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문제 정의
- 따라서, 밀리타리스 동충하초의 항염증 활성을 확인하고자 동충하초 추출물의 free radical 저해능과 마우스 대식세포인 Raw 264.7 cell에 LPS를 처리하여 동충하초 추출물의 염증반응을 저해활성을 살펴보았다.
제안 방법
- 검은색 96-well microplate에 농도별로 조절된 동충하초 추출물을 10ul 취하고, 90mM NaCl 및 5mM KCl, 100 mM diethylenetriaminepenta acetic acid, 10 mM DHR 123을 함유하는 sodium phosphate 완충액(pH 7.4)를 가한 후, peroxynitrite를 발생시키는 SIN-1을 50 μM 농도로 처리하여 동충하초 추출물이 최종농도 16, 32, 64, 128 μg/ml이 되게 하였다.
- 5mg/l amphotericin B, 그리고 10% 불활성화된 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)을 이용하여 37℃에서 5% CO2와 95% air가 함유된 습한 대기 조건에서 배양하였다. 그리고 10% FBS를 첨가하지 않은 것을 serum-free medium (SFM)으로 하였으며 100mm plastic flasks에 2일에 한번씩 subculture하여 세포주를 유지하였다.
- 4)를 가한 후, peroxynitrite를 발생시키는 SIN-1을 50 μM 농도로 처리하여 동충하초 추출물이 최종농도 16, 32, 64, 128 μg/ml이 되게 하였다. 그리고, Peroxinitrite의 분당 변화량은 fluorescence microplate reader(Synergy HT, BIO-TEK, VT, USA )를 사용하여 excitation 500nm 및 emission 536nm에서 측정하였다(Kooy 등, 1994).
- 7 세포를 24 well plate에 well당 7 x 104개가 되도록 분주하고 16시간 배양한 후 동충하초 추출물이 최종농도 16, 32, 64 μg/ml이 되게 처리 한 다음 1시간 후 lipopolysaccharide (LPS) 1 μg/ml로 처리하여 6시간 배양하였다. 배양 후 세포 상층액으로 분비된 NO 생성량을 Griess reagen system (Promega, Fitchburg, WI, USA)를 이용하여 측정하였다(Rao, 1997; Xie 등, 1994).
- 이러한 peroxinitrite를 밀리타리스 동충하초 추출물(70% EtOH)이 효과적으로 저해하는지 관찰한 결과는 그림 2와 같이 SIN-1 50 μM로 유도된 peroxinitrite를 농도 의존적, 유의적으로 제거하였다.
- 7 세포 증식에 미치는 영향을 MTT assay법을 이용하여 측정하였다. 즉, Raw 264.7 세포를 24 well plate에 7 x 104/well이 되도록 분주하고 16시간 배양한 후 동충하초 추출물을 최종농도 16, 32, 64, 128 ㎍/ml이 되게 처리하여 6시간 동안 배양한 다음 MTT assay를 이용하여 세포독성을 측정하였다(Reddy 등, 2003).
- 항염증 활성을 평가하기 위해 동충하초 추출물을 dimethylsulfoxide (DMSO)에 용해시켜 최종농도가 5 mg/ml이 되도록 제조하여 사용하였다.
대상 데이터
- Raw 264.7(mouse monocyte cell line)은 American Type Culture Collection로부터 분양 받은 세포를 사용하였으며, 2mM L-glutamine 및 100mg/ml streptomycin, 2.5mg/l amphotericin B, 그리고 10% 불활성화된 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)을 이용하여 37℃에서 5% CO2와 95% air가 함유된 습한 대기 조건에서 배양하였다.
- 건조된 밀리타리스 동충하초 4mg을 1ml(추출 시료량을 늘려야 실험에 사용한 추출물 량을 맞출 수 있음)의 70% 에탄올로 상온 24시간 추출 후 상등액을 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 분석은 prism 5 for windows(Graphic Pad, Inc., CA, USA)의 Newman-Keuls Multiple Comparison Test에 의한 one way ANOVA를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 동충하초 추출물의 세포 독성여부를 확인하기 위해, Raw 264.7 세포 증식에 미치는 영향을 MTT assay법을 이용하여 측정하였다. 즉, Raw 264.
성능/효과
- Raw 264.7 세포에 LPS 1 μg/ml을 처리하여 염증유전자 COX-2를 유도시키고 밀리타리스 동충하초 추출물의 처리가 COX-2의 발현을 저해하는지를 확인한 결과 그림 4와 같이 LPS 1 μg/ml를 처리한 raw 264.7 세포에서 확연히 증가한 COX-2의 발현을 밀리타리스 동충하초 추출물이 처리 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다.
- 밀리타리스 동충하초 추출물(70% EtOH)의 NO 저해능을 측정한 결과 그림 3과 같이 LPS 1 μg/ml을 처리한 군에서 NO 생성이 3.75 ± 0.20 μM 까지 증가하였으나 밀리타리스 동충하초 추출물 32 μg/ml 처리군에서 3.21 ± 0.10 μM, 64 μg/ml 처리군에서 3.07 ± 0.13 μM로 농도 의존적, 유의적으로 감소하였다.
- 밀리타리스 동충하초 추출물(70% EtOH)의 마우스 대식세포 (Raw 264.7)에 대한 세포 독성을 확인한 결과, 그림 1과 같이 모든 처리군에서 세포 생존율이 조금 하락하였다. 그럼에도 불구하고, 16μg/ml부터 128μg/ml까지 모든 농도에서 밀리타리스 동충하초 추출물을 처리한 군에서 세포생존을 저해한 유의적 차이가 없는 것으로 나타나 밀리터리스 동충하초의 추출물이 마우스 대식세포 raw 264.
- 밀리타리스 동충하초 추출물은 체내 염증반응을 유도하는 peroxinitrite를 밀리타리스 동충하초 추출물 128 μg/ml 처리로 peroxinitrite를 60.77±1.67% 저해시켜 뛰어난 저해능을 가지는 것으로 free radical의 생성을 억제하며, Raw 264.7 세포에 LPS 1 μg/ml을 처리하여 NO 생성이 3.75 ± 0.20 μM까지 증가하였으나 밀리타리스 동충하초 추출물 32 μg/ml 처리군에서 3.21 ± 0.10 μM, 64 μg/ml 처리군에서 3.07 ± 0.13 μM로 농도 의존적, 유의적으로 감소 시켰다.
- 특히, 밀리타리스 동충하초 추출물 128 μg/ml 처리군에서 peroxinitrite를 60.77±1.67% 저해시켜 뛰어난 저해능을 가지는 것으로 확인하였다.
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