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문제 정의
- 그러나 괴각의 항불안 효과에 대해서는 아직까지 알려져 있지 않으며, 이에 본 연구에서는 괴각의 메탄올 추출물이 신경계질환 중에서 불안증에 미치는 효과를 elevated plus-maze, open field test, horizontal wire test 등 동물행동실험을 통하여 관찰하였고, 이러한 효과가 어떤 기전을 통하여 작용하는지를 확인하고자 하였다. 항불안 약물로 세인트존스 워트(St John's Wort)와 발레리안(Vallerian)가 사용되기 시작하면서 부작용이 보다 적은 천연물의 사용 및 개발에 대한 관심이 증가하고 있어 국내에서 오랫동안 사용되어 온 한약재 및 활성성분의 과학적 해석을 통한 한약제제 및 천연물 제제의 동등성 연구 기반의 구축에 본 연구의 필요성이 있다고 생각된다.
제안 방법
- 일반적으로 항불안 약물들은 졸음, 근육이완 등의 부작용을 야기하므로 괴각 추출물이 이러한 부작용이 발생하는지를 horizontal wire test를 통해 확인하였다(21). Horizontal wire test는 양쪽에 기둥을 설치하고 바닥으로부터 30 cm의 높이로 하여 직경 1 mm, 길이 40 cm의 wire를 수평으로 설치하여 측정하였다. 먼저 마우스의 앞발이 wire를 쥐게 한 다음, 꼬리를 아래쪽으로 향하여 놓은 후 한 쪽 뒷발이 wire를 쥐거나, 앞발이 10초 이상 wire에 매달려 있으면 통과로 인정하였다.
- Locomotor activity는 실험동물의 활동성을 측정하는 장치로 약물의 항불안 작용이 동물의 활동성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하는 실험방법이다. Locomotor activity는 자가 제조된 open field test용 box를 이용하여 측정하였다(20). Open field test용 box는 가로 25 cm, 세로 25 cm, 높이 30.
- Locomotor activity는 자가 제조된 open field test용 box를 이용하여 측정하였다(20). Open field test용 box는 가로 25 cm, 세로 25 cm, 높이 30.5 cm가 되도록 제조하고, 하나의 box에서 한 마리씩 측정하였다. 괴각 추출물은 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였으며 약물 투여는 실험 시작 1 시간 전에 종료되도록 하였다.
- 각 arm의 출입 횟수는 open arm 이나 closed arm의 교차점을 기준으로 할 때 어느 쪽으로나 네 발이 완전하게 진입되었을 때를 1회로 하고 open arm과 closed arm에 대하여 각각 측정하였다. 각 arm에 머문 시간의 측정은 각 arm에 진입된 후 머물러 있던 시간의 총합을 측정하였다. 각 실험이 끝난 후에는 전 실험동물의 흔적을 70 % EtOH로 세척하여 다음 실험에 영향을 주지 않도록 하였다.
- 실험결과는 EthoVision program (Noldus Information Technology, Wageningen, Netherlands)으로 마우스가 open arm과 closed arm에 머문 시간, 각 arm의 출입 횟수 및 총 이동거리 등을 5분 간 측정하여 항불안 효과를 측정하였다(17). 각 arm의 출입 횟수는 open arm 이나 closed arm의 교차점을 기준으로 할 때 어느 쪽으로나 네 발이 완전하게 진입되었을 때를 1회로 하고 open arm과 closed arm에 대하여 각각 측정하였다. 각 arm에 머문 시간의 측정은 각 arm에 진입된 후 머물러 있던 시간의 총합을 측정하였다.
- 괴각 추출물은 10% Tween 80 수용액으로 현탁시켜 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 실험 시작 1 시간 전에 경구 투여하였고, 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다. 양성대조군에는 생리식염수에 녹인 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분전에 복강 투여하였다.
- 수용체의 antagonist인 WAY-100635와 GABAA 수용체의 antagonist인 flumazenil을 사용하여 elevated plus-maze에서 측정하였다(18,19). 괴각 추출물은 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였으며 실험 시작 30분 전에 각각 WAY-100635 (0.3 mg/kg, ip) 또는 flumazenil (10 mg/kg, i.p.)을 병용 투여하였다. 대조군은 괴각 추출물 투여 군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다.
- 5 cm가 되도록 제조하고, 하나의 box에서 한 마리씩 측정하였다. 괴각 추출물은 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였으며 약물 투여는 실험 시작 1 시간 전에 종료되도록 하였다. 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다.
- 괴각 추출물의 항불안 효과의 작용 기전을 관찰하기 위해 5-HT1A 수용체의 antagonist인 WAY-100635와 GABAA 수용체의 antagonist인 flumazenil을 사용하여 elevated plus-maze에서 측정하였다(18,19). 괴각 추출물은 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였으며 실험 시작 30분 전에 각각 WAY-100635 (0.
- 괴각 추출물의 항불안 효능을 탐색하기 위하여 elevated plus-maze, horizontal wire test 및 open field test와 같은 동물 행동실험을 통하여 비교한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 괴각 추출물이 일반적인 항불안 약물들이 가지는 근육이 완이나 진정 등의 부작용을 나타내는지 확인하기 위하여 horizontal wire test를 실시하였다(29). 괴각 추출물 투여군에서 대조군과 비교하여 어떠한 유의적인 차이를 관찰 할 수 없었다(Fig.
- 괴각(Sophorae fructus) 추출물은 괴각(Sophorae fructus)을 증류수로 세척한 뒤 80% 메탄올을 원생약의 10배 부피만큼 가한 후 3회 초음파 추출하였다. 이를 환류 냉각장치(rotary evaporator)로 감압 농축하여 얻은 점조상의 추출물을 동결건조 (Eyela, model FDU-2000, Tokyo, Japan)하여 실험에 사용하였다(수득율: 32.
- 괴각추출물의 항불안 작용이 어떤 신경계를 경유하여 발생하는지를 확인하기 위하여 antagonism study를 elevated plus-maze를 통하여 확인하였다. 실험 시작 1 시간 전에 괴각 추출물은 400 mg/kg을 투여하고 계속해서 실험 시작 30분 전에 각각 세로토닌 수용체의 길항제 (5-HT1A receptor antagonist)인 Way 100635 (0.
- 양성대조군에는 생리식염수에 녹인 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분전에 복강 투여하였다. 길항실험에 사용한 WAY-100635 (0.3 mg/kg)은 생리식염수에, flumazenil (10 mg/kg)은 10%Tween 80 수용액에 녹여 실험 30분 전에 복강 투여하였다.
- 괴각 추출물은 10% Tween 80 수용액으로 현탁시켜 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 실험 시작 1 시간 전에 경구 투여하였고, 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다. 양성대조군에는 생리식염수에 녹인 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분전에 복강 투여하였다.
- 괴각 추출물은 10% Tween 80 수용액으로 현탁시켜 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 실험 시작 1 시간 전에 경구 투여하였고, 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다. 양성대조군에는 생리식염수에 녹인 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분전에 복강 투여하였다.
- 괴각 추출물은 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였으며 약물 투여는 실험 시작 1 시간 전에 종료되도록 하였다. 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였으며, 5 분 간격으로 wire test를 실시하여 그 평균값을 이용하였다.
- 괴각추출물의 항불안 작용이 어떤 신경계를 경유하여 발생하는지를 확인하기 위하여 antagonism study를 elevated plus-maze를 통하여 확인하였다. 실험 시작 1 시간 전에 괴각 추출물은 400 mg/kg을 투여하고 계속해서 실험 시작 30분 전에 각각 세로토닌 수용체의 길항제 (5-HT1A receptor antagonist)인 Way 100635 (0.3 mg/kg, i.p.)와 GABA 수용체의 길항제 (GABAA receptor antagonist)인 flumazenil (10 mg/kg, i.p.)을 병용 투여하여 elevated plus-maze를 실시하였다. Fig.
- 실험결과는 EthoVision program (Noldus Information Technology, Wageningen, Netherlands)으로 마우스가 open arm과 closed arm에 머문 시간, 각 arm의 출입 횟수 및 총 이동거리 등을 5분 간 측정하여 항불안 효과를 측정하였다(17). 각 arm의 출입 횟수는 open arm 이나 closed arm의 교차점을 기준으로 할 때 어느 쪽으로나 네 발이 완전하게 진입되었을 때를 1회로 하고 open arm과 closed arm에 대하여 각각 측정하였다.
- 양성대조군으로는 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분 전에 복강 투여하였고, 괴각 추출물은 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였다. 약물투여는 실험 시작 1 시간 전에 투여가 종료되도록 하였으며 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다. 각 군은 8-10마리로 하였다.
- 괴각 추출물은 10% Tween 80 수용액으로 현탁시켜 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 실험 시작 1 시간 전에 경구 투여하였고, 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다. 양성대조군에는 생리식염수에 녹인 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분전에 복강 투여하였다. 길항실험에 사용한 WAY-100635 (0.
- 항불안 효과는 웅성 ICR mice를 이용하여 elevated plus-maze에서 측정하였다. 양성대조군으로는 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분 전에 복강 투여하였고, 괴각 추출물은 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였다. 약물투여는 실험 시작 1 시간 전에 투여가 종료되도록 하였으며 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다.
- 검정색의 아크릴로 제작된 elevated plus-maze은 항불안 효과의 측정에 사용되었으며, 바닥에서 50 cm 높이에 설치된 십자형(+) 미로로서, 4개의 통로 가운데 크기가 동일한 2개의 통로는 높이 20 cm의 벽으로 구성되어 있고, 다른 2개의 통로 (길이 30 cm, 폭 5 cm)는 개방되어있다. 중심 platform은 가로 5 cm 및 세로 5 cm로 하였고, maze의 중앙부 천장에 비디오카메라를 설치하여 동물의 행동을 기록하였다. 실험을 시작할 때 마우스는 maze의 open arm에 머리를 밖으로 향하게 놓은 다음 maze를 자유롭게 탐색하도록 하였다.
- 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다. 총 이동거리를 5분 간격으로 총 20분 동안 측정하였다.
- 항불안 효과는 웅성 ICR mice를 이용하여 elevated plus-maze에서 측정하였다. 양성대조군으로는 Diazepam (1 mg/kg)을 실험 30분 전에 복강 투여하였고, 괴각 추출물은 50, 100, 200 및 400 mg/kg 용량으로 경구 투여하였다.
대상 데이터
- 92%). Diazepam, WAY-100635, Tween 80 (polyethylene glycol sorbitan monooleate), sodium chloride, flumazenil은 시그마 알드리치 (St Louis, Mo, USA)의 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다.
- 약물투여는 실험 시작 1 시간 전에 투여가 종료되도록 하였으며 대조군은 괴각 추출물 투여군과 동일 부피로 10% Tween 80 수용액을 경구 투여하였다. 각 군은 8-10마리로 하였다.
- 실험동물은 웅성의 ICR (SPF/VAF CrljBgi: CD-1) 5주령을 (주)오리엔트(경기도, 한국)에서 공급받아 명암주기는 12시간 주기로 자동적으로 조절되는 사육실에서 온도 23± 2℃, 습도 50 ± 10% 내외로 유지되었고, polycarbonate mice cage에 수용하여 사육하였으며 환경적응 기간 동안 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 괴각(Sophorae fructus) 추출물은 괴각(Sophorae fructus)을 증류수로 세척한 뒤 80% 메탄올을 원생약의 10배 부피만큼 가한 후 3회 초음파 추출하였다. 이를 환류 냉각장치(rotary evaporator)로 감압 농축하여 얻은 점조상의 추출물을 동결건조 (Eyela, model FDU-2000, Tokyo, Japan)하여 실험에 사용하였다(수득율: 32.92%). Diazepam, WAY-100635, Tween 80 (polyethylene glycol sorbitan monooleate), sodium chloride, flumazenil은 시그마 알드리치 (St Louis, Mo, USA)의 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다.
데이터처리
- P values for the group comparisons were obtained by one way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (p< 0.05 as compared with 10% Tween 80-treated control group).
- p values for group comparisons were obtained by one way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (p< 0.05 versus 10% Tween 80-treated control).
- p values for the group comparisons were obtained by one way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (p < 0.05 versus 10% Tween 80-treated control, p < 0.05 as compared with the Sophorae fructus-treated group).
- 모든 실험 결과는 one way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였고, 유의성이 인정될 경우 Student-Newman-Keuls Method를 이용하여 p < 0.05 수준이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 실험동물은 웅성의 ICR (SPF/VAF CrljBgi: CD-1) 5주령을 (주)오리엔트(경기도, 한국)에서 공급받아 명암주기는 12시간 주기로 자동적으로 조절되는 사육실에서 온도 23± 2℃, 습도 50 ± 10% 내외로 유지되었고, polycarbonate mice cage에 수용하여 사육하였으며 환경적응 기간 동안 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험동물의 처치 및 유지는 실험동물 관리 원칙 (NIH publication No. 85-23, revised 1985)과 대구한의대학교의 동물의 관리 및 사용 규정에 입각하여 진행하였다.
성능/효과
- Elevated plus-maze를 이용한 본 연구에서 괴각 추출물의 100 mg/kg, 200 mg/kg 및 400 mg/kg 투여군에서 대조군에 비하여 open arm에서 머무른 시간의 백분율이 증가하였고, open arm으로의 출입 백분율 또한 증가하였다. Elevated plus-maze를 이용한 길항실험에서는 benzodiazepine 수용체의 antagonist인 flumazenil에 의해 괴각 추출물 400 mg/kg 의 항불안 효능이 차단되는 것이 관찰되었다.
- Fig. 2에서 알 수 있는 바와 같이, 100, 200 및 400 mg/kg 용량의 괴각 추출물 투여군에서 open arm에 머무는 시간의 백분율이 대조군의 비율과 비교 하여 용량 의존적으로 유의성 있게 증가됨이 관찰되었다 (각각 46.17 ± 3.74%, 48.8 ± 2.39%, 49.06 ± 0.99% versus 32.93 ± 2.4%, p < 0.05).
- 괴각 추출물의 투여에 의해 locomotor activity가 변화되었는지 확인하기 위해 총 이동거리를 측정한 결과 괴각 추출물의 모든 용량에서 대조군과 비교 시 차이를 보이지 않았다. 결론적으로 괴각 추출물은 locomotor activity 및 근이완 작용의 변화 없이 항불안 작용을 갖는 것이라고 할 수 있다.
- 결론적으로, 본 연구의 결과에서 괴각의 메탄올 추출물이 elevated plus-maze test, horizontal wire test 및 open field test를 통하여 locomotor activity 및 근육이완이나 진정 등의 부작용이 없으면서 우수한 항불안 작용을 가지는 천연물이라고 생각되어지며 이러한 작용이 특히 GABA 신경계와 관련이 있음을 시사하고 있다. 향후 괴각의 항불안 작용의 평가를 위하여 다양한 실험모델의 개발이 필요할 것으로 생각되며 또한 이러한 작용에 대한 기전 연구가 포괄적이고 다각적으로 진행되어져야 할 필요성이 있다고 사료된다.
- 괴각 추출물의 투여에 의해 locomotor activity가 변화되었는지 확인하기 위해 총 이동거리를 측정한 결과 괴각 추출물의 모든 용량에서 대조군과 비교 시 차이를 보이지 않았다. 결론적으로 괴각 추출물은 locomotor activity 및 근이완 작용의 변화 없이 항불안 작용을 갖는 것이라고 할 수 있다.
- 그러나 괴각 추출물과 WAY-100635의 병용 투여군의 open arm에 머무는 시간의 백분율 및 open arm에 출입한 횟수의 백분율은 각각 34.56 ± 2.93%, 41.01 ± 2.34%로 괴각 추출물 투여군과 비교하여 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았으나, 괴각 추출물과 flumazenil의 병용 투여군의 open arm에 머무는 시간의 백분율 및 open arm에 출입한 횟수의 백분율은 각각 23.7 ± 1.38%, 31.57 ± 2.03%로 괴각 추출물 투여군과 비교하여 유의성 있게 감소되었음을 확인할 수 있었다 (p < 0.05, Fig. 3).
- 괴각 추출물의 투여가 자발운동력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 open field test를 실시하였다(28). 대조군 및 괴각 추출물 (50, 100, 200 and 400 mg/kg) 투여군의 총 이동거리를 5분 간격으로 총 20분 동안 측정한 결과, 통계적으로 유의적인 차이는 없었다(Tab. 1).
- 또한 flumazenil 또는 WAY-100635 투여군에서의 open arm에 출입한 횟수의 백분율은 각각 35.78 ± 2.63%, 31.57 ± 2.03%로 나타났으며, open arm에 머무는 시간의 백분율과 마찬가지로 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다.
- 또한 open arm에 출입한 횟수의 백분율에서도 100, 20및 400 mg/kg 용량의 괴각 추출물 투여군의 비율이 대조군의 비율과 비교하여 용량 의존적으로 유의성 있게 증가하였음을 관찰할 수 있었다 (각각 49.81 ± 2.19%, 51.33 ± 1.5%, 51.44 ± 1.81% versus 42.29 ± 1.52%, p < 0.05, Fig. 2).
- 항불안 약물의 검색은 open arm에서 머문 시간의 연장 및 open arm으로의 진입횟수의 증가로서 평가되는데 이는 closed arm의 진입 횟수 및 머문 시간의 감소로 표현된다. 불안에 대한 괴각의 효능을 확인한 결과, elevated plus-maze를 이용한 본 연구에서 괴각 추출물의 100 mg/kg, 200 mg/kg 및 400 mg/kg 투여군에서 대조군에 비하여 open arm에서 머무른 시간에 대한 백분율이 증가하였으며, 또한 open arm으로의 출입횟수에 대한 백분율도 증가하였다.
- 양성대조군인 diazepam 투여군에서는 56.04 ± 2.7%로 대조군의 비율보다 유의성 있게 증가함을 알 수 있었다 (p <0.05).
- 양성대조군인 diazepam 투여군에서는 58.68 ± 3.34%로 대조군보다 유의성 있게 증가함을 알 수 있었다 (p < 0.05).
- 3). 이 결과를 통해서, 괴각 추출물의 항불안 작용이 GABA complex의 benzodiazepine 수용체의 antangonist인 flumazenil에 의해 완전히 차단되어지는 것으로 보아 괴각 추출물이 GABA 신경계를 경유하여 항불안 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다(25).
- 4). 이러한 결과로 통하여 괴각추출물은 항불안 약물들의 투여에 의해 발생하는 근육이완 등의 부작용이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 항불안 약물로 세인트존스 워트(St John's Wort)와 발레리안(Vallerian)가 사용되기 시작하면서 부작용이 보다 적은 천연물의 사용 및 개발에 대한 관심이 증가하고 있어 국내에서 오랫동안 사용되어 온 한약재 및 활성성분의 과학적 해석을 통한 한약제제 및 천연물 제제의 동등성 연구 기반의 구축에 본 연구의 필요성이 있다고 생각된다.
- 결론적으로, 본 연구의 결과에서 괴각의 메탄올 추출물이 elevated plus-maze test, horizontal wire test 및 open field test를 통하여 locomotor activity 및 근육이완이나 진정 등의 부작용이 없으면서 우수한 항불안 작용을 가지는 천연물이라고 생각되어지며 이러한 작용이 특히 GABA 신경계와 관련이 있음을 시사하고 있다. 향후 괴각의 항불안 작용의 평가를 위하여 다양한 실험모델의 개발이 필요할 것으로 생각되며 또한 이러한 작용에 대한 기전 연구가 포괄적이고 다각적으로 진행되어져야 할 필요성이 있다고 사료된다.
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