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문제 정의
- 본 연구는 열수추출법, 초임계추출법, 초음파추출법, 초음파와 열수 병행추출법, 감압추출법으로 복분자 추출물을 제조한 후 이에 함유된 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드의 함량을 측정하고 생리활성 등을 비교하여 기능성 식품 소재를 개발하는데 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- 추출 방법별로 추출물을 농축한 후 시료 용액에 Folin-Ciocalteu’s 시약 1 mL를 가하고 3분 후 10% Na2CO3 용액(w/v) 2 mL를 넣고 1시간 실온에서 방치한 후 700 nm에서 비색정량 하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 02 mL를 가한 다음 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 방치하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. Rutin을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 농도별로 조제한 시료에 2×10-4M DPPH 용액을 가한 후 실온에서 30분간 반응시키고 517 nm에서 흡광도를 측정하여 추출물의 DPPH 라디칼 소거능(%)을 측정하였다.
- 대조구는 시료 대신에 EtOH을 첨가하여 실험 하였으며, 대조군 BHA, α-tocopherol을 사용하여 활성을 비교하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
- 대조구는 시료대신 EtOH를 사용하였으며, 대조군은 BHA, α-tocopherol을 사용하여 활성을 비교하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
- 복분자 미숙과의 추출방법은 열수 추출(HWE), 초임계 추출(SFE), 초음파 추출(USE), 초음파와 열수 병행추출 (USE+HWE), 감압 추출(VE) 방법으로 추출물을 제조하였다. 열수 추출은 생과 400 g에 증류수를 넣고 환류냉각장치를 부착한 히팅 맨틀을 이용하여 2시간 동안 가열 추출하였고, 이것을 2회 반복 하였다.
- 복분자 미숙과의 추출방법은 열수 추출(HWE), 초임계 추출(SFE), 초음파 추출(USE), 초음파와 열수 병행추출 (USE+HWE), 감압 추출(VE) 방법으로 추출물을 제조하였다. 열수 추출은 생과 400 g에 증류수를 넣고 환류냉각장치를 부착한 히팅 맨틀을 이용하여 2시간 동안 가열 추출하였고, 이것을 2회 반복 하였다.
- 25 mM CuSO4를 가해 반응시키고 20% TCA 1 mL를 가해 반응을 중단시켰다. 이 반응액을 vortex 한 후 0.05 N NaOH에 녹인 0.67% TBA을 혼합하여 95℃, 15 분간 가열하고 냉각한 후 원심분리 하여 분리된 상등액 1 mL을 semi-micro cuvette에 분주하여 540 nm에서 생성된 MDA(malondialdehyde)의 흡광도를 측정하였다(Miller CP 등 1996).
- 초음파 추출의 경우 생과 400 g에 증류수를 넣고 초음파 추출기(JEIO TECH, 대전, Korea)를 이용하여 50℃에서 40 KHz의 초음파로 2시간동안 2회 추출하였다.
- 초음파와 열수 병행 추출은 생과 400 g에 증류수를 넣고 초음파 추출기(JEIO TECH, 대전, Korea)를 이용하여 50℃에서 40 KHz의 초음파로 2시간동안 1회 추출한 후 환류냉각장치를 부착한 히팅 맨틀을 이용 2시간 동안 1회 가열 추출하였다.
- 초임계 추출은 초임계 이산화탄소 추출장치(일신오토클래이브, 대전, Korea)를 이용하여 추출을 진행하였다. 초임계유체 추출 조건은 열풍 건조 후 마쇄한 복분자 미숙과 100 g을 100% CO2를 이용하여 40℃에서 300 bar의 압력으로 3시간 추출하였다.
- 초임계 추출은 초임계 이산화탄소 추출장치(일신오토클래이브, 대전, Korea)를 이용하여 추출을 진행하였다. 초임계유체 추출 조건은 열풍 건조 후 마쇄한 복분자 미숙과 100 g을 100% CO2를 이용하여 40℃에서 300 bar의 압력으로 3시간 추출하였다.
- 추출 방법별 추출물을 농도별로 50 μL를 취하여, 0.75 unit/mL의 α-glucosidase 효소액, 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0), 2 mM PNPG로 반응 시킨 후 0.5 M CuSO4 용액으로 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 효소활성을 계산하였다(Kim BN 등 1991).
- 추출 방법별 추출물을 농도별로 DMSO에 녹여 20 μL를 취하고 LDL 50 μL, 10 mM PBS, 0.25 mM CuSO4를 가해 반응시키고 20% TCA 1 mL를 가해 반응을 중단시켰다.
- 추출 방법별로 추출한 추출물은 여과지(ADVANTEC No.2, Tokyo, Japan)를 이용 여과한 후 감압농축 후 동결 건조하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 gallic acid, rutin hydrate, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, BHA(butylated hydroxyanisole), α-tocopherol, linoleic acid, ferrous chloride, CuSO4, α-glucosidase, PBS(phosphate-buffered saline), TBA(thiobarbituric acid), PNPG(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside), TCA(trichloroacetic acid), LDL(low density lipoprotein), acarbose는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Na2CO3 등 다른 시약은 Junsei(Tokyo, Japan)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 복분자는 고창군에서 재배된 것으로 2010년 6월부터 과실의 색이 녹색인 것을 미숙과로 수확하여 -20℃에서 냉동 보관하여 사용하였다.
- 5 M CuSO4 용액으로 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 효소활성을 계산하였다(Kim BN 등 1991). 양성대조구로는 acarbose를 사용하였다.
데이터처리
- Different alphabets within a column show significantly different at p˂0.05 by Duncan's multiple range test.
- 실험결과는 3회 반복실험 한 값을 SAS Package(release 9.1.3)를 이용하여 평균값의 p < 0.05의 수준에서 분산분석으로 유의성을 검정하고 Duncan의 다중범위 분석을 실시하였다.
이론/모형
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법(Amerne MA와 Ough CS 1980)을 응용하여 측정하였다. 추출 방법별로 추출물을 농축한 후 시료 용액에 Folin-Ciocalteu’s 시약 1 mL를 가하고 3분 후 10% Na2CO3 용액(w/v) 2 mL를 넣고 1시간 실온에서 방치한 후 700 nm에서 비색정량 하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Davis 방법(Chang CC 등 2002)을 이용하여 측정하였는데, 시료용액에 diethylene glycol 2 mL, 1 N-NaOH 0.02 mL를 가한 다음 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 방치하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. Rutin을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 추출 방법별로 추출물의 linoleic acid의 지질과산화에 대한 억제활성 측정은 Inatani R 등(1983)의 방법에 따라 실시하였다. 각 시료를 농도별로 용매 1.
- 추출 방법별로 추출물의 항산화 활성을 조사하기 위하여 자유라디칼인 DPPH를 사용한 항산화활성 측정법(Choi JS 등 1993)을 이용하였다. 각 시료를 농도별로 용매 1.
성능/효과
- α-Glucosidase 활성 억제 효과의 경우는 감압 추출물이 가장 좋았으며, IC50 값은 14.34±0.20 μg/mL을 보였다.
- DPPH 라디칼 소거활성, 지질과산화 억제 활성, LDL 산화 억제 활성은 열수 추출물이 가장 좋았으며, 각각의 IC50 값은 35.39±0.25 μg/mL, 12.61±0.31 μg/mL, 1.31±0.02 μg/mL을 나타내었다.
- 감압 추출물과 열수 추출물은 25 μg/mL에서 각각 81.82±1.04%, 77.97±0.79%를 나타내었으며, 초임계 추출물, 초음파 추출물 초음파와 열수 병행 추출물은 50%정도의 억제 활성을 나타내었다.
- 감압 추출물은 3.33±0.83∼88.14±0.19%, 초음파 추출물은 0.31±0.35∼62.53±2.00%, 초음파와 열수 병행 추출물은 1.46±0.74∼90.42±0.66%이었으며, 초임계 추출물은 0.90±0.52∼5.13±0.87%로 항산화활성이 가장 낮았다.
- 일반적으로 총 폴리페놀의 함량이 높을수록 DPPH 라디칼소거능도 높아지는 것으로 알려져 있다(Choi SY 등 2005). 그러나 본 연구에서는 감압 추출물, 초음파와 열수 병행 추출물이 열수 추출물보다 총 폴리페놀의 함량은 높았으나 DPPH 라디칼 소거능은 오히려 낮았다. 이러한 결과는 폴리페놀 이외에 고온에서 추출되는 항산화 물질이 더 많이 추출되었기 때문으로 생각된다.
- 대조군으로 사용한 BHA는 25 μg/mL 이상의 농도에서 94∼95%, α-tocopherol의 경우 25 μg/mL 이상의 농도에서 84∼88% 정도의 억제 활성을 보였다.
- 모든 추출물이 농도 의존적으로 α-glucosidase 활성을 억제하는 경향을 나타내었다.
- 본 실험에서는 추출 방법별 추출물을 농도별로 LDL 산화에 미치는 영향을 알아보기 위해 농도를 0.5, 1, 2, 4, 8 μg/mL로 처리한 결과는 Fig. 3과 같으며, 모든 추출물이 농도 의존적으로 LDL 산화 억제 활성이 높아지는 경향을 보였다.
- 20 μg/mL을 보였다. 본 연구 결과 복분자 미숙과를 이용한 기능성 식품소재 개발 시 열수 추출, 감압 추출 방법이 우수한 것으로 판단되었다.
- 2와 같았다. 실험에 사용된 모든 추출물이 농도 의존적으로 지질과산화 억제 활성이 높아지는 경향을 나타내었다. 대조군으로 사용한 BHA는 25 μg/mL 이상의 농도에서 94∼95%, α-tocopherol의 경우 25 μg/mL 이상의 농도에서 84∼88% 정도의 억제 활성을 보였다.
- 열수 추출물, 초음파 추출물, 초음파와 열수 병행 추출물, 감압 추출물은 지질과산화 억제 활성이 높아 50 μg/mL 이상의 농도에서 70% 이상의 억제 활성을 나타내었으나 초임계 추출물은 10%정도의 낮은 억제 활성을 보였다.
- 열수 추출물, 초음파와 열수 병행 추출물, 초음파 추출물, 감압 추출물의 IC50 값은 1.31±0.02∼2.40±0.84 μg/mL 사이였으며 지질과산화 억제 활성과 같은 경향을 보였다.
- 열수 추출물, 초음파와 열수 병행 추출물의 IC50 값은 각각 12.61±0.31, 16.52±0.35 μg/mL 로 비교적 낮은 값을 보였으나 초임계 추출물, 초음파 추출물, 감압 추출물의 IC50 값은 각각 145.17±0.81, 29.59±0.56, 31.35±0.05 μg/mL으로 열수 추출물 및 초음파와 열수 병행 추출물과 비교했을 때 높게 나타났다.
- 열수 추출물의 IC50 값이 35.39±0.25 μg/mL로 항산화제인 BHA, α-tocopherol의 IC50 값과 보다는 높은 값을 보였으나 다른 추출 방법보다는 가장 낮은 값을 보였다.
- 총 폴리페놀 함량은 감압 추출물이 178.78±3.78 mg/g으로 가장 많이 함유되어 있었으며, 초음파와 열수 병행 추출물 139.37±0.57 mg/g, 열수 추출물 130.3±0.13 mg/g, 초임계 추출물 87.52±2.48 mg/g, 초음파 추출물 70.40±0.19 mg/g의 순으로 함량이 낮았다.
- 총 플라보노이드 함량은 감압 추출물이 40.93±0.68 mg/g으로 가장 많이 함유되어 있었으며, 총 폴리페놀 함량도 같은 경향이었다.
- 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과도 감압 추출물이 40.93±0.68 mg/g으로 가장 많이 함유되어 있었으며, 초음파와 열수 병행 추출물, 열수 추출물, 초임계 추출물, 초음파 추출물은 24.75±0.55과 35.48±0.79 mg/g 사이에 있었으며, 총 폴리페놀 추출방법에서와 같은 결과의 순서를 보였다.
- 추출 방법별 추출물을 측정한 결과는 Fig. 1에서와 같이 모두 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거활성이 높아지는 경향을 나타냈다. 추출 방법별로는 열수 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 좋았는데, 5, 25, 50, 100, 300 μg/mL 농도별로 각각 10.
- 추출 방법별 추출물의 총 폴리페놀 함량은 감압 추출(VE) 추출물이 178.78±3.79 mg/g으로 가장 많이 함유되었으며, 초음파와 열수 병행 추출물(USE+HWE), 열수 추출물(HWE), 초임계 추출물(SFE), 초음파 추출물(USE) 순으로 함량이 낮았다.
- 추출 방법별로는 열수 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 좋았는데, 5, 25, 50, 100, 300 μg/mL 농도별로 각각 10.60±0.15, 34.79±0.22, 59.91±0.13, 78.34±0.22, 90.78±0.13%를 나타내었다.
- 추출물의 DPPH 항산화 활성, 지질과산화 억제 활성, LDL 산화 억제 활성 및 α-glucosidase 억제 활성 효과는 모두 농도 의존적으로 높아지는 경향이었다.
- 추출방법별 추출물의 IC50 값은 Table 5와 같이 감압 추출물의 값이 14.34±0.20 μg/mL로 가장 낮은 값을 보였으며, 열수 추출물, 초음파와 열수 병행 추출물, 초음파 추출물, 초임계 추출물의 IC50 값은 각각 15.83±0.26, 23.43±1.14, 25.53±0.87, 26.44±0.67 μg/mL을 나타내었다.
- 특히 열수 추출물, 초음파와 열수 병행 추출물의 LDL 산화 억제 효과는 2 μg/mL 농도에서 65.40±3.06% 이상의 억제 활성을 나타냈었으나 초임계 추출물의 경우는 1.20±0.69∼7.57±1.50%로 가장 낮은 활성을 보였다.
후속연구
- 본 연구에서도 복분자 추출물이 α-glucosidase 저해 활성을 보여 어떤 화합물이 저해 활성을 나타내었는지 추후 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
- 0% 정도의 억제 활성을 보였다(data not shown). 이들 추출물은 acarbose 보다 좋은 효과를 보이므로 향후 기존 당뇨병 치료제를 대체할 수 있는 천연물 제제 및 기능성 식품으로 개발 가능성이 높다고 본다. 시판되고 있는 α-glucosidase 저해제는 장기간 복용할 경우 일부 환자에 있어서 복부팽만감, 구토, 설사 등 부작용을 나타낼 수 있어 그 사용이 제한될 수 있다.
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