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문제 정의
- 따라서 본 연구는 허브(Herb) feverfew 등 4종의 부위별 메탄올 추출물에 대한 항산화, 항암 및 Tyrosinase 저해활성을 검정하여 생리활성 및 약리효과에 대한 기초자료로 사용하고자 한다.
- 본 연구는 4종의 허브 식물의 부위별 MeOH 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거능, 세포독성 그리고 tyrosinase 저해활성을 검정하기 위해 시행되었다. yarrow의 지상부와 뿌리 추출물에서 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량이 가장 높았을 뿐만 아니라 yarrow의 지상부에서는 높은 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다.
제안 방법
- 37°C, 5% CO2 incubator에서 2−3일 간격으로 계대배양하면서 사용하였다.
- Tyrosinase 저해활성 검정. 시료 추출액의 미백활성 검정을 위해 96 well plate에 시료 추출액 20 µL, 0.
- 추출물을 세포배양액 200 µL에 각각 2, 10, 50, 200 µg/mL씩을 각각 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 세포의 독성은 Cell Counting Kit-8TM(CCK-8, Dojindo, Japan)시약을 이용하여 분석하였다. 각 배양액에 CCK-8 용액 10 µL 씩을 넣은 후 1−4시간 반응하고, 수용액에 녹아있는 tetrazolium salt(WST-8,[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt])의 양을 microplate reader기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 항산화활성 검정. 시료추출액의 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)의 발색정도로 측정하였다. 지질과산화의 연쇄반응에 관여하는 산화성 free radical을 소거함으로써 항산화제로 작용하는 물질은 free radical인 DPPH를 hydrazine 형태로 환원시키는 능력을 조사하여 검색하였다.
- 시료추출액의 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)의 발색정도로 측정하였다. 지질과산화의 연쇄반응에 관여하는 산화성 free radical을 소거함으로써 항산화제로 작용하는 물질은 free radical인 DPPH를 hydrazine 형태로 환원시키는 능력을 조사하여 검색하였다. DPPH는 비교적 안정한 radical로 보라색을 띠는데, 항산화 활성을 갖는 성분을 만나면 색이 소실된다.
- 추출물을 세포배양액 200 µL에 각각 2, 10, 50, 200 µg/mL씩을 각각 처리한 후 16시간 동안 배양하였다.
- 항암 활성. 허브식물 4종의 각 부위로부터 추출한 9점의 허브 메탄올 추출물을 암세포 및 정상세포에 적용하여 항암 활성을 확인하였다. 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 대해서 항암 활성을 IC50 값으로 확인한 결과, 119.
- 허브의 메탄올 추출물이 세포성장의 억제효과가 있는지의 여부를 확인하기 위해 세포들을 96 well plate에 104−105 cells/well의 농도로 접종하고 37°C, 5% CO2가 공급되는 항온 세포배양기에서 8시간 이상 전 배양하였다.
대상 데이터
- 각 배양액에 CCK-8 용액 10 µL 씩을 넣은 후 1−4시간 반응하고, 수용액에 녹아있는 tetrazolium salt(WST-8,[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt])의 양을 microplate reader기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 doxorubicin (Sigma Co.)을 사용하였다.
- microplate reader기를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 메탄올과 Arbutin (Sigma Co.)을 사용하였다.
- )용액 150 µL를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 30분간 반응시키고 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 메탄올과 ascorbic acid (Sigma Co.)를 사용하였다.
- 암세포주는 인체 자궁암 세포인 HeLa, 인체 간암세포인 SK-Hep-1, 인체 구강암세포인 YD-15이며, 한국세포주 은행에서 2008년 8월에 분양 받아 사용하였다. 세포배양액으로는 10% fetal bovine serum (FBS)가 첨가된 DMEM배지를 사용하였다. 37°C, 5% CO2 incubator에서 2−3일 간격으로 계대배양하면서 사용하였다.
- 항암 활성 검정. 암세포주는 인체 자궁암 세포인 HeLa, 인체 간암세포인 SK-Hep-1, 인체 구강암세포인 YD-15이며, 한국세포주 은행에서 2008년 8월에 분양 받아 사용하였다. 세포배양액으로는 10% fetal bovine serum (FBS)가 첨가된 DMEM배지를 사용하였다.
- 37°C, 5% CO2 incubator에서 2−3일 간격으로 계대배양하면서 사용하였다. 치은섬유아세포(human gingival fibroblast, HGF)는 단국대학교 치과대학 구강생화학 실험실에서 분양 받아 사용하였으며, 암세포 실험에 대한 대조군으로 이용하였다. 허브의 메탄올 추출물이 세포성장의 억제효과가 있는지의 여부를 확인하기 위해 세포들을 96 well plate에 104−105 cells/well의 농도로 접종하고 37°C, 5% CO2가 공급되는 항온 세포배양기에서 8시간 이상 전 배양하였다.
- 연구 재료 및 시료 전처리. 허브식물 Feverfew, Yarrow, Mallow, Chamomile은 2009년 5월 1일 단국대학교 실습포장에서 파종하여 2009년 12월에 수확하였다. 꽃, 지상부, 뿌리 등 부위별로 동결건조 후 분쇄기로 곱게 갈아 2g으로 정량 한 후 80% MeOH 20 mL을 넣어 40°C sonicator를 이용하여 30분씩 3반복 추출 하였으며, 감압농축하여 MeOH로 희석하여 사용하였다.
이론/모형
- 총 폴리페놀함량(Total polyphenol contents) 측정. 시료 추출액의 총 폴리페놀 화합물의 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdate와 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 Folin-Denis법으로 측정하였다(Shen 등, 2009). 96 well plate의 각 well에 50 µL시료 추출액과 1 M Folin-ciocalteau phenol reagent (Sigma Co.
성능/효과
- Chamomile (root) 추출물은 인간 자궁경부암 세포에서는 2499.35±0.75 µg/mL의 다소 낮은 항암 활성을 보였으나 인간 간암 세포(244.79±0.42 µg/mL)와 인간 구강암 세포(777.43±0.57 µg/mL)에서는 자궁경부암 세포에서보다 비교적 높은 항암활성을 확인하였는데, 이러한 실험결과에 의해 같은 추출물이더라도 암세포의 종류에 따라 활성이 다르게 나타나며 동일 식물에서도 부위별 추출물에 따라 활성이 다르다는 것을 알 수 있었다.
- DPPH free radical 소거 활성을 IC50 값으로 확인한 결과 45.81–895.37 µg/mL의 넓은 범위를 보였으며, Yarrow (whole) (45.81 µg/mL), Feverfew(root) (48.32 µg/mL), Chamomile (flower) (53.81 µg/mL) 추출물에서는 대조구인 Ascorbic acid (66.49 µg/mL)보다 높은 항산화 활성을 보였다.
- 이처럼 같은 구강암 세포 주에 대해서 비슷한 항암활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. Feverfew와 Yarrow의 모든 부위별 추출물은 항암 활성을 검정한 본 실험에 사용된 모든 암세포에서 높은 항암 활성을 확인하였다. 천연허브 80% MeOH 추출물에 대한 전립선 암세포(PC-3)의 세포 성장 억제 효과를 실험한 결과, Rosemary 추출물(1600 µg/mL)에서 50% 이하의 세포 생존율을 보였으며, Lemon vervena, Chamomile, Rooibos, Thyme 추출물에서도 대조군에 비해 유의적인 세포 성장 억제효과가 보고된 바 있다(Jang, 2006), 또한 KB-3-1, Hepa-1c1c7과 같은 세포 주에 Eucalyptus, Mate, Peppermint, Thyme 추출물을 1000 µg/mL 의 농도로 투여하였을 때 50% 이상의 세포 성장 억제율을 보인다는 연구 결과도 보고된 바 있다(Chung과 Kim, 2000).
- HeLa (uterus), SK-Hep-1 (liver), YD-15 (oral) 세포주를 이용하여 세포독성을 확인한 결과, feverfew의 지상부에서 가장 높은 세포독성을 보였으며 102.58−138.68 µg/mL 의 IC50값을 확인하였다.
- Yarrow의 whole (294.78±3.08 mg GAE/g) 추출물에서 가장 많은 폴리페놀 함량을 확인 할 수 있었으며, Yarrow의 root 추출물과 Feverfew의 부위별 추출물에서도 비교적 많은 폴리페놀 함량을 확인 할 수 있었다.
- 57 µg/mL)에서는 자궁경부암 세포에서보다 비교적 높은 항암활성을 확인하였는데, 이러한 실험결과에 의해 같은 추출물이더라도 암세포의 종류에 따라 활성이 다르게 나타나며 동일 식물에서도 부위별 추출물에 따라 활성이 다르다는 것을 알 수 있었다. Yarrow의 whole, root 추출물과 Feverfew의 root 추출물에서는 암세포에 대한 세포독성이 비교적 높으며 치은섬유아세포에서도 세포독성을 가진 반면, Feverfew의 whole 추출물에서는 치은섬유아세포에서의 독성은 거의 없지만, 암세포에서는 비교적 강한 독성을 가진 것을 확인하였다. 천연추출물이 정상세포에는 영향을 주지 않고, 암세포만을 특이적으로 사멸한다는 점은 천연항암제개발의 효율적인 측면에서 중요한 의미가 있다고 사료된다.
- 본 연구는 4종의 허브 식물의 부위별 MeOH 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거능, 세포독성 그리고 tyrosinase 저해활성을 검정하기 위해 시행되었다. yarrow의 지상부와 뿌리 추출물에서 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량이 가장 높았을 뿐만 아니라 yarrow의 지상부에서는 높은 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다. HeLa (uterus), SK-Hep-1 (liver), YD-15 (oral) 세포주를 이용하여 세포독성을 확인한 결과, feverfew의 지상부에서 가장 높은 세포독성을 보였으며 102.
- 77 µg/mL로서 가장 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다. 또한, Chamomile (flower), Feverfew (root, whole)순으로 높은 저해활성을 확인하였다. 자외선에 대한 방어 작용으로 합성되는 멜라닌(melanin)은 과도하게 합성이 되면 기미, 주근깨, 검버섯을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 관여하는 것으로 알려져 왔다(Iwata 등, 1990; Yang 등, 1999; Kwak 등, 2001).
- 68 µg/mL 의 IC50값을 확인하였다. 또한, mallow의 뿌리 추출물(71.24 µg/mL)에서는 대조구로 사용한 arbutin (69.56 µg/mL)과 비교하여 tyrosinase 저해 활성에 효능이 있는 것으로 판단되었다.
- 또한, 총 플라보노이드 함량은 1.25−16.65 mg CE/g의 범위를 보였고, Yarrow의 root (16.65±0.53 mg CE/g) 추출물에서 가장 많은 플라보노이드 함량을 확인하였다.
- 위와 같이 허브 부위별 메탄올 추출물의 항산화, 항암 및 tyrosinase 저해활성을 종합 비교해 보았을 때, Feverfew (whole, root)와 Yarrow (whole, root)의 추출물은 모두 비교적 높은 활성을 나타내었다. 앞으로 이들 식물들에 대해 다양한 추출조건에 따른 최적 추출효율을 검토하고, 앞으로의 추가적인 생리활성 검정과 해당물질의 대한 다양한 분석 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 4%의 높은 소거능 효과가 보고된 바 있으며(Choi 등, 2010), 천연허브 80% MeOH 추출물의 DPPH 자유기 소거활성 및 ABTS 자유기 소거활성 측정 결과, lemon vervena, chamomile, rosemary, dandelion, rose hip, green tea 등의 추출물에서 70% 이상의 높은 자유기 소거활성을 나타낸다고 보고하였다(Jang, 2006). 이들의 연구 결과와 비교했을 때 허브 식물이 천연 항산화제 소재로 충분히 활용할 만한 가치를 지닌 기능성 식물임을 확인하였다.
- 49 µg/mL)보다 높은 항산화 활성을 보였다. 이처럼 항산화 활성이 높은 추출물은 총폴리페놀과 플라보노이드의 함량도 높은 것을 확인 할 수 있었으며 폴리페놀과 플라보노이드는 항산화 활성과 연관성이 있는 것으로 사료된다.
- 인간 간암세포인 SK-Hep1에 대한 항암활성 검정에서도 Feverfew의 whole (102.58±1.06 µg/mL) 부위에서 가장 높은 활성이 나타났으며, Chamomile의 Flower (112.45±1.14 µg/mL), Yarrow의 whole (126.28±0.46 µg/mL)순으로 항암 효과를 확인할 수 있었다.
- 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 대해서 항암 활성을 IC50 값으로 확인한 결과, 119.48−2499.35 µg/mL 의 범위를 보였으며, Feverfew의 whole (119.48±1.22 µg/mL) 부위에서 가장 높은 활성을 보였다.
- 53 mg CE/g) 추출물에서 가장 많은 플라보노이드 함량을 확인하였다. 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 Yarrow와 Feverfew의 부위별 추출물에서 가장 많은 것을 확인 할 수 있었으며, 다른 추출물 역시 플라보노이드의 함량이 폴리페놀 함량과 비슷한 순위로 나타난 것을 확인 확인하였다. Table 1과같이 1g의 건조 허브를 기준으로 폴리페놀 함량이 플라보노이드의 함량보다 높은 경향을 확인 하였는데, 이는 플라보노이드 외의 다른 페놀성 화합물을 많이 함유하고 있기 때문으로 사료된다(Kim 등, 2004; Jang, 2006).
- 항산화활성과 인간 간암 세포인 SK-Hep-1간에도 유의한 정의 상관관계(r=0.783**)를 보였으며 tyrosinase 저해활성과 인간 구강암 세포인 YD-15에서도 유의한 정의 상관관계(r=0.723*) (p <0.05)를 보임을 확인하였다(Table 4).
- 허브 메탄올 추출물 9점에 대하여 멜라닌 합성 경로에서의 초기 속도 결정단계에 관여하는 효소인 tyrosinase 저해 활성 검정을 IC50 값으로 확인한 결과 71.24–286.52 µg/mL의 농도 범위를 보였으며 Mallow의 root 부위로부터 얻은 추출물이 대조구인 Arbutin (69.56±0.15 µg/mL)과 비슷한 농도인 71.24±0.77 µg/mL로서 가장 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다.
- 허브식물 4종의 80% 메탄올 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량을 검정한 결과, 43.60−294.78 mg GAE/g의 범위를 보였다.
- 허브식물 4종의 부위별 메탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량의 항산화 활성과의 상관관계를 보면, 항산화 활성은 총 폴리페놀 함량(r= −0.682*) (p<0.05)과 플라보노이드 함량(−0.691*) (p <0.05)간에는 유의한 부의 상관관계를 나타냈으며, 폴리페놀과 플라보노이드 함량간 상관관계 결과 r=0.979** (p <0.01)로 높은 상관관계를 보여 항산화활성이 높은 식물은 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높은 것으로 확인되었다.
후속연구
- 위와 같이 허브 부위별 메탄올 추출물의 항산화, 항암 및 tyrosinase 저해활성을 종합 비교해 보았을 때, Feverfew (whole, root)와 Yarrow (whole, root)의 추출물은 모두 비교적 높은 활성을 나타내었다. 앞으로 이들 식물들에 대해 다양한 추출조건에 따른 최적 추출효율을 검토하고, 앞으로의 추가적인 생리활성 검정과 해당물질의 대한 다양한 분석 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 자외선에 대한 방어 작용으로 합성되는 멜라닌(melanin)은 과도하게 합성이 되면 기미, 주근깨, 검버섯을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 관여하는 것으로 알려져 왔다(Iwata 등, 1990; Yang 등, 1999; Kwak 등, 2001). 허브 추출물에 대한 멜라닌 합성의 주 효소인 tyrosinase 저해활성검정은 미백제 개발을 위한 기초 자료로서 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
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