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문제 정의
- 각각의 삼백초 분획물이 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 삼백초 헥산분 획물(Hexane fraction of Saururus chinensis BAILL; HSC)과 에틸아세테이트분획물(Ethyl acetate fraction of Saururus chinensis BAILL; ESC)은 0.
- 본 실험에서는 B16F10세포주에 α-MSH를 처리한 후 증가된 tyrosinase 활성에 삼백초 분획물들이 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.
- 삼백초 분획물이 α-MSH로 증가된 멜라닌 합성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.
- 삼백초 헥산추출물이 tyrosinase에 직접적으로 작용하여 효소의 활성을 억제시키는 것 인지 알아보기 위하여 기본 조건 하에서 배양된 B16F10 세포를 용해하여 tyrosinase 활성도 측정에 사용될 효소를 얻었다. 세포로부터 분리한 tyrosinase에 삼백초 헥산분획물 0.
- 멜라닌 합성 초기단계에서 중요한 역할을 하는 tyrosinase 활성은 삼백초 헥산분획물과 에틸아세테이트분획물에서 효과적으로 억제되었고, 부탄올분획물에서는 앞선 두 분획물 보다 높은 농도인 10, 20 ㎍/ml에서 비슷한 수준의 억제효과를 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 tyrosinase에 의해 촉매 되는 반응의 최종 산물인 멜라닌의 합성 양에 삼백초 분획물들이 어떠한 영향을 미치는지 측정하고자 하였다. B16F10 세포에 각각의 분획물들을 농도별로 처리한 후 세포내에서 합성된 멜라닌 합성 양을 측정한 결과 대조군 100±5.
- 멜라닌은 UV에 노출된 피부를 보호하는 작용을 하기도 하지만 과도한 생성은 기미, 주근깨, 피부 노화, 어두운 피부 톤 등의 미용상 좋지 않은 영향을 미친다. 이러한 멜라닌 생성을 삼백초 분획물이 B16F10 세포내에서 멜라닌 합성을 조절하는지 알아보았다. 삼백초 헥산분획물, 에틸아세테이트분획물, 부탄올분획물은 세포내 tyrosinase 활성 억제 효과와 같은 경향으로 세포내 멜라닌 합성을 억제 하였다.
- 특히 삼백초 에탄올추출물의 미백효능에 대한 보고가 되어져 있었지만17), 강한 세포 독성으로 인해 기능성 원료로 사용하는데 한계가 있을 것으로 생각되었다. 이에 저자는 삼백초 에탄올추출물의 세포 독성을 줄이고 미백효능을 증진시키기 위하여 용매별 분획을 실시하였고, 각 분획물들의 tyrosinase 활성 억제와 멜라닌 합성 억제 효과를 조사하였다.
제안 방법
- 6-well 배양용기에 B16F10세포를 8.5×104 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 삼백초 분획물을 처리하고 1시간 후 α-MSH(10 nM)를 처리하였다.
- B16F10 세포를 10 ㎝ 배양용기에 3×105 개씩 분주 하여 4일간 배양하여 세포를 수거하고, 5 mM EDTA 가 포함된 0.1 M sodium phosphate buffer(SPB, pH 6.8) 1 ml에 1%(V/V) triton X-100과 0.1%(V/V) 의 0.1 M PMSF를 혼합한 lysis buffer로 용해하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다.
- B16F10 세포를 chamber slide에 5×103 개씩 분주한 후 24시간 배양하고, 삼백초 분획물을 처리한다음 1시간 뒤 α-MSH(10 nM)를 처리하였다.
- 1% L-DOPA와 실온에서 4시간 반응 시켰다. PBS로 2회 세척하고 10% formalin 용액으로 30분간 고정한 후 PBS로 2회 세척 하고 에탄올로 탈수시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- The effect on tyrosinase activity was tested with several concentrations of HSC, ESC, BSC, and WSC for 3 days. Results are expressed as percent of control.
- 1 M PMSF를 혼합한 lysis buffer를 200 ul씩 분주하고 세포를 수거하여 얼음에서 30분간 용해시킨 다음 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 시약으로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였으며, 계산된 단백질과 0.1 M SPB(pH 6.8)의 총량이 150 ul가 되도록 분주 하고 0.1%(W/V) L-DOPA를 50 ul씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 30분 간격으로 475 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 멜라닌 정량은 Hosei 등의 방법20)을 변형하여 사용하였다. 직경 6 ㎝ 배양용기에 1.
- 이러한 삼백초 분획물의 tyorosinase 활성 억제 효능이 tyrosinase에 대한 직접적인 억제 작용 때문인지 알아보기 위하여 cell-free tyrosinase 활성 측정 법을 이용하였다. 배양된 세포로부터 tyrosinase를 추출하여 삼백초 분획물을 효소에 직접 처리함으로써 각각의 분획물이 tyrosinase에 대한 직접적인 억제 효과를 측정하였다. 실험 결과 세포내 tyrosinase 활성을 효과적으로 억제하였던 삼백초 헥산분획물, 에틸아세테이트분획물, 부탄올분획물은 tyrosinase 활성에 대하여 직접적인 억제 활성은 없는 것으로 나타난 반면 양성 대조군으로 사용한 코직산은 tyrosinase 활성에 직접적인 억제 효과를 나타냈다.
- 삼백초 부탄올분획물은 α-MSH 단독 처리군이 202±2.2%, α-MSH와 부탄올분획물 10, 20 ㎍/ml 병용처리 군에서 각각 169±3.6%와 147±1.2%로 유의성 있게 tyrosinase 활성을 억제시켰다(Fig. 3C).
- 삼백초 분획물들이 세포내 tyrosinase 활성에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 삼백초 헥산분획물과 에틸아세테이트분획물은 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 ㎍/ml로 처리하고, 부탄올분획물과 물 분획물은 1, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/ml로 처리한 다음 3일간 배양하여 세포내 tyrosinase 활성을 측정하였다. 헥산분획물은 농도 의존적으로 tyrosinase 활성이 현저하게 감소되었으며 각각의 농도별로 93±4.
- 삼백초 분획물의 tyrosinase 억제 활성을 세포 수준에서 관찰하기 위하여 DOPA 염색을 시행하였다. 삼백초 헥산분획물은 0.
- 각각의 삼백초 분획물이 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 삼백초 헥산분 획물(Hexane fraction of Saururus chinensis BAILL; HSC)과 에틸아세테이트분획물(Ethyl acetate fraction of Saururus chinensis BAILL; ESC)은 0.0625에서1 ㎍/ml까지, 부탄올분획물(Butanol fraction of Saururus chinensis BAILL; BSC)과 물분획물(water fraction of Saururus chinensis BAILL; WSC)은 1에서 20㎍/ml까지 처리하고 3일간 배양하였다. 세포 생존율은 MTT를 처리하여 570 nm로 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다.
- 삼백초 헥산분획물은 α-MSH 단독 처리군이 197±10.0%, α-MSH와 헥산분획물 0.125, 0.25㎍/ml 병용처리 군에서 각각 131±3.8%와 119±4.1%로 유의성 있게 tyrosinase 활성을 억제시켰다(Fig. 3A).
- 세포 독성이 적으면서 멜라닌 합성을 감소시키고, tyrosinase 활성을 억제하는 천연물질의 탐색을 위한 연구의 일환으로 삼백초 에탄올추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획을 실시하여 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 삼백초 분 획물 중 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물이세포독성 없이 세포내 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제함을 알 수 있었다.
- 직경 6 ㎝ 배양용기에 1.5×105 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 삼백초 분획물을 처리하고 1시간 후 α-MSH(10 nM)를 처리한 다음 3일간 배양 하였으며, 각 군당 2×106 개씩 수거하여 lysis buffer(5 mM EDTA, 0.1 M SPB(pH 6.8), 0.1% triton X-100)로 세포를 용해하였다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco(NY, USA)사 제품을, dimethylsulfoxide(DMSO), α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH), thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), L-3,4-dihydroxyphenyl alanine(L-DOPA) 은 Sigma사 제품을, 단백질 정량 시약은 Bio-Rad (CA, USA)사 제품을 사용하였다.
- 멜라닌 합성은 합성 과정 초기에 작용하는 tyrosinase에 의해 시작되기 때문에 tyrosinase 활성 억제를 주 표적으로 하는 멜라닌 합성 억제제를 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 삼백초 에탄올추출물 7.24g을 4가지 용매로 분획을 실시하였고 헥산분획물 1.63g, 에틸아세테이트분획물 2.72g, 부탄올분획물 0.63g, 물분획물 2.16g 의 시료를 얻었다. 각각의 분획물들이 B16F10 세포에 미치는 독성을 조사한 결과 헥산분획물은 처리 농도 중 가장 고농도인 1 ㎍/ml에서 82±1.
- 실험에 사용된 삼백초(Saururus chinensis BAILL) 는 경북 영천에서 재배된 것을 한약재시장으로부터 구입한 것을 엄선하여 한의학전문대학원 한약 자원개발학과에 보관한 것을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value 를 구하였으며, p<0.05인 경우 *(#)로 표기하였고 p<0.01인 경우 **(##)로 표기하여 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- 세포내 tyrosinase 활성은 Martinez-Esparza 등의 방법19)으로 측정하였다. 6-well 배양용기에 B16F10세포를 8.
- 세포생존율 측정은 Mosmann의 방법18)에 의하여 실시하였다. 24-well 배양 용기에 B16F10 세포를 5×103 개씩 분주하고 24시간 배양 후 삼백초 분획 물을 여러 농도로 처리한 다음 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 배양하였다.
- 그러나 삼백초 물분획물은 유의성 있는 변화를 보이지 않았다. 이러한 삼백초 분획물의 tyorosinase 활성 억제 효능이 tyrosinase에 대한 직접적인 억제 작용 때문인지 알아보기 위하여 cell-free tyrosinase 활성 측정 법을 이용하였다. 배양된 세포로부터 tyrosinase를 추출하여 삼백초 분획물을 효소에 직접 처리함으로써 각각의 분획물이 tyrosinase에 대한 직접적인 억제 효과를 측정하였다.
성능/효과
- B16F10 세포에 각각의 분획물들을 농도별로 처리한 후 세포내에서 합성된 멜라닌 합성 양을 측정한 결과 대조군 100±5.2%와 비교하여 삼백초 헥산분획물은 0.125 ㎍/ml에서 82±12.3%로, 0.25 ㎍/ml에서 70±8.1%로 유의성 있게 멜라닌 합성을 억제하였다(Fig. 4A).
- 각각의 분획물들이 B16F10 세포에 미치는 독성을 조사한 결과 헥산분획물은 처리 농도 중 가장 고농도인 1 ㎍/ml에서 82±1.5%의 생존율을 보였고 실험 농도도 잡은 0.125, 0.25 ㎍/ml에서는 각각 89±3.6%, 88±4.3%의 생존율을 보 였다.
- 과색소침착시 삼백초분획물이 미치는 영향을 알아보고자 α-MSH로 자극하여 tyrosinase 활성을 조사한 결과 B16F10 세포에 α-MSH를 처리하였을 때 대조군 보다 tyrosinase 활성이 현저하게 증가한 것을 관찰할 수 있었다.
- 또한 α-MSH 처리로 증가된 멜라닌 합성도 현저하게 억제하였다.
- 삼백초 분 획물 중 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물이세포독성 없이 세포내 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제함을 알 수 있었다. 또한 세 가지 분획물의 미백 효능은 에틸아세테이트분획물>헥산분획물> 부탄올분획물 순으로 나타난 것으로 미루어 에틸 아세테이트분획물에 미백효능을 나타내는 물질이 가장 많이 존재할 것으로 판단된다. 또한 멜라닌 합성 억제 기전을 밝히기 위하여 추가적인 연구가 필요하다.
- 그러나 에틸아세테이트분획물, 부탄올분획물, 물분획물은 대조군과 비교하여 유의적인 차이는 보이지 않았다. 멜라닌 합성 초기단계에서 속도조절 효소로 작용하는 tyrosinase의 활성에 미치는 영향을 조사한 결과 삼백초 헥산분획물, 에틸아세테이트분획물, 부탄올분획물은 농도의존적인 tyrosinase 활성 억제 효과를 나타냈지만, 삼백초 물분획물은유의적인 차이가 관찰되지 않았다.
- 멜라닌 합성 초기단계에서 중요한 역할을 하는 tyrosinase 활성은 삼백초 헥산분획물과 에틸아세테이트분획물에서 효과적으로 억제되었고, 부탄올분획물에서는 앞선 두 분획물 보다 높은 농도인 10, 20 ㎍/ml에서 비슷한 수준의 억제효과를 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 tyrosinase에 의해 촉매 되는 반응의 최종 산물인 멜라닌의 합성 양에 삼백초 분획물들이 어떠한 영향을 미치는지 측정하고자 하였다.
- . 본 연구에서는 삼백초 에탄올추출물 분획이 멜라닌 합성에 미치는 영향에 대하여 조사하였으며, 이전 보고와 비교했을 때 비슷한 경향을 보였으나 멜라닌 합성 억제효능을 보인 농도가 현저하게 낮아졌고 에틸아세테이트 분획물 뿐만 아니라 헥산과 부탄올 분획물의 미백 효능도 증가되었다. 삼백초의 성분으로 알려진 quercetin이 mushroom tyrosinase 활성을 억제하는 것으로 알려져 있지만 강한 세포독성을 갖고 있고34,35), rutin이 C57BL/6마우스에서 melanoma의 전이를 억제하고 멜라닌 생성을 억제한다고 보고하였다36).
- 부탄올분획물은 각각 105±4.4%, 93±4.7%, 82±3.4%, 70±2.7%, 47±3.1%로 농도의존적인 tyrosinase 활성 억제 효과를 나타냈다(Fig. 2C).
- 삼백초 부탄올분획물은 10㎍/ml에서 251±5.9%, 20 ㎍/ml에서 220±16.8%로 유의성 있는 멜라닌 합성 억제효과가 관찰되었다 (Fig. 5C).
- 세포 독성이 적으면서 멜라닌 합성을 감소시키고, tyrosinase 활성을 억제하는 천연물질의 탐색을 위한 연구의 일환으로 삼백초 에탄올추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획을 실시하여 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 삼백초 분 획물 중 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물이세포독성 없이 세포내 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제함을 알 수 있었다. 또한 세 가지 분획물의 미백 효능은 에틸아세테이트분획물>헥산분획물> 부탄올분획물 순으로 나타난 것으로 미루어 에틸 아세테이트분획물에 미백효능을 나타내는 물질이 가장 많이 존재할 것으로 판단된다.
- 6). 삼백초 분획물 중 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물이 B16F10 세포의 멜라닌 합성과 수지상 돌기 감소 효과를 관찰 할 수있었으며, 이 중 삼백초 에틸아세테이트분획물이 가장 좋은 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
- 삼백초 에틸아세테이트 분획물은 0.0625 ㎍/ml에서 68±6.5%로, 0.125 ㎍/ml 에서 57±5.1%로 현저하게 멜라닌 합성을 억제하였다(Fig. 4B).
- 삼백초 에틸아세테이트분획물은 α-MSH 단독 처리 군이 197±10.0%, α-MSH와 에틸아세테이트분획물 0.0625, 0.125 ㎍/ml 병용처리 군에서 각각 132±3.1%와 113±2.7%로 tyrosinase 활성을 현저하게 억제시켰다(Fig. 3B).
- 삼백초 에틸아세테이트분획물은 0.0625 ㎍/ml에서 184±28.1%, 0.125 ㎍/ml에서 139±24.8%로 가장 좋은 멜라닌 합성 억제효과를 나타냈다(Fig. 5B).
- 삼백초 에틸아세테이트분획물이 처리된 세포는 대조군 보다 멜라닌 합성이 현저하게 감소 하였을 뿐만 아니라 α-MSH 처리로 증가된 멜라닌 합성과 발달된 수지상 돌기를 현저하게 감소시켰다.
- 삼백초 헥산분획물은 0.25 ㎍/ml 농도에서 대조군 보다 멜라닌 합성이 감소된 것을 관찰 할수 있으며, α-MSH 단독 처리군에서 증가된 수지상 돌기와 멜라닌 합성이 α-MSH와 삼백초 헥산분 획물 0.25 ㎍/ml 처리군에서 감소된 것을 관찰 할수 있었다.
- 삼백초 분 획물 중 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물이세포독성 없이 세포내 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제함을 알 수 있었다. 또한 세 가지 분획물의 미백 효능은 에틸아세테이트분획물>헥산분획물> 부탄올분획물 순으로 나타난 것으로 미루어 에틸 아세테이트분획물에 미백효능을 나타내는 물질이 가장 많이 존재할 것으로 판단된다. 또한 멜라닌 합성 억제 기전을 밝히기 위하여 추가적인 연구가 필요하다.
- 세포로부터 분리한 tyrosinase에 삼백초 헥산분획물 0.25 ㎍/ml, 에틸아세테이트분획물 0.125㎍/ml, 부탄올분획물 20 ㎍/ml, 물분획물 20 ㎍/ml, kojic acid 50 ㎍/ml을 각각 처리하고 DOPA oxidation 활성을 측정한 결과 삼백초 분획물 처리군들은 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았은 반면 kojic acid 처리군은 40±2.2 %의 tyrosinase 억제 활성을 보였다(Fig. 7).
- 실험 결과 α-MSH 단일 처리군은 대조군에 비해 302±16.6%로 약 3배로 멜라닌 합성이 증가한 반면 삼백초 헥산분획물 0.125 ㎍/ml에서 190±44.8%, 0.25 ㎍/ml에서 155±22.6%로 멜라닌 합성을 현저하게 감소시켰다(Fig. 5A).
- 배양된 세포로부터 tyrosinase를 추출하여 삼백초 분획물을 효소에 직접 처리함으로써 각각의 분획물이 tyrosinase에 대한 직접적인 억제 효과를 측정하였다. 실험 결과 세포내 tyrosinase 활성을 효과적으로 억제하였던 삼백초 헥산분획물, 에틸아세테이트분획물, 부탄올분획물은 tyrosinase 활성에 대하여 직접적인 억제 활성은 없는 것으로 나타난 반면 양성 대조군으로 사용한 코직산은 tyrosinase 활성에 직접적인 억제 효과를 나타냈다.
- 이러한 결과를 세포 수준에서 관찰하기 위하여 DOPA 염색을 실시한 결과 삼백초 헥산분획물, 에틸아세테이트분획물, 부탄올분획물은 대조군 보다 멜라닌 합성이 감소된 것을 관찰 할 수 있으며, α-MSH 단독 처리군에서 증가된 수지상 돌기와 멜라닌 합성이 α-MSH와 삼백초 분획물 병용 처리군에서 현저하게 감소된 것을 관찰 할 수 있었다.
- 이상의 결과 네 가지 분획물중 세 가지 분획물에서 멜라닌 합성 억제효과가 관찰되었으며 에틸아세테이트>헥산>부탄올 분획물 순으로 멜라닌 합성 억제 효과를 보였다.
- 이상의 결과 삼백초 분획물 중 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물이 세포내 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제할 뿐만 아니라 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다. 세 분획물의 미백 효능은 에틸아세테이트분획물>헥산분획물>부탄올분획물 순으로 나타났다.
- 7). 이상의 실험 결과 삼백초분획물은 tyrosinase에 직접적으로 작용하기 보다는 세포내 대사과정에 영향을 주어 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제하는 것이라 추측할 수 있다.
- 헥산분획물은 농도 의존적으로 tyrosinase 활성이 현저하게 감소되었으며 각각의 농도별로 93±4.4%, 79±3.4%, 54±4.1%, 39±2.2%, 35±3.3%로 측정되었고 (Fig. 2A), 에틸아세테이트분획물은 47±4.2%, 36±3.1%, 32±2.1%, 33±5.1%, 31±4.1%로 tyrosinase 활성을 억제하였다(Fig. 2B).
후속연구
- 그러나 삼백초 물분획물은 미백 효능이 없는 것으로 조사되었다. 따라서 삼백초에 존재 하는 미백 물질은 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에 존재하며, 이중 에틸아세테이트 분획물에 가장 많이 함유되어 있을 것으로 생각되며, 삼백초 분획물의 멜라닌 합성 억제효과가 어떠한 기전을 통한 것인지 더욱 깊이 있는 조사가 필요할 것이다.
- 또한 세 가지 분획물의 미백 효능은 에틸아세테이트분획물>헥산분획물> 부탄올분획물 순으로 나타난 것으로 미루어 에틸 아세테이트분획물에 미백효능을 나타내는 물질이 가장 많이 존재할 것으로 판단된다. 또한 멜라닌 합성 억제 기전을 밝히기 위하여 추가적인 연구가 필요하다.
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