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문제 정의
- 본 연구는 succinate dehydrogenase (SDH) 및 triosephosphate isomerase (TPI) 유전자를 대상으로 유전자발현이 한우 근내지방함량과 미치는 영향을 분석하였다. 소의 성장 및 비육에 있어서 비육전기에 해당하는 12개월령과, 비육 후기에 해당하는 27개월령에 있어서 소의 근내지방은 최고로 증가한다고 보고되어 있다[23].
- 본 연구는 비육 전·후기 차등발현을 보이는 두 개의 유전자(SDH 및 TPI)가 한우 등심조직내 근내지방함량과 연관성이 있는가를 분석하기 위해서, 근내지방함량 표현형정보를 가지고 있는 한우 동기우 집단 50두를 대상으로 유전자발현 분석을 수행하였다.
제안 방법
- 65℃에서 5분간 변성 후 즉시 얼음 위에서 냉각한 후 5× buffer 4 μl, 0.1M DTT 2 μl, RNase inhibitor (Promega) 0.5U 및 reverse transcriptase (SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase, Invitrogen, USA) 1 μl를 첨가하여 42℃에서 60분간 반응시킨 후, 70℃에서 15분간 반응시켜 reverse transcriptase를 불활성화 시킨 후 real-time PCR의 주형으로 사용하였다.
- 각 PCR 반응은 95℃에서 10분간 예비 변성한 후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 40회 반복하여 수행하였다. PCR 반응 종결 후 melting curve 작성을 통하여 유전자 증폭의 정확성을 재확인하였다. 유전자 발현량의 내부 보정을 위하여 Genbank에 등록된(BC102589) house keeping 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하였고, 유전자 발현량은 2-ΔCt값을 이용하여 계산하였다.
- 유전자 발현량의 내부 보정을 위하여 Genbank에 등록된(BC102589) house keeping 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하였고, 유전자 발현량은 2-ΔCt값을 이용하여 계산하였다. 내부 보정용 유전자로 사용된 GAPDH유전자의 발현은 5`-GGGTCA TCATCTCTGCACCT-3`와 5`-GGTCATAAGTCCCTCCAC GA-3`의 primer를 이용하여 분석하였고, 발현량(Ct)은 25~26의 범위로 각 개체별 유사한 값을 가짐을 확인 후 사용하였다.
- 1, Table 1). 소에 있어서 12개월과 27개월령은 근내지방 뿐만 아니라, 성장에 있어서도 급격하게 증가하기 때문에, 이 시기에 있어서 차등발현되는 유전자가 한우에 있어서 근내지방함량축적과 연관성이 있는지를 규명하기 위해서, 한우 동기우 집단 50두의 등심육을 대상으로 유전자 발현량과 근내지방함량과의 관련성을 분석하였다. 그 결과 SDH 유전자가 근내지방함량과 고도의 유의적(p<0.
- 시료로부터 추출된 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA 0.2 μg을 주형으로 2X Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, UK)와 각각의 primer set을 이용하여 7500 Real time PCR system (Applied Biosystems)을 통하여 분석하였다.
- 유전자 발현량의 내부 보정을 위하여 Genbank에 등록된(BC102589) house keeping 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하였고, 유전자 발현량은 2-ΔCt값을 이용하여 계산하였다.
- 획득된 RNA pellet은 70% 에탄올을 이용하여 세척한 후 건조하고, DEPC를 처리한 멸균증류수에 녹여 사용하였다. 유전자 발현분석을 위하여 추출된 총 RNA는 RNeasy MiniElute cleanup kit (Qiagen Co., Ltd., USA)을 이용하여 정제 후 cDNA 합성에 이용하였다.
- 총 RNA 2 μg에 random primer(Promega, USA) 1 μl, 2.5mM dNTP 1 μl를 첨가하고, DEPC를 처리한 증류수로 총 12 μl가 되도록 하였다.
대상 데이터
- SDH 및 TPI 유전자의 비육 전·후기 발현양상 분석을 위하여 12개월 및 27개월령 각 3두를 공시하였고, 유전자의 발현양상과 근내지방함량과의 관련성 분석을 위하여 국립축산과학원에서 동일한 조건으로 사양된 28~30개월령의 동기우 50두(체중 664±32 kg)를 분석에 사용하였다.
- SDH(5‘-TCCTGCAGACCCGGAGATAAAGTT-3‘, 5‘-TCGCAGTT CCGATGTCCTTATGCT-3') 및 TPI (5'-AACAGGCCCAGG AAGTACACGAAA-3', 5'-TCAACGAACTCAGGCTTGAGG GAA-3')유전자 분석에 사용된 primer는 GenBank에 등록된 염기서열(NM_174178, NM_001013589.2)을 기준으로 제작되었다.
- 조직으로부터 추출된 총 RNA는 유전자 발현분석을 위한 cDNA 합성에 이용하였다. 총 RNA 2 μg에 random primer(Promega, USA) 1 μl, 2.
이론/모형
- SDH 및 TPI 유전자의 비육 전·후기 발현양상 분석을 위하여 12개월 및 27개월령 각 3두를 공시하였고, 유전자의 발현양상과 근내지방함량과의 관련성 분석을 위하여 국립축산과학원에서 동일한 조건으로 사양된 28~30개월령의 동기우 50두(체중 664±32 kg)를 분석에 사용하였다. 모든 등심시료는 도축 후 30분 이내에 채취하여 액체질소를 이용 즉시 동결하고, 사용 전 까지 -70℃에 보관하면서 실험에 이용하였으며, 지방함량 측정은 시료 1 g을 이용 Folch 등[4]의 방법에 기초하여 수행하였다.
- 유전자의 발현량이 근내지방함량에 미치는 영향을 분석을 위하여 R statistical program의 ANOVA (analysis of variance) 모델을 활용하여 분석하였고, 분석에 사용한 모형은 다음과 같다.
- 유전자의 발현양상을 분석하기 위하여 Real-time RT-PCR법을 이용하였다. 시료로부터 추출된 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA 0.
성능/효과
- 그 결과 SDH 유전자가 근내지방함량과 고도의 유의적(p<0.001) 관계가 있음을 확인하였다(Fig. 2, Table 2).
- 최근, 지방함량의 차이를 보이는 돼지품종을 대상으로 단백체(proteome) 및 전사체(transcriptome)연구를 통해 SDH가 차등발현됨을 확인하였다[15,22]. 또한 소 유래 mesenchymal stem cells (MSCs)의 지방분화유도 실험에서도 SDH 유전자의 발현이 지속적으로 감소되는 경향을 관찰하였으며[20], 본 연구에서도 비육 전·후기 시료 및 동기우 집단 50두를 대상으로 유전자발현 및 통계분석을 통해 SDH 유전자가 근내지방과 고도의 유의성이 있음이 확인되었다. 이러한 결과는 SDH 유전자가 한우 등심 내 근내지방함량을 설명할 수 있는 유용한 마커라고 생각된다.
- 이러한 생리학적 특성을 고려하여, 비육 전·후기 시료를 대상으로 유전자 발현분석을 수행한 결과 SDH 유전자는 비육전기(12개월령)에서 비육후기(27개월령)보다 4배 발현이 높은 것으로 확인되었다(p<0.01).
- SDH는 근육 내에서 숙신산염의 산화작용을 통해 지방분해를 촉진시킨다고 보고되었으며[22], TPI는 glycerol로부터 생성되는 dehydroxyacetone phosphate (DHAP)를 glyceraldehydes-3-phosphate로 전환시켜 지방세포 내 중성지방(triacylglycerol)의 분해작용에 관여하는 것으로 알려져 있다[11]. 이러한 연구 결과로 볼 때 SDH 및 TPI가 근육 내 지방생합성과 밀접하게 관련되어 있을 것으로 판단된다.
후속연구
- 그러나 장기간의 비육은 근내지방향상에 도움은 되지만, 등지방 및 내장지방과 같은 불가식지방량의 증가에 따른 정육율의 감소와 같은 비효율적인 결과를 초래하고 있다[3]. 따라서 근육내 지방을 조절하는 특이 유전자 및 근육내 지방축적에 대한 유전자발현 메커니즘을 규명할 수 있다면, 효과적인 쇠고기 생산에 이용할 수 있을 것이다.
- 또한, 지방세포(3T3-L1)를 이용한 지방분화(adipogenesis)유도 실험에서 TPI유전자의 발현이 지방분화과정 중 증가되는 현상을 보였으나, 지방분화 초기에 관여한다고 보고하였다[16]. 본 실험에서도 TPI가 근내 지방함량이 증가되면서 발현이 증가됨을 확인하였으나 유의적인 차이는 관찰하지 못하였으며, 소 조직유래 지방 전구세포를 이용한 지방분화유도 실험에서 TPI의 발현이 단백질 수준에서 감소된다고 보고된 바도 있어[25], 앞으로 다양한 시료의 분석 및 발현유도 실험 등을 통해 TPI유전자 발현과 근내지방함량과의 관계를 명확히 구명할 필요성이 있을 것으로 판단된다.
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