[논문]소청룡탕(小靑龍湯) 물 및 에탄올 추출물의 염증 관련 질환 약리 효능에 관한 실험적 연구

전우영; 이미영; 임혜선; 신인식; 김예지; 진성은; 유새롬; 서창섭; 김정훈; 하혜경; 정수진; 김온순; 신나라; 김성실; 신현규

doi:10.14374/hfs.2012.20.2.013

소청룡탕(小靑龍湯) 물 및 에탄올 추출물의 염증 관련 질환 약리 효능에 관한 실험적 연구
Experimental Studies on the inflammation-related diseases pharmacological effect of water and 70% ethanol extracts from Socheongnyong-tang 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.20 no.2, 2012년, pp.13 - 28

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Objectives : The present study aimed to investigate the pharmacological activity of water and ethanol (EtOH) extracts from Socheongnyong-tang (SCNT) on inflammation and its related disease. Methods : The cells were treated with nontoxic concentrations of water and EtOH extract from SCNT in BEAS-2B, HaCaT, RAW 264.7 and 3T3-L1 cells. These cells were stimulated by tumor necrosis facter (TNF)-${\alpha}$, TNF-${\alpha}$/interferon (IFN)-${\gamma}$, and lipopolysaccharide (LPS), respectively. 3T3-L1 cells were differentiated by insulin. After incubation, supernatant were collected and biological indicator measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results : Our results indicate that the water and EtOH extract of SCNT significantly inhibited the production of regulated on activation normal T-cell expression and secreted (RANTES) by treatment of TNF-${\alpha}$ in BEAS-2B cell, and significantly reduced the production of RANTES and macrophage-derived chemokine increased by treatment of TNF-${\alpha}$/IFN-${\gamma}$ in HaCaT cell. Moreover, those extracts significantly decreased the activity of nitric oxide and prostaglandin $E_2$ in LPS-induced RAW 264.7, and significantly inhibited the increased activity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase and expression of leptin induced by differentiation in 3T3-L1 cell. Conclusions : These results indicate that both water and EtOH extract of SCNT has powerful effects on inflammation and its related disease. Therefore, SCNT can be developed as a potential pharmacological agent related various diseases. Although the significant effects were observed in both SCNT water and EtOH extract, the EtOH extract was more effective on most experiments than its water extract. Taken together, these findings indicate that the SCNT EtOH extract may have more potential pharmacological agent.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

하지만 소청룡탕 추출물과 이를 구성하는 약재 및 주요 성분에 대한 약리적 활성 효과에 대해서는 이미 보고 되어 있지만, 소청룡탕의 용매별 추출물에 따른 성분 함량 및 약리 효능을 비교한 연구는 발표된 바 없었다. 따라서 본 연구에서는 소청룡탕을 선정하여, 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물의 구성약재에 대한 주요 성분을 동시분석하고, 염증과 관련된 다양한 질환 모델에서 나타나는 약리적 효능의 차이를 관찰하였다. 동시분석결과, 물 추출물보다 에탄올 추출물에서 모든 성분들의 함량이 높게 추출되어 나옴을 알 수 있었다.
의 실험보고에 의하면, 한약재는 70% 에탄올 추출물과 물 추출물에서의 활성성분의 분포 및 함량에 차이가 있으며, 효능에도 차이를 보인다고 하였다. 이에 본 연구에서는 소청룡탕 추출의 용매를 달리하여 용매별 추출에 따른 활성성분 분석과 효능을 평가하기 위하여, 염증 및 염증과 관련된 질환에 대한 활성을 물 추출물과 70% 에탄올 추출물을 이용하여 측정하였다.

제안 방법

3T3-L1 세포 대한 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물의 세포독성을 확인하였다(Fig. 6A and 6B). 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 1000 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났으며, 이는 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 1000 µg/mL까지의 농도에서는 독성이 없음을 확인하였다.
3T3-L1(1×105 cells/well) 세포를 48 well plate에 10% NCS가 포함된 DMEM 배지에 8일간 분화를 유도하면서, 추출용매별 시료를 처리하였다.
After 18h, cell were co-treated with various (6.25, 12.5, 25, 31.3, 50, 62.5, 100, 125, 250, 500 µg/mL) of SCNT extracts (water and EtOH extract) and TNF-α/IFN-γ (10 ng/mL), respectively.
BEAS-2B 세포에 대한 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물의 세포 독성을 확인하였다(Fig. 3A and 3B). 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 1000 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났으며, 본 실험에 적용된 독성이 없는 최고 농도를 500 µg/mL로 설정하였다.
7(Mouse Macrophage cell line) 세포주와 3T3-L1, 마우스 유래 지방 전구 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)으로부터 분양 받아 사용하였고, HaCaT(human keratinocyte cell line) 세포주는 세종대학교 이나경 교수님(Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. BEAS-2B 세포주와 HaCaT 세포주는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1% penicillin-streptomycin을 첨가하였고, RAW 264.7(Mouse Macrophage cell line) 세포주는 5.5% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1% penicillin-streptomycin을 첨가하였으며, 3T3-L1 세포주는 10% new born calf serum(NCS)가 포함된 DMEM 배지로, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 비만세포로서의 분화를 유도하기 위해 지방 전구 세포가 100% confluence 하게 되면 이로부터 2일 후에 분화 유도물질인 5 µg/mL insulin, 1 µM dexamethasone, 0.
BEAS-2B(3×104 cells/well) 세포를 48 well plate에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 18시간 배양한 후, 배지를 제거하여 serum-free DMEM으로 1회 세척한 후에 배지를 교체하고, 추출용매별 시료와 TNF-α(10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
BEAS-2B(6×103 cells/well), HaCaT(1×103 cells/well), RAW 264.7(3×103 cells/well)세포는 96 well plate에서 18 시간 배양한 후에 추출용매별 시료를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였고, 3T3-L1(5×104 cells/well) 세포는 8일간 분화를 유도하면서 추출용매별 시료를 농도별로 처리하였다.
cells/well) 세포를 6 well plate에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 18 시간 배양한 후, 배지를 제거하여 serum-free DMEM으로 1회 세척한 후에 배지로 교체하고, 추출용매별 시료와 TNF-α와 IFN-γ(각각 10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. ELISA kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액 내에 존재하는 RANTES 및 MDC의 분비량을 측정하였다.
cells/well) 세포를 48 well plate에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 18시간 배양한 후, 배지를 제거하여 serum-free DMEM으로 1회 세척한 후에 배지를 교체하고, 추출용매별 시료와 TNF-α(10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. ELISA kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액 내에 존재하는 RANTES의 분비량을 측정하였다.
HaCaT 세포에 대한 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물의 세포독성을 확인하였다(Fig. 4A and 4B). 소청룡탕의 물 추출물은 500 µg/mL 이하의 농도에서, 에탄올 추출물은 125 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났다.
HaCaT(1×106 cells/well) 세포를 6 well plate에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 18 시간 배양한 후, 배지를 제거하여 serum-free DMEM으로 1회 세척한 후에 배지로 교체하고, 추출용매별 시료와 TNF-α와 IFN-γ(각각 10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
RAW 264.7 세포에 대한 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물의 세포 독성을 확인하였다(Fig. 5A and 5B). 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 1000 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났으며, 이는 소청룡탕이 1000 µg/mL까지의 농도에서는 독성이 없음을 확인하였다.
MN, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 상대적인 세포 생존율(% of control)을 계산하였다. 이후의 실험은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 진행하였다.
5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 18 시간 배양한 후, 추출용매별 시료와 LPS(1 µg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각각, Griess reagent와 ELISA kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액 내에 존재하는 NO 및 PGE₂의 분비량을 측정하였다.
cells/well) 세포를 48 well plate에 10% NCS가 포함된 DMEM 배지에 8일간 분화를 유도하면서, 추출용매별 시료를 처리하였다. 분화 유도 후, ELISA kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액 내에 존재하는 leptin의 분비량을 측정하였고, 상등액을 수거한 세포는 assay kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 GPDH의 활성을 측정하였다.
비만세포로서의 분화를 유도하기 위해 지방 전구 세포가 100% confluence 하게 되면 이로부터 2일 후에 분화 유도물질인 5 µg/mL insulin, 1 µM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX) 가 포함된 3T3-L1 differentiation medium을 2일 동안 처리하였고, 다시 10% FBS와 1 µg/mL insulin을 포함한 DMEM으로 2 일간 배양하였다.
소청룡탕 추출물은 Table 1과 같이 구성한약재를 무게 비율로 배합하여 물과 70% 에탄올을 시료의 10배(각각 375 mL)로 각각 첨가하여 2시간 전탕 한 후 동결건조 하여 물 추출물 9.7 g(수율 25.9%)과 에탄올 추출물 6.9 g(수율 18.4%)을 얻었다. HPLC 분석을 위하여 물과 에탄올 추출물에 대하여 각각 200 mg을 정확히 측정한 후 물을 넣어 20 mL로 맞춘 후 0.
소청룡탕의 구성 약재 중 작약의 주요성분인 albiflrorin과 paeoniflorin, 계지의 주요성분인 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde, 감초의 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin 및 오미자의 주요성분인 schizandrin을 분석 대상으로 1.0% acetic acid가 함유된 물과 1.0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다. PDA 검출 파장은 230 nm, 254 nm 및 280 nm에서 각각 검출하였다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물에 대한 GPDH의 활성 및 leptin의 발현 억제 효과를 알아보기 위해, 3T3-L1 세포를 분화시켜 GPDH의 활성과 leptin의 발현을 유도시켰다. 그 결과, 분화유도에 의한 GPDH의 활성과 leptin의 발현은 유도하지 않은 군에 비해 각각 9배, 2.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물에 대한 NO 및 PGE2의 발현 억제 효과를 알아보기 위해, RAW 264.7세포에 LPS(1 µg/mL)를 처리하여 NO와 PGE2의 발현을 유도시켰다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물에 대한 RANTES 및 MDC의 발현 억제 효과를 알아보기 위해, HaCaT 세포에 TNF-α와 INF-γ의 병행 처리하여(각각 10 ng/mL) RANTES와 MDC의 발현을 유도시켰다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물에 대한 RANTES의 발현 억제 효과를 알아보기 위해, BEAS-2B 세포에 TNF-α (10 ng/mL)를 처리하여 RANTES의 발현을 유도시켰다.
이상과 같이 확립된 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물을 HPLC-PDA를 이용하여 동시분석을 실시하고 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 schizandrin 등 8종 성분에 대한 함량을 분석하였다. 함량 분석 결과 물 추출물에서 glycyrrhizin은 검출이 되지 않았으며 그 외 7종의 성분은 0.

대상 데이터

Tumor necrosis facter(TNF)-α, interferon(IFN)-γ, human-regulated on activation normal T-cell expression and secreted(RANTES)/CCL5 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit, human-macrophage-derived chemokine(MDC)/CCL22 ELISA Kit 및 Mouse-Leptin ELISA kit는 R&D systems(Minneapolis, MN, USA), lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA), Griess reagent는 Promega Corporation(Madison, WI, USA), prostaglandin E₂(PGE₂) ELISA kit는 Cayman Chemical Co.(Ann Arbor, MI, USA), glycerol-3-phosphate dehydrogenas(GPDH) activity Assay kit는 TAKARA(Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
또한 liquiritin은 NPC BioTechnology Inc.(Daejeon, Korea)로부터 구입하였다. HPLC를 이용하여 측정한 각 표준물질의 순도는 모두 98.
표준물질인 coumarin과 cinnamic acid는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, albiflorin, paeoniflorin, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 schizandrin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 또한 liquiritin은 NPC BioTechnology Inc.
Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, acetic acid는 특급시약으로 Junsei Chemical Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
8종의 표준품인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 schizandrin (Fig. 1) 등에 대한 표준용액은 메탄올을 이용하여 1.0 mg/mL의 농도로 조제한 후 4℃에 보관하면서 사용 전에 희석하여 사용하였다. 검량선은 albiforin과 liquiritin 0.
BEAS-2B(human bronchial epithelial cell line), RAW 264.7(Mouse Macrophage cell line) 세포주와 3T3-L1, 마우스 유래 지방 전구 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)으로부터 분양 받아 사용하였고, HaCaT(human keratinocyte cell line) 세포주는 세종대학교 이나경 교수님(Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. BEAS-2B 세포주와 HaCaT 세포주는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1% penicillin-streptomycin을 첨가하였고, RAW 264.
0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다. PDA 검출 파장은 230 nm, 254 nm 및 280 nm에서 각각 검출하였다. 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retention time과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, 8종의 성분은 8.
본 실험에 사용된 소청룡탕의 구성 한약재(Table 1)는 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 각각 구입하였다. 구입한 한약재는 이제현 교수(Dongguk University, Gyeongju, Korea)와 서영배 교수(Daejeon University, Daejeon, Korea) 2인의 전문가 감별 후 사용하였으며, 각각의 구성 한약재들의 표본(2012-KE13-1~2012-KE13-8)은 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin, phosphate-buffered saline 은 Gibco BRL.
본 실험에 사용된 소청룡탕의 구성 한약재(Table 1)는 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 각각 구입하였다. 구입한 한약재는 이제현 교수(Dongguk University, Gyeongju, Korea)와 서영배 교수(Daejeon University, Daejeon, Korea) 2인의 전문가 감별 후 사용하였으며, 각각의 구성 한약재들의 표본(2012-KE13-1~2012-KE13-8)은 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
분석에 사용된 칼럼은 Gminin C18(5µm, 4.6×150 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40℃로 유지하였다.
표준물질인 coumarin과 cinnamic acid는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, albiflorin, paeoniflorin, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 schizandrin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다.

데이터처리

실험결과에 대한 통계학적 유의성 검정은 ANOVA 검정을 적용하였으며, Dunnet’s multiple comparison test를 이용하여 P-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

소청룡탕 내 주요성분인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 schizandrin의 함량을 분석하기 위하여 Shimadzu사의 LC-20A 시스템을 사용하여 측정하였다. HPLC는 LC-20A 시스템(Shimadzu Co.

성능/효과

Leptin의 발현은 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 모든 농도에서 유의미한 농도 의존적인 억제 효과를 보여주었다(p < 0.01).
7 세포에서 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 LPS에 의해 증가한 염증반응과 관계된 NO와 PGE₂의 발현을 억제 하는 효과를 통해서 항염증 작용을 나타냄을 보여주었다. NO와 PGE₂의 발현에 대한 억제 능력을 비교해보면, 물 추출물 보다는 에탄올 추출물이 더 강하게 나타내는 것을 통해, 에탄올 추출물이 항염증 작용에 더 탁월한 효과를 가질 것이라고 사료된다.
PDA 검출 파장은 230 nm, 254 nm 및 280 nm에서 각각 검출하였다. 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retention time과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, 8종의 성분은 8.77, 9.64, 11.55, 17.60, 20.52, 23.12, 30.98 및 31.45분에 각각 검출되었다(Fig. 2).
7세포에 LPS(1 µg/mL)를 처리하여 NO와 PGE₂의 발현을 유도시켰다. 그 결과, LPS에 의한 NO와 PGE₂의 발현은 처리하지 않은 군에 비해 각각 26배, 19배로 증가되는 것을 확인하였다. 이렇게, 증가한 NO의 발현을 소청룡탕의 물 추출물에서는 최고 농도와 최저 농도를 제외한 중간의 농도에서 유의성이 있는 감소를 나타냈는데(p < 0.
그 결과, TNF-α에 의한 RANTES의 발현은 처리하지 않은 군의 비해 69배로 증가되는 것을 확인하였고, 증가한 RANTES의 발현은 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 모든 농도에서 농도의존적으로 유의성 있는 감소를 보여주었다(Fig. 3C).
그 결과, TNF-α와 INF-γ의 병행 처리에 의한 RANTES와 MDC의 발현은 처리하지 않은 군의 비해 각각 38배, 22배로 증가되는 것을 확인하였다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물에 대한 GPDH의 활성 및 leptin의 발현 억제 효과를 알아보기 위해, 3T3-L1 세포를 분화시켜 GPDH의 활성과 leptin의 발현을 유도시켰다. 그 결과, 분화유도에 의한 GPDH의 활성과 leptin의 발현은 유도하지 않은 군에 비해 각각 9배, 2.5배로 증가되는 것을 확인하였다. 이렇게 증가한 GPDH의 발현을 물 추출물에서는 모든 농도에서 유의성이 있는 감소를 나타냈으며 (p < 0.
따라서 본 연구에서는 소청룡탕을 선정하여, 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물의 구성약재에 대한 주요 성분을 동시분석하고, 염증과 관련된 다양한 질환 모델에서 나타나는 약리적 효능의 차이를 관찰하였다. 동시분석결과, 물 추출물보다 에탄올 추출물에서 모든 성분들의 함량이 높게 추출되어 나옴을 알 수 있었다. 이는 약리학적 효능에 있어서 물 추출물보다 에탄올 추출의 효능이 더 강하게 나타날 것이라고 판단되었다.
실험 결과로 볼 때, 물 추출물 보다 에탄올 추출물의 억제 효과가 더 강하게 나타났으며, 이는 분석결과에서 각각의 약재들의 지표 성분들의 함량이 더 높게 나왔던 것과 관계가 있는 것으로 사료된다. 따라서, 소청룡탕의 에탄올 추출물이 물 추출물보다 염증과 관련된 각종 질환에 치료 효능이 더 높을 것으로 판단된다.
9995 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다. 또한 6종 성분의 피크 면적과 머무름 시간에 대한 재현성은 모두 상대표준편차가 1.00%와 0.05% 이내로 양호한 재현성을 나타내었다. 검량선과 재현성 결과는 Table 2에 나타내었다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 BEAS-2B 세포와 HaCaT 세포에서 각각 TNF-α와 TNF-α/INF-γ의 병행처리로 인해 자극되어 증가한 RANTES 및 MDC의 발현을 크게 억제하였다. 또한 RAW 264.7세포에서 LPS로 자극되어 증가한 NO 및 PGE₂의 생성과 3T3-L1 세포에서 분화 유도 후, 증가한 GPDH의 활성 및 leptin의 발현을 유의적으로 감소시켰다. 실험 결과로 볼 때, 물 추출물 보다 에탄올 추출물의 억제 효과가 더 강하게 나타났으며, 이는 분석결과에서 각각의 약재들의 지표 성분들의 함량이 더 높게 나왔던 것과 관계가 있는 것으로 사료된다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 1000 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났으며, 이는 소청룡탕이 1000 µg/mL까지의 농도에서는 독성이 없음을 확인하였다. 또한, 에탄올 추출물은 모든 농도에서 세포 생존능력이 증가한 것으로 보아 세포증식 효과가 있는 것으로 판단되었다. 따라서 본 실험에 적용된 독성이 없는 최고 농도를 1000 µg/mL로 설정하였다.
또한, 증가한 PGE2의 발현은 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 모든 농도에서 유의성이 있는 감소를 나타냈으며(p < 0.01), 특히, 이러한 억제 효과는 물 추출물 보다 에탄올 추출물의 250 µg/mL 이상의 농도에서 90% 이상의 유의성 있는 강한 억제 효과를 나타냈다(Fig. 5C and 5D).
소청룡탕의 물 추출물은 500 µg/mL 이하의 농도에서, 에탄올 추출물은 125 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 1000 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났으며, 본 실험에 적용된 독성이 없는 최고 농도를 500 µg/mL로 설정하였다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 1000 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났으며, 이는 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 1000 µg/mL까지의 농도에서는 독성이 없음을 확인하였다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 1000 µg/mL 이하의 농도에서 대조군 대비 세포 생존능력이 90% 이상으로 나타났으며, 이는 소청룡탕이 1000 µg/mL까지의 농도에서는 독성이 없음을 확인하였다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 BEAS-2B 세포와 HaCaT 세포에서 각각 TNF-α와 TNF-α/INF-γ의 병행처리로 인해 자극되어 증가한 RANTES 및 MDC의 발현을 크게 억제하였다.
소청룡탕의 물과 에탄올 추출물을 분석한 결과, 에탄올 추출물이 물 추출물보다 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 schizandrin의 성분들의 함량이 높게 추출되었다. 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 BEAS-2B 세포와 HaCaT 세포에서 각각 TNF-α와 TNF-α/INF-γ의 병행처리로 인해 자극되어 증가한 RANTES 및 MDC의 발현을 크게 억제하였다.
7세포에서 LPS로 자극되어 증가한 NO 및 PGE₂의 생성과 3T3-L1 세포에서 분화 유도 후, 증가한 GPDH의 활성 및 leptin의 발현을 유의적으로 감소시켰다. 실험 결과로 볼 때, 물 추출물 보다 에탄올 추출물의 억제 효과가 더 강하게 나타났으며, 이는 분석결과에서 각각의 약재들의 지표 성분들의 함량이 더 높게 나왔던 것과 관계가 있는 것으로 사료된다. 따라서, 소청룡탕의 에탄올 추출물이 물 추출물보다 염증과 관련된 각종 질환에 치료 효능이 더 높을 것으로 판단된다.
에탄올 추출물에서는 최고 낮은 농도를 제외한 나머지 모든 농도에서는 농도 의존적으로 유의성 있는 감소를 나타냈으며, 특히 1000 µg/mL 농도에서는 40% 이상의 유의성 있는 억제 효과를 나타냈다(p < 0.01).
우리의 결과는 BEAS-2B 세포에서 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 TNF-α에 유도되어 증가한 RANTES의 발현 억제 조절을 통해 항천식 효과를 나타낸다고 보여주었다.
우리의 결과는 HaCaT 세포에서 소청룡탕의 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 TNF-α와 INF-γ의 병행 처리로 증가한 RANTES와 MDC의 증가한 발현을 억제시킴으로써 항아토피 작용이 있을 것으로 사료되었다.
이전의 연구에서 3T3-L1 세포는 분화가 시작되면, 세포내 지방 축적이 일어나 GPDH와 leptin과 같은 효소 및 유전자의 발현이 증가하게 되는데 이를 억제함으로써 항비만 효과에 기여한다고 보고하였다³⁸⁾. 우리의 연구 결과는 3T3-L1 세포에서 분화에 의해 증가한 GPDH의 활성과 leptin의 발현을 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 크게 감소시켰으며, 이는 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 항비만 작용을 가지고 있다고 보여진다. 특히, 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 증가한 leptin의 발현을 억제하는데 더 강한 효과를 나타냄으로써, 항비만 효과에 더 큰 영향을 줄 것 이라고 사료된다.
신 등³⁴⁾은 LPS와 같은 외부자극으로부터 증가되는 염증 매개체인, NO, PGE₂ 의 발현을 억제함으로써 항염증 효과가 있다고 입증하였다. 우리의 연구 결과는 RAW 264.7 세포에서 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 LPS에 의해 증가한 염증반응과 관계된 NO와 PGE₂의 발현을 억제 하는 효과를 통해서 항염증 작용을 나타냄을 보여주었다. NO와 PGE₂의 발현에 대한 억제 능력을 비교해보면, 물 추출물 보다는 에탄올 추출물이 더 강하게 나타내는 것을 통해, 에탄올 추출물이 항염증 작용에 더 탁월한 효과를 가질 것이라고 사료된다.
이렇게, 증가한 NO의 발현을 소청룡탕의 물 추출물에서는 최고 농도와 최저 농도를 제외한 중간의 농도에서 유의성이 있는 감소를 나타냈는데(p < 0.01), 이는 소청룡탕 물 추출물의 250 µg/mL 농도가 NO의 생성을 억제하는 최대 효능 농도로 보여진다.
이렇게, 증가한 RANTES의 발현을 소청룡탕의 물 추출물에서는 모든 농도에서 유의성 있게 농도 의존적인 감소를 나타냈고(p < 0.01), 에탄올 추출물에서는 낮은 농도에서는 효과가 없었지만, 25 µg/mL 이상의 농도에서는 농도 의존적으로 유의성 있는 감소를 나타냈다(p < 0.01).
이상의 실험결과로 미루어 볼 때, 에탄올 추출물이 물 추출물 보다 염증과 관련된 인자들의 생성에 더 좋은 효과를 보이지만, 에탄올 추출물이 물추출물 보다 최대 비독성 효능농도가 낮기 때문에 임상에 적용시 소청룡탕 물 추출물을 에탄올 추출물로 대체하기는 어려울 것으로 사료된다.
우리의 연구 결과는 3T3-L1 세포에서 분화에 의해 증가한 GPDH의 활성과 leptin의 발현을 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 크게 감소시켰으며, 이는 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물이 항비만 작용을 가지고 있다고 보여진다. 특히, 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 증가한 leptin의 발현을 억제하는데 더 강한 효과를 나타냄으로써, 항비만 효과에 더 큰 영향을 줄 것 이라고 사료된다.
특히, 에탄올 추출물은 모든 농도에서 MDC의 발현을 감소시켰고, 25 µg/mL, 50 µg/mL과 100 µg/mL의 농도에서는 농도 의존적으로 70% 이상의 유의성 있는 억제 효과 (p < 0.01)를 나타냈다(Fig. 4C and 4D).
특히, 이러한 억제 효과는 물 추출물 보다 에탄올 추출물이 모든 농도에서 90% 이상의 유의성 있는 강한 억제 효과를 나타냈다(p < 0.01).
우리의 결과는 BEAS-2B 세포에서 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물 모두 TNF-α에 유도되어 증가한 RANTES의 발현 억제 조절을 통해 항천식 효과를 나타낸다고 보여주었다. 특히, 이러한 억제 효과는 물 추출물보다 에탄올 추출물에서 크게 나타냄으로써, 물 추출물보다 에탄올 추출물이 항천식 효과에 있어서 더 강한 영향력을 끼칠 것이라고 사료된다.
이상과 같이 확립된 소청룡탕의 물과 에탄올 추출물을 HPLC-PDA를 이용하여 동시분석을 실시하고 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 schizandrin 등 8종 성분에 대한 함량을 분석하였다. 함량 분석 결과 물 추출물에서 glycyrrhizin은 검출이 되지 않았으며 그 외 7종의 성분은 0.03-2.07 mg/g으로 나타났으며, 에탄올 추출물에서 8종 성분이 모두 0.05-3.18 mg/g으로 각각 나타났다(Table 3).

후속연구

소청룡탕을 구성하는 마황¹²⁾, 작약¹³⁾, 세신 추출물은 항염증의 효과¹⁴⁾가 있다고 보고되었고, 오미자와¹⁵⁾ 건강은 항산화의 효과¹⁶⁾, 반하는 항천식의 효과¹⁷⁾, 감초는 항알러지의 효과¹⁸⁾ 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, 구성약재들의 주요성분인 Albiflorin과 paeoniflorin은 골수이상에 대한 치료 효과¹⁹⁾, liquiritin의 신경보호작용²⁰⁾, coumarin 의 항염증 효과²¹⁾, cinnamicacid²²⁾과 schizandrin의 항산화 작용²³⁾, cinnamaldehyde의 PGE₂ 생성 억제 효과²⁴⁾, glycyrrhizin의 면역조절작용²⁵⁾을 가진다는 보고를 통하여, 소청룡탕은 염증과 관련된 질환에서 이로운 효과를 가질 것이라고 기대했다. 하지만 소청룡탕 추출물과 이를 구성하는 약재 및 주요 성분에 대한 약리적 활성 효과에 대해서는 이미 보고 되어 있지만, 소청룡탕의 용매별 추출물에 따른 성분 함량 및 약리 효능을 비교한 연구는 발표된 바 없었다.
우리의 결과는 HaCaT 세포에서 소청룡탕의 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 TNF-α와 INF-γ의 병행 처리로 증가한 RANTES와 MDC의 증가한 발현을 억제시킴으로써 항아토피 작용이 있을 것으로 사료되었다. 또한, 에탄올 추출물은 물 추출물보다 MDC의 발현을 강하게 억제 하는 것으로 보아, 아토피성 피부염에 관련된 질병에서 더 뛰어난 효과를 보여줄 것이라고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	소청룡탕이란 무엇인가?	소청룡탕은 한국, 일본 및 중국에서 전통적으로 사용 되어온 한약처방으로써, 주로 호흡기계 질병인천식, 기관지염 및 알러지성 비염에 자주 사용되어져 왔다4). 마황(Epherdrae Herba), 작약(Paeoniae Radix), 오미자(Schisandrae Fructus), 반하(Pinelliae Tuber), 건강(Zingiberis Rhizoma), 계지(Cinnamomi Ramulus), 세신(Asari Radix et Rhizoma) 및 감초(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma) 8개의 약재로 구성되어 있으며, 이러한 탕제 및 각 약재에 대한 다양한 효능이 연구되고 있다.
	염증 반응의 궁극적인 목적은 무엇인가?	염증 반응은 외부 자극에 대한 생체 조직의 방어와 치유에 핵심적인 역할을 할 뿐만 아니라 많은 질병의 병리 발상에 관련되어 있는 중요한 과정이다. 염증 반응의 궁극적인 목적은 손상 원일을 제거하여 조직 손상을 국소화 시킴으로써 본래의 상태로 수복하거나 재생하려는 기전이다26). 하지만 염증반응이 만성으로 발전하게 되면 반대로 조직의 손상을 촉진하여 인체의 여러 장기에 해로운 영향을 주게 된다.
	소청룡탕을 구성하는 약재는 무엇인가?	소청룡탕은 한국, 일본 및 중국에서 전통적으로 사용 되어온 한약처방으로써, 주로 호흡기계 질병인천식, 기관지염 및 알러지성 비염에 자주 사용되어져 왔다4). 마황(Epherdrae Herba), 작약(Paeoniae Radix), 오미자(Schisandrae Fructus), 반하(Pinelliae Tuber), 건강(Zingiberis Rhizoma), 계지(Cinnamomi Ramulus), 세신(Asari Radix et Rhizoma) 및 감초(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma) 8개의 약재로 구성되어 있으며, 이러한 탕제 및 각 약재에 대한 다양한 효능이 연구되고 있다. 소청룡탕은 알러지성 천식 동물모델에 있어 T helper cell type 면역반응을 억제하여 기도염증 및 기도과민성을 억제한다고 보고되었으며5), oleic acid를 이용한 폐 손상 모델에 있어서도 염증반응을 완화시킨다고 보고되 었다6).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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