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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 전남 여수시 돌산에서 유기농으로 재배되고 있는 천년초의 부위 중에서도 사계절 내내 이용 가능하며, 다른 부위보다 비중이 가장 많은 부분을 차지하는 줄기(Opuntia humifusa stem)를 시료로 하여 타 연구자들이 이용한 미생물 종류, 항산화 측정방법, 항암 세포주를 달리하여 천년초의 생리활성효과를 각각 검토하여 보고하고자 하였다.
- 본 연구는 천년초 줄기를 이용하여 항균, 항산화, 항암 등천년초의 생리활성 효과를 연구하였으며 그 결과는 다음과 같다. 천년초 줄기의 추출물중 gram 양성균인 4가지 균주(Rhodococcus equi, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus)에서 항균 효과가 나타난 것은 메탄올과 핵산층이었으며, 4가지 균주 중 Bacillus cereus를 제외한 3종에 대해서는 우수한 항균효과를 나타냈다.
가설 설정
- 2)The different small letters mean significant difference among the different concentrations (column) in the same solvent (p<0.05).
제안 방법
- 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 200 μL를 첨가하여 천천히 녹인 후 multi-detection microplate를 이용하여 50 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- HepG2, MCF-7, HT29와 B16F10의 각 세포주는 37℃, 5% CO2조건하에서 배양하였고, 주 2～3회 정도 배지를 교환하고 세포배양용 petri dish에 각 세포주가 5×104 cells/mL 정도 증식되면 phosphate buffered saline(PBS)로 2번 세척한후 trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA, Gibco, Grand Island, NY, USA)를 2 mL씩 처리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배지로 세포가 골고루 분산되도록 희석하여 세포배양용 petri dish에 10 mL씩 분할하여 주입하고 주 2회 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
- 추출한 시료를 여과한 후 rotary evaporator로 감압 농축시켜 methanol 추출물(OHM)을 얻었다. OHM에 DCM과 물을 1:1로 첨가하여 DCM층과 수층을 얻었으며 DCM층은 헥산과 85% methanol을 첨가하여 hexane(OHMH)층과 methanol(OHMM)층으로 분획하였으며, 수층은 butanol을 첨가하여 다시 butanol(OHMB)층과 수층(OHMA)을 얻었다. Hexane, methanol 및 butanol 층은 감압 농축하였고, 수층은 동결건조 후 본 실험에 사용하였다.
- 시료 무첨가구에는 시료 대신 시료를 녹인 용매 50 μL를 첨가하여 시료 첨가구에 대한 흡광도의 감소 비율로 나타내었다. Positive control로 vitamin C(ascorbic acid, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 동일한 방법으로 실험하여 흡광도 감소를 측정하였다.
- 각 시료 50 μL에 1.5×10-4 M DPPH(2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액 200 μL를 가하고, vortex mixer로 10초간 진탕한 후 실온에서 30분 동안 방치하여 520 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다.
- 항균용 평판 배지를 멸균후 각 20 mL씩 petri dish에 분주하여 응고시킨 후 배양한 시험 균을 무균적으로 첨가하여 배지 위에 다시 100～200μL씩 분주하여 평판배지를 만들었다. 각 용매 분획물의 농도를 2, 5, 10, 20 mg/mL를 가하여 멸균된 disc(직경 6 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)에 흡수, 건조시켜 균주가 도말된 plate 표면에 올려놓은 후 37℃ incubator에서 24～48시간 배양하여 paper disc 주위에 생성된 clear zone의 직경(mm)을 5회 반복 측정하여 각각 평균치를 구하였다.
- 그리고 10μM ONOO-를 첨가한 후 microplate multi-detection reader(Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA)를 사용하여 형광광도(fluorescence)를 측정하였다.
- 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 200 μL를 첨가하여 천천히 녹인 후 multi-detection microplate를 이용하여 50 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 이를 위해 각 세포주를 1×104 cells/well의 농도로 맞추고 96 well에 각각 200 μL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl-sulfoxide(DMSO)에 녹여서 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 첨가하였다.
- 전자공여능은 아래의 방법에 의하여 시료의 DPPH의 환원력을 측정하였다. 각 시료 50 μL에 1.
- 천년초 줄기를 methanol로 추출하여 hexane층, methanol층, butanol층 및 수층의 용매별로 분획하였다. 천년초 줄기 583 g에서 hexane층은 2.
- 천년초 줄기를 동결건조 한 후 상온에서 methanol을 사용하여 2회 추출하고, 다시 methanol과 dichloromethane(DCM)을 1:1로 섞은 용액으로 2회 추출하였다. 추출한 시료를 여과한 후 rotary evaporator로 감압 농축시켜 methanol 추출물(OHM)을 얻었다. OHM에 DCM과 물을 1:1로 첨가하여 DCM층과 수층을 얻었으며 DCM층은 헥산과 85% methanol을 첨가하여 hexane(OHMH)층과 methanol(OHMM)층으로 분획하였으며, 수층은 butanol을 첨가하여 다시 butanol(OHMB)층과 수층(OHMA)을 얻었다.
- 항균용 평판 배지를 멸균후 각 20 mL씩 petri dish에 분주하여 응고시킨 후 배양한 시험 균을 무균적으로 첨가하여 배지 위에 다시 100～200μL씩 분주하여 평판배지를 만들었다.
대상 데이터
- Peroxynitrite 소거효과 실험에 사용된 시약인 dihydrorhodamine 123(DHR 123)과 peroxynitrite는 각각 molecular probes(Eugene, OR, USA)와 Cayman Chemical Co.(Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입한 것을 사용하였다.
- OHM에 DCM과 물을 1:1로 첨가하여 DCM층과 수층을 얻었으며 DCM층은 헥산과 85% methanol을 첨가하여 hexane(OHMH)층과 methanol(OHMM)층으로 분획하였으며, 수층은 butanol을 첨가하여 다시 butanol(OHMB)층과 수층(OHMA)을 얻었다. Hexane, methanol 및 butanol 층은 감압 농축하였고, 수층은 동결건조 후 본 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 암 세포주는 인체 간암세포주인 HepG2(human hepato-cellular carcinoma), 유방암세포주인 MCF7(human breast adenocarcinoma pleural effusion)과 대장암세포주인 HT29(human colon adenocarcinoma)와 마우스 유래의 피부암세포주인 B16-F10(mouse melanoma)을 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하여 배양시킨 후 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 천년초(Opuntia humifusa, OH) 줄기는 2008년 6월 전남 여수시 돌산읍 라파엘 농장에서 구입하여 동결건조 하였다. 이 시료를 추출 · 분획하여 항균, 항산화 및 암세포 성장억제 효과의 측정에 사용하였다.
- 항균 활성 검색에 사용된 균은 모두 gram 양성인 4가지 균주 즉 Rhodococcus equi, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens(welchii균), Bacillus cereus를 이용하였으며, 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배지는 nutrient agar, beef extract, peptone을 사용하였다. 항균실험에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받아 활성화시켜 사용하였다.
- 항균 활성 검색에 사용된 균은 모두 gram 양성인 4가지 균주 즉 Rhodococcus equi, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens(welchii균), Bacillus cereus를 이용하였으며, 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배지는 nutrient agar, beef extract, peptone을 사용하였다. 항균실험에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받아 활성화시켜 사용하였다. 각 용매 분획물의 항균효과는 paper disc method(10)로 다음과 같이 실험하였다.
데이터처리
- 그리고 10μM ONOO-를 첨가한 후 microplate multi-detection reader(Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA)를 사용하여 형광광도(fluorescence)를 측정하였다. ONOO-의 바탕용액은 0.3 N NaOH를 사용하였고 평균한 값으로 소거율을 계산하였다. Peroxynitrite 소거효과 실험에 사용된 시약인 dihydrorhodamine 123(DHR 123)과 peroxynitrite는 각각 molecular probes(Eugene, OR, USA)와 Cayman Chemical Co.
- 본 실험의 연구에서 항균 실험결과는 7～10회 반복 측정하였고, 항산화 및 항암효과에 대한 실험결과는 3회 반복 측정 후 IBM SPSS statistics(version 19, Chicago, IL, USA)를 사용하여 측정한 결과의 평균과 표준편차를 나타내었고, 시료의 항산화활성은 농도별, 용매별로 ANOVA와 Duncan's multiple range test로 검정하였으며, 항암효과는 시료농도 100 μg/mL에 대해서만 용매별 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 96 well plate에 시료를 농도별로 취하고 Crow의 방법(11)에 의해 ONOO- 제거능을 측정하였다. 5 mM DTPA(diethylenetriaminepenta acetic acid)와 5 μM DHR123을 함유하는 sodium phosphate buffer(pH 7.
- 항균실험에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받아 활성화시켜 사용하였다. 각 용매 분획물의 항균효과는 paper disc method(10)로 다음과 같이 실험하였다. 항균용 평판 배지를 멸균후 각 20 mL씩 petri dish에 분주하여 응고시킨 후 배양한 시험 균을 무균적으로 첨가하여 배지 위에 다시 100～200μL씩 분주하여 평판배지를 만들었다.
- 천년초 분획물의 암세포 증식 억제 효과는 MTT(3-[4,5- dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-yl tetrazolium bromide) assay를 사용하여 행하였다. MTT assay는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서 황색수용물질인 MTT가 미토콘드리아내의 탈수소효소 작용에 의하여 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용하였다.
성능/효과
- (A)는 피부암세포인 B16F10에 대한 결과로 천년초 줄기의 수충 분획물의 10～100 μg/mL의 농도에서 15～37%, 부탄올은 13～33%로 억제 효과가 낮게 나타난 반면 메탄올층은 60～92%, 핵산층은 24～91%로 높게 나타나 수층과 부탄올층에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높게 나타난 것을 알 수 있었다.
- (B)는 천년초 줄기의 각 용매별 분획물의 간암세포인 HepG2에 대한 암세포 증식 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 것으로 추출물 10～100 μg/mL의 농도에서 수층은 14～24%, 부탄올층은 9～32%, 메탄올층은 16～90%, 핵산층은 22～71%로 나타나 100 μg/mL의 농도를 기준으로 메탄올층이 유의적으로(p수층>부탄올층 순으로 나타났다.
- Staphylococcus aureus균은 gram 양성, 독소형 식중독 유발균으로 메탄올과 핵산층의 모든 농도에서 항균효과가 나타났으며, 농도 의존적으로 항균효과가 높게 나타났음을 알 수 있었다. Gram 양성, 편성혐기성인 간균인 Clostridium perfringens는 메탄올층에서는 2 mg/mL 농도를 제외하고 모든 농도에서 항균효과가 나타났으며, 핵산층에서는 낮은 농도에서도 항균효과가 아주 높게 나타났다. 그람 양성, 독소형 식중독 유발균인 Bacillus cereus는 메탄올층에서도 20 mg/mL의 농도에서만 항균효과가 있었고, 핵산층에서는 2 mg/mL 농도를 제외하고는 항균효과가 있음을 알 수 있었다.
- 사용한 각 균주에 대해 용매별 천년초 줄기 분획물의 항균 효과 결과는 Table 2와 같다. Rhodococcus equi는 그람 양성, 호기성인 구균이며 주로 건조하고 먼지가 많은 흙에 존재하고, 주로 참기름, 들기름, 콩기름 등의 유지류 부패 원인균으로 알려져 있으며, 메탄올과 핵산층에서 2 mg/mL 농도를 제외하고는 모든 농도에서 항균효과가 높게 나타났다. Staphylococcus aureus균은 gram 양성, 독소형 식중독 유발균으로 메탄올과 핵산층의 모든 농도에서 항균효과가 나타났으며, 농도 의존적으로 항균효과가 높게 나타났음을 알 수 있었다.
- Rhodococcus equi는 그람 양성, 호기성인 구균이며 주로 건조하고 먼지가 많은 흙에 존재하고, 주로 참기름, 들기름, 콩기름 등의 유지류 부패 원인균으로 알려져 있으며, 메탄올과 핵산층에서 2 mg/mL 농도를 제외하고는 모든 농도에서 항균효과가 높게 나타났다. Staphylococcus aureus균은 gram 양성, 독소형 식중독 유발균으로 메탄올과 핵산층의 모든 농도에서 항균효과가 나타났으며, 농도 의존적으로 항균효과가 높게 나타났음을 알 수 있었다. Gram 양성, 편성혐기성인 간균인 Clostridium perfringens는 메탄올층에서는 2 mg/mL 농도를 제외하고 모든 농도에서 항균효과가 나타났으며, 핵산층에서는 낮은 농도에서도 항균효과가 아주 높게 나타났다.
- Gram 양성, 편성혐기성인 간균인 Clostridium perfringens는 메탄올층에서는 2 mg/mL 농도를 제외하고 모든 농도에서 항균효과가 나타났으며, 핵산층에서는 낮은 농도에서도 항균효과가 아주 높게 나타났다. 그람 양성, 독소형 식중독 유발균인 Bacillus cereus는 메탄올층에서도 20 mg/mL의 농도에서만 항균효과가 있었고, 핵산층에서는 2 mg/mL 농도를 제외하고는 항균효과가 있음을 알 수 있었다. 천년초 줄기의 추출물중 4가지 균주에서 항균 효과가 나타난 것은 메탄올과 핵산층이었으며, 4가지 균주 중 Bacillus cereus를 제외한 3종에 대해서는 우수한 항균효과를 나타냈다.
- 유방암세포인 MCF-7은 메탄올층>핵산층>수층>부탄올층 순으로 효과가 높게 나타났다.
- 천년초 줄기 추출물의 각 용매별 DPPH 유리기 소거능은 농도가 증가함에 따라 소거능도 유의적으로(p메탄올>수층> 핵산층 순으로 높게 나타났다.
- 천년초 줄기 추출물의 각 용매별 DPPH 유리기 소거능은 농도가 증가함에 따라 소거능도 유의적으로(p수층>핵산층 순으로 나타났다.
- 천년초 줄기의 peroxynitrite(ONOO¯) 제거능 측정결과 핵산층을 제외한 메탄올층, 부탄올층, 수층의 항산화 활성은 천년초 줄기 추출물의 농도가 증가할수록 항산화 효과가 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났다.
- 천년초 줄기의 암세포 증식 억제 효과에서 피부암 세포의 경우 50～100 μg/mL의 농도에서 메탄올층과 핵산층이 수층과 부탄올층에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났다.
- 그람 양성, 독소형 식중독 유발균인 Bacillus cereus는 메탄올층에서도 20 mg/mL의 농도에서만 항균효과가 있었고, 핵산층에서는 2 mg/mL 농도를 제외하고는 항균효과가 있음을 알 수 있었다. 천년초 줄기의 추출물중 4가지 균주에서 항균 효과가 나타난 것은 메탄올과 핵산층이었으며, 4가지 균주 중 Bacillus cereus를 제외한 3종에 대해서는 우수한 항균효과를 나타냈다.
- 본 연구는 천년초 줄기를 이용하여 항균, 항산화, 항암 등천년초의 생리활성 효과를 연구하였으며 그 결과는 다음과 같다. 천년초 줄기의 추출물중 gram 양성균인 4가지 균주(Rhodococcus equi, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus)에서 항균 효과가 나타난 것은 메탄올과 핵산층이었으며, 4가지 균주 중 Bacillus cereus를 제외한 3종에 대해서는 우수한 항균효과를 나타냈다. 천년초 줄기의 peroxynitrite(ONOO¯) 제거능 측정결과 핵산층을 제외한 메탄올층, 부탄올층, 수층의 항산화 활성은 천년초 줄기 추출물의 농도가 증가할수록 항산화 효과가 유의적으로(p<0.
- 70%)을 얻었다(Table 1). 천년초의 용매별 분획물의 수율은 용매의 극성이 높을수록 분획물의 수율이 높다는 것을 알 수 있었다.
- 핵산층을 제외한 메탄올층, 부탄올층, 수층의 항산화 활성은 천년초 줄기 추출물의 농도가 증가할수록 항산화 효과가 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났음을 알 수 있었다.
후속연구
- 유방암세포인 MCF-7은 메탄올층>핵산층>수층>부탄올층 순으로 효과가 높게 나타났다. 이와 같은 결과로 볼 때 천년초 줄기의 항균, 항산화, 항암 효과가 높게 나타나 줄기를 활용한 항균제품이나 여러 가지 가공제품을 개발하는데 기초 자료로 활용할 수 있다.
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