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문제 정의
- 곶감의 저장 및 유통시의 품질 안정성을 위한 연구로는 주로 전처리와 포장방법에 따른 곶감 저장 중의 품질변화에 대한 것으로서 자몽종자추출물 처리와 포장방법에 따른 반건시 곶감의 품질변화(13), 곶감의 색 변화에 대한 전처리와 저장온도의 영향(14), 계피 추출물 처리와 포장방법에 따른 곶감의 품질변화(15), 전처리와 포장재에 따른 곶감의 저장 중 품질변화(16) 등이 있으나, 곶감 건조시의 오염 미생물방지와 관련된 다양한 연구가 부족한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 고품질 곶감 제조의 일환으로 곶감으로부터 오염균을 분리하고 동정하여, 곶감 건조 및 저장 중의 오염 저감화를 위한 기초 연구자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- 곶감에 존재하는 주요 오염균을 조사하기 위하여 주요 상재균에 대한 균수를 확인하였다(Table. 3). 주요 비율을 차지하는 오염균은 배지별로 약간 차이가 있었으나 분리된 3종의 곰팡이 중에서는 K2-1인 푸른곰팡이가 전반적으로 가장 많은 비율을 차지하여 우점종인 것으로 나타났으며, 곶감 오염에 있어 주요 원인균인 것으로 판단하였다.
- 곶감으로부터 분리한 곰팡이 및 효모균주의 26S K1/D2 및 ITS 영역의 염기서열을 조사하여 NCBI의 GenBank(효모균주)/CBS DB(곰팡이균주)에 등록된 균주의 염기서열과 비교하였으며, 분리한 세균 2주는 16S rRNA 유전자 염기서열을 조사하여 NCBI의 GenBank 및 EzTaxon server 2.1을 이용하여 등록된 균주의 염기서열과 비교하였다. 주요 오염 원인균으로 추측되는 K2-1은 Penicillium sp.
- 곶감으로부터 분리한 곰팡이, 효모 균주를 동정하기 위해 분류학적으로 의미를 가지는(동정 key로 사용될 수 있는) 유전자의 염기서열을 조사하여 동정하는 분자분류법을사용하였으며, 곰팡이균주 동정에는 ITS영역의 염기서열을 조사하였고 효모균주의 경우는 D1/D2 영역의 염기서열을 조사하여 동정결과를 분석하였다.
- 곶감으로부터 오염 미생물을 분리하기 위해 분쇄기(7010S, Warning, Germany)로 마쇄한 곶감을 0.85% NaCl를 이용하여 단계 희석하였다. 각 배지에 시료 희석액 0.
- 배양 후 종류별 배지로부터 전체 오염균수를 측정하였으며, 오염균의 종류별(효모, 곰팡이)로 상대적으로 많은 비율을 차지하고 있는 오염균의 배지별 균수(곰팡이, 효모, 세균)를 각각 표시하였다.
- 1 mL 를 도말한 후 28℃ incubator (BS-21, Jeiotech)에서 약 3일간 배양하였다. 배양 후 콜로니의 모양, 크기, 색택, 광택 등 형태적 특징을 관찰하여 육안적으로 다른 균주로 예상되는 각 균주에 대해 tooth-picking을 실시하였다.
- 곶감으로부터의 오염 미생물 분리를 위해 PDA (Potato dextrose agar, Difco, USA), NA (Nutrient agar, Difco, USA), YPD, YM (Yeast malt, Difco, USA), MRS (Difco, USA), Czapeck agar 및 LB (Luria bertani, Difco, USA) 배지를 사용하였다. 분리된 곰팡이의 생육 및 보존을 위한 배지는 PDA를 사용하였으며, 세균은 LB, 효모는 YM 배지를 사용하였으며 오염 미생물의 분리 및 배양은 28℃ incubator에서 3일간 실시하였다.
- 분석된 각 효모 및 곰팡이균주의 염기서열은 NCBI에서 blast/CBS DB* 검색을 통해 GenBank에 등록된 균주의 서열과 비교하였으며, 염기서열 비교결과 가장 높은 유사도를 나타내는 (표준)균주를 기준으로 각 균주를 동정하였다(*CBS 염기서열 DB : http://www.cbs.knaw.nl/fungi/ BioloMICSSequences.aspx).
- 상기 primer sets을 이용하여 분리균주의 26S rDNA D1/D2와 ITS영역을 PCR (MJ Research PTC 225, Ramsey, Minnesota, USA)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 생산물은 QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제했다. 정제한 PCR 산물의 염기서열 분석은 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)와 ABI 310 DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 상기의 primer set을 이용하여 세균의 16S rRNA 유전자 영역을 PCR (MJ Research PTC 225, Ramsey, Minnesota, USA)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 생산물은 QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제 하였고, 정제한 PCR 산물의 염기서열 분석은 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)와 ABI 310 DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 실험을 위해 먼저 분리균주로부터 Smith 등(17)의 방법에 따라 genomic DNA를 추출하였으며, 분자분류를 위해 효모균주의 26S D1/D2영역 증폭을 위하여 NL1 (5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’)과 NL4 (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) primer set (18)을 사용하였으며, 곰팡이균주의 ITS 영역 염기서열분석에는 ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)과 ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) primer set (19)을 사용하였다.
- 실험을 위해 먼저 세균으로부터 genomic DNA를 추출하였으며, 세균의 16S rRNA유전자 영역 증폭을 위하여 27f (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)과 1492r (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) primer set을 사용하였다.
- 상기 primer sets을 이용하여 분리균주의 26S rDNA D1/D2와 ITS영역을 PCR (MJ Research PTC 225, Ramsey, Minnesota, USA)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 생산물은 QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제했다. 정제한 PCR 산물의 염기서열 분석은 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)와 ABI 310 DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 곶감으로부터의 오염 미생물 분리를 위해 PDA (Potato dextrose agar, Difco, USA), NA (Nutrient agar, Difco, USA), YPD, YM (Yeast malt, Difco, USA), MRS (Difco, USA), Czapeck agar 및 LB (Luria bertani, Difco, USA) 배지를 사용하였다. 분리된 곰팡이의 생육 및 보존을 위한 배지는 PDA를 사용하였으며, 세균은 LB, 효모는 YM 배지를 사용하였으며 오염 미생물의 분리 및 배양은 28℃ incubator에서 3일간 실시하였다.
- 실험에 사용한 시료는 경북 상주지역에서 생산된 곶감 중 오염된 곶감(건조/저장 중 곶감 표면이 푸른 곰팡이로 오염된 시료) 2009년 7월 상주시로부터 제공받은 것을 사용하였다. 일반 정상 곶감 시료(시판 중인 정상품질의 곶감)는 2010년 2월에 상주지역에서 사용하였다.
- 실험에 사용한 시료는 경북 상주지역에서 생산된 곶감 중 오염된 곶감(건조/저장 중 곶감 표면이 푸른 곰팡이로 오염된 시료) 2009년 7월 상주시로부터 제공받은 것을 사용하였다. 일반 정상 곶감 시료(시판 중인 정상품질의 곶감)는 2010년 2월에 상주지역에서 사용하였다. 수집한 곶감은 -18℃ 냉동고에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 분석된 각 세균 균주의 염기서열은 EzTaxon server 2.1*과 NCBI Blast 검색을 통해 GenBank에 등록된 균주의 염기서열과 비교하였으며, 염기서열 비교결과 가장 높은 유사도를 나타내는 표준균주를 기준으로 각 균주를 동정하였다(*EzTaxon server 2.1 :http://147.47.212.35:8080/ index.jsp).
이론/모형
- The tree was constructed by neighbor-joining method. Numbers at nodes are bootstrap percentage based on 1,000 resampled datasets.
- 본 실험에서는 분리 배양된 세균 2균주를 동정하기 위하여 분류학적으로 의미를 가지는(동정 key로 사용될 수 있는) 유전자의 염기서열을 조사하여 균주를 동정하는 분자분류법을 사용하였다.
성능/효과
- YM 배지의 경우 푸른곰팡이>효모(크림색), 효모(연보라색) 순이었으며, 푸른곰팡이(K2-1)가 3.09×102 CFU/g으로 가장 많은 비율을 차지하였으며, 크림색 효모와 연보라색 효모가 각각 6.18×102 CFU/g으로 나타났다.
- 02×103으로나타났다. 다음으로 크림색 효모, 연보라색 효모가 전체적으로 많이 상재하고 있는 것으로 나타났다. YM 배지의 경우 푸른곰팡이>효모(크림색), 효모(연보라색) 순이었으며, 푸른곰팡이(K2-1)가 3.
- 배지 종류별로 차이는 있었으나 전반적으로 K2-1으로 명명한 푸른 곰팡이가 분리된 다른 곰팡이에 비하여 상대적으로 많은 수를 나타내었으며, 시판되는 정상 품질 곶감의 경우 PDA 배지에서 3.09×102, YPD 배지에서는 1.02×103으로나타났다.
- 68×107 CFU/g으로 나타났다. 분리된 균의 모양, 색택 등의 형태적 특성을 육안으로 관찰하여 다르게 보이는 균을 tooth-picking을 이용하여 곶감으로부터 총 15종의 오염균이 순수 분리되었다. 곶감으로부터 분리한 오염균주 중 곰팡이는 3종, 효모 2종, 세균은 10종이었으며, 분리한 오염균주의 콜로니를 배양한 후 오염균에 대하여 현미경을 이용하여 형태적 특성을 관찰한 결과는 Table 2와 같다.
- 3). 주요 비율을 차지하는 오염균은 배지별로 약간 차이가 있었으나 분리된 3종의 곰팡이 중에서는 K2-1인 푸른곰팡이가 전반적으로 가장 많은 비율을 차지하여 우점종인 것으로 나타났으며, 곶감 오염에 있어 주요 원인균인 것으로 판단하였다. 배지 종류별로 차이는 있었으나 전반적으로 K2-1으로 명명한 푸른 곰팡이가 분리된 다른 곰팡이에 비하여 상대적으로 많은 수를 나타내었으며, 시판되는 정상 품질 곶감의 경우 PDA 배지에서 3.
후속연구
- 곶감 건조시 기후 변동에 의한 곰팡이 오염 등으로부터 농가 피해를 최소화하고, 품질이 우수한 곶감을 제조하기 위해서는 본 연구에서 분리한 푸른 곰팡이 Penicillium sp. K2-1 등의 오염미생물 억제를 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 하지만, 아직까지 국내에서 곶감에 존재하는 오염 곰팡이와 이를 억제하기 위한 효과적인 산업화 적용방안에 관한 연구가 미흡한 실정이다. 그러므로, 곶감으로부터 분리한 오염 곰팡이의 억제를 위한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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