식품 중 P. mirifica 원료 함유여부에 대한 판별법 마련을 위하여 식물의 종 동정에 일반적으로 사용되는 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 second internal transcribed spacer (ITS2) 유전자부위를 선정하였다. 선정된 유전자부위를 증폭하기 위하여 일반 프라이머를 이용하였으며 각각 719 bp, 520 bp, 348 bp 및 507 bp의 PCR 산물을 확인하였다. 그리고 염기서열을 결정하고 유전자은행에 등록되어있는 염기서열과 유사성에 대한 분석한 결과 rbcL, rpoC1 및 psbA-trnH 부위는 상동성이 매우 높아 프라이머를 설계하기는 어려웠다. 그러나 ITS2의 경우 염기서열의 차이점이 있어 4종류의 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머를 이용하여 P. mirifica, P. lobata, B. superba에 대한 PCR을 실시한 결과 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R의 경우 P. lobata 와 B. superba에서 비 특이적 밴드가 없으며 P. mirifica에서 예상크기인 137 bp 및 216 bp를 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 P. mirifica을 판별할 수 있는 종 특이 프라이머는 식품가능원료 및 가공식품에 대한 적용할 수 있어 인터넷 쇼핑몰 등 시중에 불법적으로 유통되는 제품에 대한 안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
식품 중 P. mirifica 원료 함유여부에 대한 판별법 마련을 위하여 식물의 종 동정에 일반적으로 사용되는 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 second internal transcribed spacer (ITS2) 유전자부위를 선정하였다. 선정된 유전자부위를 증폭하기 위하여 일반 프라이머를 이용하였으며 각각 719 bp, 520 bp, 348 bp 및 507 bp의 PCR 산물을 확인하였다. 그리고 염기서열을 결정하고 유전자은행에 등록되어있는 염기서열과 유사성에 대한 분석한 결과 rbcL, rpoC1 및 psbA-trnH 부위는 상동성이 매우 높아 프라이머를 설계하기는 어려웠다. 그러나 ITS2의 경우 염기서열의 차이점이 있어 4종류의 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머를 이용하여 P. mirifica, P. lobata, B. superba에 대한 PCR을 실시한 결과 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R의 경우 P. lobata 와 B. superba에서 비 특이적 밴드가 없으며 P. mirifica에서 예상크기인 137 bp 및 216 bp를 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 P. mirifica을 판별할 수 있는 종 특이 프라이머는 식품가능원료 및 가공식품에 대한 적용할 수 있어 인터넷 쇼핑몰 등 시중에 불법적으로 유통되는 제품에 대한 안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
In this study, ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNApolymeraseC (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH), and second internal transcribed spacer (ITS2) as identification markers for discrimination of P. mirifica in foods were selected. To be primer design, we obtained 719 bp, 520 bp, 348 bp, a...
In this study, ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNApolymeraseC (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH), and second internal transcribed spacer (ITS2) as identification markers for discrimination of P. mirifica in foods were selected. To be primer design, we obtained 719 bp, 520 bp, 348 bp, and 507 bp amplicon using universal primers from selected regions of P. mirifica. The regions of rbcL, rpoC1, and psbA-trnH were not proper for design primers because of high homology about P. mirifica, P. lobata, and B. superba. But, we had designed 4 pairs of oligonucleotide primers from ITS2 gene. Predicted amplicon from P. mirifica were obtained 137 bp and 216 bp using finally designed primers SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R and SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R, respectively. The species-specific primers distinguished P. mirifica from related species were able to apply food materials and processed foods. The developed PCR method would be applicable to food safety management for illegally distributed products in markets and internet shopping malls.
In this study, ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNApolymeraseC (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH), and second internal transcribed spacer (ITS2) as identification markers for discrimination of P. mirifica in foods were selected. To be primer design, we obtained 719 bp, 520 bp, 348 bp, and 507 bp amplicon using universal primers from selected regions of P. mirifica. The regions of rbcL, rpoC1, and psbA-trnH were not proper for design primers because of high homology about P. mirifica, P. lobata, and B. superba. But, we had designed 4 pairs of oligonucleotide primers from ITS2 gene. Predicted amplicon from P. mirifica were obtained 137 bp and 216 bp using finally designed primers SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R and SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R, respectively. The species-specific primers distinguished P. mirifica from related species were able to apply food materials and processed foods. The developed PCR method would be applicable to food safety management for illegally distributed products in markets and internet shopping malls.
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문제 정의
또한 최근 약용식물을 대상으로 연구한 결과 핵 염색체에 위치한 second internal transcribed spacer (ITS2) 부위가 PCR을 통한 증폭률이 높아 유용하게 사용될 수 있다고 보고되었다19). 본 연구는 일반 프라이머를 사용하여 종 동정을 위한 유전자부위를 증폭하고 염기서열을 결정하였으며, 유전자 은행에 등록되어있는 염기서열과의 비교분석을 통하여 종 특이 프라이머를 설계하고 PCR 조건을 확립하고자 하였다.
제안 방법
DNeasy Plant mini kit를 사용하여 유전자를 추출하였다. 추출방법은 제조사에서 제공하는 추출법에 의거하여 추출하였으며, 단 최종 용출단계에서는 AE 완충용액 대신 멸균증류수를 사용하여 DNeasy Mini spin column으로부터 용출하였다.
PCR을 위한 반응액의 조성은 상기에 명시된 조건과 동일하며 P. mirifica 판별을 위한 종 특이 프라이머를 위한 PCR 반응조건은 95℃에서 5분 예비가열 후, 95℃ 30초 변성, 65℃ 30초 재결합, 72℃ 30초 중합반응 등의 과정을 30회 반복하고 마지막에 72℃에서 5분간 처리하였다.
PCR을 위한 반응액의 조성은 주형 DNA 50 ng, dNTPs 200 μM, MgCl2 2.5 mM, 프라이머 각 0.5 μM이 되게 혼합하였으며 최종 부피는 25 μL로 하였다.
1). 그리고 PCR 산물에 대하여는 염기서열을 결정하였으며 미국 국립보건원(NIH)에서 운영하는 유전자은행에 각각 등록하였다(ITS2 : GenBank accession No. JQ886463, rpoC1 : GenBank accession No. JQ886464).
5 μM이 되게 혼합하였으며 최종 부피는 25 μL로 하였다. 그리고 프라이머별로 PCR의 재결합 온도 및 시간을 변경하면서 증폭이 가장 잘 일어나는 조건을 선정하였다. 종 동정을 위하여 second internal transcribed spacer (ITS2), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL)의 유전자를 선정하였으며 각각 일반 프라이머(universal primer)인 S2F/S3R, 2 forward/4 reverse, fwd PA/rev TH 및 1F/724R 등 4종류의 프라이머를19) 사용하였다(Table 1).
mirifica의 종 특이 프라이머를 개발하기 위하여 유전자은행에 등록되어있는 염기서열을 이용하려고 하였으나 등록되어있는 데이터가 없었다. 따라서 식물의 종 동정에 일반적으로 이용되고 있는 유전자부위를 선정하여 염기서열을 결정하고 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 이용하여 Pueraria 등의 칡에 대하여 등록되어있는 염기서열과 비교하여 프라이머를 설계하였다. 대상 유전자는 기 발표된 논문15)에 기초하여 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 second internal transcribed spacer (ITS2) 유전자부위를 선정하였다.
JQ9886464). 상기 4종의 유전자에 대한 염기서열과 유전자정보은행 (www.ncbi.nlm.gov)에 등록되어있는 유사종과의 분석한 결과 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNA polymerase C (rpoC1), 및 intergenic spacer (psbA-trnH)는 염기서열에 대한 유사성이 매우 높아 프라이머를 설계하기 어려웠으나 second internal transcribed spacer (ITS2)의 경우 염기서열의 차이점이 있어 프라이머 설계가 가능하여총 4종류를 설계하였다. 대조군으로 사용된 P.
대상 유전자는 기 발표된 논문15)에 기초하여 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 second internal transcribed spacer (ITS2) 유전자부위를 선정하였다. 선정된 유전자부위를 증폭하기 위하여 일반 프라이머를 이용하였으며 각각 719 bp, 520 bp, 348 bp 및 507 bp의 예상되는 PCR 산물을 확인한후 염기서열을 결정하였으며, 일부 유전자에 대하여 유전자은행에 각각 등록하였다(ITS2 : GenBank accession No. JQ886463, rpoC1 : GenBank accession No. JQ9886464). 상기 4종의 유전자에 대한 염기서열과 유전자정보은행 (www.
유전자증폭(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 프라이머 및 Taq DNA polymerase는 바이오니아(Bioneer, 대한민국)에 의뢰하여 합성 또는 구매하였으며, 유전자증폭 산물에 대한 염기서열결정은 식품의약품안전평가원 (미생물과)에 의뢰하여 수행하였으며, PCR 장비는 GeneAmpTM PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA)을 사용하였다. 검체로부터 유전자 추출은 DNeasy Plant mini kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다.
mirifica의 종 특이 프라이머를 개발하기 위하여 칡에 대한 염기서열 정보가 필요하다. 이를 위하여 일반 프라이머를 이용하여 second internal transcribed spacer (ITS2), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL) 유전자를 대상으로 PCR을 실시하였다. PCR 결과 각 부위에 대하여 507 bp, 520 bp, 348 bp 및 719 bp의 증폭산물이 생성됨을 확인 하였다(Fig.
2 및 Table 3), 각각을 조합하여(SFI12-miri-5F/SFI12-miri-7R, SFI12-miri-5F/SFI12-miri-8R, SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R) 총 4종의 프라이머를 설계하였다. 이를 이용하여 P. mirifica, P. lobata, B. superba를 대상으로 PCR을 실시하였다. 그 결과 SFI12-miri-5F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-5F/SFI12- miri-8R의 경우 비 특이적 밴드가 약하게 생성되었으나, SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R의 경우에는 P.
superba와 비교분석한 결과 염기서열의 다양성이 확인되어 종 특이 프라이머 개발이 가능하였다. 제작한 프라이머는 정방향 2종류 및 역방향 2종류이며(Fig. 2 및 Table 3), 각각을 조합하여(SFI12-miri-5F/SFI12-miri-7R, SFI12-miri-5F/SFI12-miri-8R, SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R) 총 4종의 프라이머를 설계하였다. 이를 이용하여 P.
최종산물의 확인은 반응액 3 μl를 취하여 아가로즈 젤로 100V, 30분간 전기영동하고 EtBr로 염색(1 μg/ml)한 후 UV 투영기를 이용하여 확인하였다.
DNeasy Plant mini kit를 사용하여 유전자를 추출하였다. 추출방법은 제조사에서 제공하는 추출법에 의거하여 추출하였으며, 단 최종 용출단계에서는 AE 완충용액 대신 멸균증류수를 사용하여 DNeasy Mini spin column으로부터 용출하였다.
대상 데이터
0 프로그램을 이용하여 Pueraria 등의 칡에 대하여 등록되어있는 염기서열과 비교하여 프라이머를 설계하였다. 대상 유전자는 기 발표된 논문15)에 기초하여 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 second internal transcribed spacer (ITS2) 유전자부위를 선정하였다. 선정된 유전자부위를 증폭하기 위하여 일반 프라이머를 이용하였으며 각각 719 bp, 520 bp, 348 bp 및 507 bp의 예상되는 PCR 산물을 확인한후 염기서열을 결정하였으며, 일부 유전자에 대하여 유전자은행에 각각 등록하였다(ITS2 : GenBank accession No.
대상식품은 총 3종이며 P. mirifica 100%, 태국칡뿌리추출분말, Pueraria 뿌리 100% 로 표기되어 있었으며, 본 연구에서 개발된 P. mirifica 검출용 종 특이 프라이머 2종을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 결과 P.
그리고 Pueraria spp. 또는 P. mirifica가 함유되어 있다고 표시되어있는 제품 3종은 경인지방식품의약품안전청 (위해사범조사T/F팀)으로부터 제공받았다.
그리고 Pueraria spp. 또는 P. mirifica가 함유되어있다고 표시되어있는 제품 3종을 대상으로 하였다.
그리고 프라이머별로 PCR의 재결합 온도 및 시간을 변경하면서 증폭이 가장 잘 일어나는 조건을 선정하였다. 종 동정을 위하여 second internal transcribed spacer (ITS2), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL)의 유전자를 선정하였으며 각각 일반 프라이머(universal primer)인 S2F/S3R, 2 forward/4 reverse, fwd PA/rev TH 및 1F/724R 등 4종류의 프라이머를19) 사용하였다(Table 1). 최적의 반응조건은 Table 2에 명시하였다.
태국 칡인 P. mirifica에 대하여 태국 칡의 일종인 Butea superba 및 국내에 주로 자생하는 칡(P. lobata, wild type) 을 대조군으로 선정하였다. 그리고 Pueraria spp.
검체로부터 유전자 추출은 DNeasy Plant mini kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다. 표준시료인 P. mirifica 및 B. superba는 식품의약품안전평가원 (첨단분석팀)으로부터, 국내에서 자생하는 칡(P. lobata, wild type)은 국립생물자원관 (야생생물유전자원센터)에서 분양받았다. 그리고 Pueraria spp.
데이터처리
PCR 증폭산물에 대한 염기서열을 결정하였으며 그 결과에 대한 비교 및 분석은 BioEdit ver. 7.0.9.0을 이용하였다.
성능/효과
mirifica 검출용 종 특이 프라이머 2종을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 결과 P. mirifica 100%및 태국칡뿌리추출분말로 표기되어있는 제품에서는 SFI12- miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R 프라이머를 사용한 경우 각각 137 bp 및 216 bp의 PCR 산물이 확인되었다(Fig. 4). 그러나 Pueraria 뿌리 100%로 표기되어있는 제품에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다.
이를 위하여 일반 프라이머를 이용하여 second internal transcribed spacer (ITS2), RNA polymerase C (rpoC1), intergenic spacer (psbA-trnH) 및 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL) 유전자를 대상으로 PCR을 실시하였다. PCR 결과 각 부위에 대하여 507 bp, 520 bp, 348 bp 및 719 bp의 증폭산물이 생성됨을 확인 하였다(Fig. 1). 그리고 PCR 산물에 대하여는 염기서열을 결정하였으며 미국 국립보건원(NIH)에서 운영하는 유전자은행에 각각 등록하였다(ITS2 : GenBank accession No.
mirifica와 속(Genus)은 다르지만 rpoC1 등의 유전자 염기서열의 상동성이 매우 높은 것으로 확인 되어 산정하였다. PCR 실시 결과 SFI12- miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R의경우 P. lobata 와 B. superba에서 비 특이적 밴드가 없으며 P. mirifica에서 예상크기인 137 bp 및 216 bp를 확인할 수있었다. 그리고 가공식품을 대상으로 적용성을 확인한 결과 2제품에서는 확인이 되었으나 Pueraria root 100%라고 명시되어있는 제품에서는 특이밴드가 불검출되어 P.
superba를 대상으로 PCR을 실시하였다. 그 결과 SFI12-miri-5F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-5F/SFI12- miri-8R의 경우 비 특이적 밴드가 약하게 생성되었으나, SFI12-miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R의 경우에는 P. lobata 와 B. superba에서 비 특이적 밴드가 없으며 P. mirifica에서 예상 크기인 137 bp 및 216 bp 의 특이밴드가 명확하게 확인되었다(Fig. 3).
mirifica에서 예상크기인 137 bp 및 216 bp를 확인할 수있었다. 그리고 가공식품을 대상으로 적용성을 확인한 결과 2제품에서는 확인이 되었으나 Pueraria root 100%라고 명시되어있는 제품에서는 특이밴드가 불검출되어 P. mirifica 가 함유된 것처럼 소비자를 혼동하게하는 허위제품이 아닌가 추정된다.
gov)에 등록되어있는 유사종과의 분석한 결과 ribulose bisphosphate carboxylase (rbcL), RNA polymerase C (rpoC1), 및 intergenic spacer (psbA-trnH)는 염기서열에 대한 유사성이 매우 높아 프라이머를 설계하기 어려웠으나 second internal transcribed spacer (ITS2)의 경우 염기서열의 차이점이 있어 프라이머 설계가 가능하여총 4종류를 설계하였다. 대조군으로 사용된 P. lobata의 경우 국내에서 주로 자생하는 칡이며, B. superba는 태국칡의 일종으로 P. mirifica가 여성을 위한 칡이라면 B. superba은 남성을 위한 제품이라고 광고하고 있기 때문에 선정하였으며 또한, B. superba의 경우 P. mirifica와 속(Genus)은 다르지만 rpoC1 등의 유전자 염기서열의 상동성이 매우 높은 것으로 확인 되어 산정하였다. PCR 실시 결과 SFI12- miri-6F/SFI12-miri-7R 및 SFI12-miri-6F/SFI12-miri-8R의경우 P.
후속연구
따라서 본 연구에서 개발된 P. mirifica을 판별할 수 있는 종 특이 프라이머는 식품원료 및 가공식품에 대한 적용할 수 있어 인터넷 쇼핑몰 등 시중에 불법적으로 유통되는 제품에 대한 안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
칡의 효능은?
예로부터 칡은 한국, 중국 등에서 중요한 약용식물로 사용되어왔다. 칡의 효능으로는 해열, 발한 등의 감기약으로 사용하거나 편두통, 편도선염, 주독치료 등에 사용된다1). 칡의 성분에 대한 연구로는 칡 뿌리에 플라보노이드가 함유되어 있다고 보고되어 있으며2), 약리작용에 관한 연구에서는 항 바이러스, 항 혈액응고, 급성간염 억제, 혈압강화작용 등의 결과가 보고되어 있다3,4).
칡이란 무엇인가?
칡(Pueraria spp.)은 콩 과(Family)에 속하는 덩굴성 다년식물로서 Pueraria 속(Genus)에 8종이 분포(www.ncbi.nlm. gov/taxonomy)하며 한국, 중국, 극동 러시아, 일본 등을 포함한 극동아시아의 온대영역에 폭넓게 분포한다. 예로부터 칡은 한국, 중국 등에서 중요한 약용식물로 사용되어왔다.
피토에스트로젠의 부작용은?
일명 ‘태국칡’이라고 하는 Pueraria mirifica는 white kwao krua(또는 Thai kudzu)로 알려져 있 으며, 피토에스트로젠을 다량 함유하고 있다5). 일부 화장품 생산업자 및 약리기능 원료 공급업자는 식욕증진, 여성 가슴확대 등의 효능을 주장하고 있지만 과학적 근거는 확보되지 못하고 있는 실정이며 P. mirifica를 이용한 동물실험 결과 허용량 이상 섭취 시 백혈구 감소 및 자궁비대와 같은 부작용이 확인되었다7,8,9). 또한 수입된 제품을 섭취한 소비자 중 상당수가 하혈을 하거나 생리가 멎지 않는 부작용을 겪은 사례가 발견되기도 하였다8). 이로 인해 국내에서는 식품공전에 ‘식품에 사용할 수 없는 원료’ 목록으로 규정하고 있으며10) 시중에 불법으로 유통되는 P.
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