-dilution method를 사용하여 수행되었다[4]. 각각의 균주는 농도를 1×10⁷CFU/mL로 조절한 후 본 실험에 사용하였다.

성능/효과

(+)-α-토코페롤의 세포 보호 효과는 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL에서 각각 34.00분, 40.00분, 58.00분으로 나타났으며, 동일 농도 25 µg/mL에서 (+)-α-토코페롤(40.00분) 과 아글리콘 분획(117.30분)을 비교하였을 때, 아글리콘 분획의 세포 보호 효과가 훨씬 더 크게 나타났다(Fig. 4).
6에 나타났다. 50% 에탄올로 추출한 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획으로 8개의 띠(AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7, AP-8)로 분리됨을 나타났다. 그 중 AP-1 (Rf 0.
HPLC 및 LC/ESI-MS/MS를 이용한 사자발쑥 추출물의 플라보노이드 분석: UV-visible 스펙트럼을 이용하여 2차 분리한 TLC 크로마토그램의 7개 peak에 대한 UV 스캔 결과, 7개 peak의 최대 흡수 파장(λmax) 중에서 2개의 peak(AP 1-1, AP 1-3)에서 플라보노이드 성분의 최대흡수 파장과 유사함을 보였다.
Table 2에 나타난 바와 같이, Gram (+) 세균에서 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획의 최소저해농도는 모두 625 µg/mL 로 나타났고, 아글리콘에서의 최소저해농도는 S. aureus (625 µg/mL), B. subtilis (325 µg/mL) 및 P. acnes (2,500 µg/mL) 을 나타났다.
그 결과, AP 1-1은 negative ion mode에서 분자 이온 [M-H]−는 m/z 343.3에서 나타났으며, LC/ESI-MS/MS에서는 분자이온에서 −CH3-단위의 소실에 의한 결과로 ion peak는(m/z 343.1 → m/z 328.2)로 나타났다(Fig. 8).
6에 나타난 2차 분리를 한 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 50% 에탄올로 추출·여과하여 용매를 감압·건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올 용액으로 녹여 HPLC로 분석하여 확인하였다. 그 결과, TLC를 통해 분리된 7개의 peak이 단일물질임을 HPLC를 통해서 확인하였으며 Ryu 등[23]이 기술한 바와 같이 Fig. 6의 TLC AP 1-1 (Rf 0.91)는 eupatilin(17.42 min)의 peak과 일치하였고, TLC AP 1-3 (Rf 0.78)는 jaceosidin(14.72 min)과 일치함을 확인하였다(data not shown).
50% 에탄올로 추출한 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획으로 8개의 띠(AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7, AP-8)로 분리됨을 나타났다. 그 중 AP-1 (Rf 0.92), AP-3 (Rf 0.81), AP-4 (Rf 0.73), AP-5 (Rf 0.49)는 자외선 흡수 및 NP-PEG 발색법으로 확인한 결과 추출물 중 주요 성분임을 확인할 수 있었다. 이 4개의 띠를 TLC 크로마토그램에서 각각 긁어서 추출·여과하고 여액을 감압·건조시켜 얻은 띠들의 파우더를 성분 분석에 사용하였다.
대조군(control)은 τ50이 31분으로 오차범위 ±1 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
따라서 총항산화능은 에틸아세테이트 분획이 당을 제거시킨 아글리콘 분획 및 50% 에탄올 추출물보다 활성산소 소거활성이 큼을 알 수 있다. 에틸아세테이트 분획은 비교물질로 사용한 L-아스코르빅산(1.
acnes (2,500 µg/mL)을 나타났다. 따라서, 에틸아세테이트 분획은 아글리콘보다 뛰어난 항균활성을 나타냈다. 또한 비교물질인 methyl paraben과 비교 시, Gram (-) 세균의 경우는 비교물질로 사용된 methyl paraben보다 항균활성이 떨어지지만, Gram (+) 세균의 경우에서는 에틸아세테이트 분획이 methyl paraben 보다 항균활성이 약 2-3배 높게 나타났다.
따라서, 에틸아세테이트 분획은 아글리콘보다 뛰어난 항균활성을 나타냈다. 또한 비교물질인 methyl paraben과 비교 시, Gram (-) 세균의 경우는 비교물질로 사용된 methyl paraben보다 항균활성이 떨어지지만, Gram (+) 세균의 경우에서는 에틸아세테이트 분획이 methyl paraben 보다 항균활성이 약 2-3배 높게 나타났다. 그러므로 여드름균인 P.
또한, 1O2으로 유도된 적혈구의 광용혈 실험에서 추출물의 µg/mL 농도 범위(5~50 µg/mL)에서 농도-의존적으로 세포 보호 효과를 나타내었으며, 25 µg/mL의 농도에서 아글리콘 분획은 비교물질인 (+)-α-토코페롤과 비교했을 때, 약 3 배정도 높은 세포보호활성을 나타내었다.
이로써 사자발쑥 추출물의 분획은 Gram (+) 세균에서만 높은 항균활성을 나타내는 것을 알았다. 또한, 비듬균인 P. ovale와 여드름균인 P. acnes의 항균활성은 P. ovale의 경우는 전혀 항균활성이 없는 반면에, P. acnes에서는 강력한 항균활성을 보였다. 이를 통해, 사자발쑥 추출물의 분획은 Gram (+) 세균에서만 항균활성을 나타내기 때문에 피부상재균 중에 Gram (+) 세균인 여드름균에 높은 항균활성을 나타났고, 효모균인 비듬균에서는 항균활성이 나타나지 않은 것으로 예상된다.
subtilis에서 높은 항균활성이 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획에서는 화장품에 방부제로 사용되고 있는 methyl paraben보다 높은 항균활성이 나타났다. 반면에 Gram (-) 세균의 경우에 methyl paraben은 높은 항균활성을 나타냈지만, 사자발쑥 분획의 경우에는 항균활성이 없는 것으로 나타났다. 이로써 사자발쑥 추출물의 분획은 Gram (+) 세균에서만 높은 항균활성을 나타내는 것을 알았다.
acnes를 포함한 총 6종의 세균을 disc 확산법으로 실시한 결과는 Table 1과 같이 나타났다. 사자발쑥 분획의 경우, Gram (+) 세균인 S. aureus, B. subtilis에서 높은 항균활성이 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획에서는 화장품에 방부제로 사용되고 있는 methyl paraben보다 높은 항균활성이 나타났다. 반면에 Gram (-) 세균의 경우에 methyl paraben은 높은 항균활성을 나타냈지만, 사자발쑥 분획의 경우에는 항균활성이 없는 것으로 나타났다.
사자발쑥 추출물의 free radical 소거능력(FSC50)은 에틸아세테이트 분획(12.27 µg/m)에서 비교적 큰 소거활성을 나타내었고, 활성산소 소거활성(OSC50)은 에틸아세테이트 분획(0.33 µg/mL)에서 비교물질로 사용한 L-아스코르빅산(1.50 µg/mL)의 총항산화능보다 약 5배 더 높은 활성을 보였으며, 나머지 추출물 역시 비교물질과 비슷한 활성을 보였다.
사자발쑥 추출물의 항균활성 측정결과, 에틸아세테이트 분획의 피부 상재균에 대한 MIC는 Gram (+) 세균에서 높은 활성을 보였으며, 화장품에 사용되고 있는 방부제인 methyl paraben 보다 높은 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다. 이를 통해 천연 방부제, 항균제로서 역할이 충분히 기대된다.
92%이었다. 에틸아세테이트 분 획은 50% 에탄올로 추출한 것을 1차 n-헥산으로 비극성 물질을 제거한 뒤 에틸아세테이트 분획을 추출하여 감압농축 하였고 수득률이 약 2.66%이었으며, 에틸아세테이트 분획을 산 가수분해시켜서 당을 제거한 아글리콘의 수득률은 1.60%였다. 에틸아세테이트 분획은 플라보노이드 배당체를 많이 함유하고 있으며, 아글리콘 분획에는 플라보노이드 배당체로 이루어진 에틸아세테이트 분획에서 당이 제거시킨 것으로 아글리콘이 주성분으로 존재한다.
에틸아세테이트 분획은 비교물질로 사용한 L-아스코르빅산(1.50 µg/mL)의 총항산화능보다 약 5배 더 높은 활성을 보였다.
40분)으로 세포보호 효과를 나타냈다. 에틸아세테이트 분획의 경우 같은 농도 범위에서 각각 31.30, 37.20, 38.10, 52.40, 77.00분, 아글리콘 분획의 경우 29.50, 43.00, 62.50, 117.30분으로 모두 농도 의존적으로 세포보호 효과를 나타냈다(Fig. 4). 사자발쑥 추출물들의 세포 보호 효과는 각 농도에서 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획에 비하여 아글리콘 분획에서 우수하게 나타났고, 지용성 항산화제이며 지질과산화반응의 라디칼 연쇄반응의 차단제로 알려진 비타민 E 성분인 (+)-α-토코페롤을 비교물질로 사용하였다.
반면에 Gram (-) 세균의 경우에 methyl paraben은 높은 항균활성을 나타냈지만, 사자발쑥 분획의 경우에는 항균활성이 없는 것으로 나타났다. 이로써 사자발쑥 추출물의 분획은 Gram (+) 세균에서만 높은 항균활성을 나타내는 것을 알았다. 또한, 비듬균인 P.
acnes에서는 강력한 항균활성을 보였다. 이를 통해, 사자발쑥 추출물의 분획은 Gram (+) 세균에서만 항균활성을 나타내기 때문에 피부상재균 중에 Gram (+) 세균인 여드름균에 높은 항균활성을 나타났고, 효모균인 비듬균에서는 항균활성이 나타나지 않은 것으로 예상된다.
항산화 활성과 항균활성 및 미백효과가 뛰어난 에틸아세테이트 분획에서 TLC 및 HPLC 크로마토그램을 통한 다양한 성분의 peak 중에서 2개의 peak (TLC, AP 1-1 및 AP 1-3)를 확인하였으며, LC/ESI-MS/MS의 negative ion 모드에서 HPLC peak 1 (AP 1-3)은 분자 이온 [M-H]− 이 m/z 329.1, HPLC peak 2 (AP 1-1)는 m/z 343.3로 나타났다.
활성 산소 소거활성(총항산화능, OSC50)은 사자발쑥 전초의 50%에탄올 추출물이 1.32 µg/mL, 에틸아세테이트 분획이 0.33 µg/mL, 아글리콘 분획이 1.96 µg/mL로 나타났다.

후속연구

또한 비교물질인 methyl paraben과 비교 시, Gram (-) 세균의 경우는 비교물질로 사용된 methyl paraben보다 항균활성이 떨어지지만, Gram (+) 세균의 경우에서는 에틸아세테이트 분획이 methyl paraben 보다 항균활성이 약 2-3배 높게 나타났다. 그러므로 여드름균인 P. acnes와 습진을 유발하는 S. aureus 등의 Gram (+) 세균의 피부 감염에 의한 예방으로 사용될 수 있을 것이다. 또한 현재 화장품에 사용되고 있는 방부제나 항진균제보다 뛰어난 천연방부제, 항진균제로서의 역할이 충분히 기대된다.
aureus 등의 Gram (+) 세균의 피부 감염에 의한 예방으로 사용될 수 있을 것이다. 또한 현재 화장품에 사용되고 있는 방부제나 항진균제보다 뛰어난 천연방부제, 항진균제로서의 역할이 충분히 기대된다.
)에 의한 세포 손상(또는 파괴)을 모델로 한 적혈구 광용혈 실험을 통해서 세포 보호 효과를 측정하는 실험이다. 빛과 광증감제인 rosebengal에 의해 유도된 적혈구의 용혈 정도를 측정하여 추출물이 자외선에 의한 피부 보호 물질로서 적합한 지에 대한 가능성을 판단할 수 있다고 사료된다.
이상의 결과들은 사자발쑥 추출물의 항산화 작용과 더불어 타이로시네이즈 저해활성으로부터 미백효능 그리고 피부 상재군에 대한 항균활성 등 기능성원료로서 응용 가능성이 큼을 시사된다. 추가적으로 화장품에 이용하기 위해서는 활성 성분을 이용한 피부 흡수 증진 시스템 개발과 제형 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.
이상의 결과들은 사자발쑥 추출물의 항산화 작용과 더불어 타이로시네이즈 저해활성으로부터 미백효능 그리고 피부 상재군에 대한 항균활성 등 기능성원료로서 응용 가능성이 큼을 시사된다. 추가적으로 화장품에 이용하기 위해서는 활성 성분을 이용한 피부 흡수 증진 시스템 개발과 제형 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	피부가 항상 노출되고 있는 산화적 스트레스의 종류는?	피부는 항상 산소와 접촉하고 있으며 산화적 스트레스(자외선, 공해, 미생물 등)에 노출되어 있다. 이들 산화적 스트레스는 생체 내 산화적 손상 및 항상성 붕괴를 통하여 피부노화를 가속화시킬 수 있다.
	산화적 스트레스가 피부에 주는 피해는?	피부는 항상 산소와 접촉하고 있으며 산화적 스트레스(자외선, 공해, 미생물 등)에 노출되어 있다. 이들 산화적 스트레스는 생체 내 산화적 손상 및 항상성 붕괴를 통하여 피부노화를 가속화시킬 수 있다. 피부노화의 원인은 크게 두 가지로 구분된다.
	피부노화의 원인을 크게 두가지로 나눈다면?	피부노화의 원인은 크게 두 가지로 구분된다. 특별한 환경적 요인 없이 시간의 흐름에 따라 피부구조의 변화와 생리적 기능이 쇠퇴하여 나타나는 내인성 노화와 공해, 자외선과 같은 외부 환경 요인에 의해서 나타나는 외인성 노화로 구분된다[8, 14, 25]. 외인성 노화의 대표적인 예로는 광노화를 들 수 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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