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문제 정의
- 따라서, 형질전환 작물을 개발하고 상업화하기 위해서는 가이드 라인에서 제시하는 평가 자료의 생산과 더불어 지속적이고 안정적인 유전자 발현을 나타내는 이벤트를 선발하는 것이 중요하며, 여기에는 개발 초기단계에서부터 전체 평가를 가늠할 수 있는 실제 개발사례를 포함하는 가이드라인이 필수적이라 할 수 있다. 이런 점을 고려하여, 본 연구에서는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus: CMV) 저항성 유전자변형(genetically modified: GM) 고추(Lee et al., 2009)에 대한 평가분석 연구 사례를 통해 유전자변형작물의 환경위해성 평가를 수행하는데 있어 도입유전자 확인을 위한 평가서 작성을 위해 요구되는 서던 분석(southern blot analysis)을 위한 탐침 포화(probe saturation), 도입유전자의 발현 해석을 위한 RT-PCR, ELISA 실험에 관한 사례를 제시하고자 하였다.
- 또한 유전자변형작물을 개발한 후 정부의 승인을 위한 과학적이고 신뢰할 만한 자료를 축적하기 위해서는 오랜 기간과 많은 자본이 투입된다. 이에 따라, 본 연구에서는 CMV 저항성 유전자변형 고추에 대한 평가분석 연구를 통해 유전자변형작물의 환경위해성 평가를 수행하는데 있어 도입유전자 확인을 위한 평가서 작성을 위해 요구되는 서던 분석을 위한 탐침 포화, 도입유전자의 발현 해석을 위한 RT-PCR, ELISA 실험에 관한 사례를 제시하고자 하였다. 서던 분석을 위해 삽입 유전자 전체 서열의 확인이 가능한 10개의 부분적으로 겹치는 탐침을 제작하였다.
제안 방법
- 3ng을 EcoRI으로 절단하였다. 10개의 탐침 중 CMVP0-CP와 NPTII 프로모터 부위를 대상으로 혼성화 하였고, 아가로스 겔을 이용한 분리 및 서던 분석은 상기와 동일한 방법으로 실시하였다.
- 5μL의 증폭산물을 이용하여 1.0% 아가로스 겔에 전기영동하여, 탐침 제작 여부를 확인하였다.
- A: NPTII probe, B: CAMV35S×2 probe, C: CAMV35S probe, D: CMVP0-CP probe, E: pcFNY1 probe, F: pcFNY2 probe, G: pcFNY3 probe, H: pcFNY4 probe, I: pcFNY5 probe, and J: pcFNY6 probe.
- , 2003). GM 고추에 도입된 유전자의 세대간 유전적 안정성 확인을 위하여 H15, F1, P2377의 gDNA를 NdeI으로 절단하여 서던 분석을 실시하였다. 추가적인 양성 대조구로 형질전환용 플라스미드 0.
- Genomic DNA(gDNA) 30µg을 37℃에서 하룻밤 동안 NdeI 및 NdeI/EcoRI으로 절단한 후 0.8% 아가로스겔에서 전기영동하였다.
- H15, P2377, 및 F1의 부위별로 잎, 과실, 과피, 태좌로 나누고, 과실은 성숙단계 별로 녹과와 적과로 나누어 액체질소로 동결시킨 후 100mg의 시료를 2.0mL 용량의 원심튜브에 넣고, Automill(Tokken Inc., Japan)을 이용하여 마쇄하였다. 마쇄한 시료에 400μL의 RNA 추출 버퍼(Tris-Cl pH 8.
- H15에 존재하는 도입유전자의 세대간 안정성을 평가하기 위하여 H15 및 F1에서 추출한 동량의 gDNA를 이용하여 서던 분석을 실시하였고, 서던 분석은 제시한 분석방법으로 5회 이상 반복적인 결과를 얻었으며, 그 대표결과를 제시하였다(Fig. 3). P2377을 음성대조구로 사용하였고, 형질전환 벡터를 양성대조구로 이용하였다.
- NPTII 단백질의 정량은 양성대조구를 기준으로 환산하여 표기하였고, 외피단백질은 펩타이드 다클론 항체를 이용하여 획득한 표준 방정식(단백질(µg･g-1) = 303.03 × O.D. + 32.939, R2 = 0.9849)을 통해 정량하였다.
- PrimeScriptTM RT-PCR kit(TaKaRa, Japan)을 이용하여 1μg의 total RNA를 주형으로 cDNA를 합성한 후 RT-PCR을 실시하였다.
- 2mL의 1 × Tris-EDTA(TE) 버퍼 첨가 후 RNase를 처리하였다. RNase를 처리한 DNA는 1/10부피의 3M NaOAC와 2.5배의 99% 에탄올을 첨가하여 재침전시킨 후 원심분리 하여 침전물을 회수하였다. 70% 에탄올로 세척한 다음에 건조하여 600µL의 1 × TE 버퍼에 녹인 후 분광광도계(DU 700, Beckman Instruments, USA)로 순도확인 및 정량하였다.
- 9849)을 통해 정량하였다. RT-PCR 및 ELISA 분석은 3반복으로 3회씩 반복하여 재현성을 확인하였다.
- H15의 잎과 과실에서 도입유전자의 발현을 검출하기 위하여 RT-PCR 및 ELISA를 이용하였다. 가식부인 과실은 성숙전･후를 비교하기 위하여 녹과와 적과로 구분하였으며, 각 성숙시기의 과실을 태좌와 과피로 나누어 조직에 따른 발현여부와 발현량를 확인하였다. 또한 도입유전자의 세대 간 안정성 확인을 위해 제작된 F1 교잡종을 이용하여 도입 유전자의 발현을 확인하였다.
- P2377을 음성대조구로 사용하였고, 형질전환 벡터를 양성대조구로 이용하였다. 각 gDNA를 NdeI으로 절단하였으며, 형질전환 고추에서 도입유전자의 좌우 경계구역 외부에 NdeI 절단 부위가 존재하므로 서던 상에서 단일 밴드로 약 5,200bp에서 신호가 검출되도록 하여, H15 및 F1에서 도입유전자의 밴드를 확증하였다. 혼성화를 통한 밴드 검출을 위해 탐침은 CMVP0-CP와 NPTII(Table 1)를 이용하였다.
- , Japan)로 마쇄하여 18mL의 추출 버퍼 첨가 후 65℃에서 30분간 처리하였다. 동량의 CI(chloroform:isoamylalcohol = 24:1, v/v)로 분리 후 원심분리하여 상등액을 다시 동량의 PCI(phenol: chloroform:isoamylalcohol = 25:24:1, v/v/v) 처리 후 한번 더 CI 처리를 하였다. 동량의 isopropanol을 첨가하여 -20℃에서 침전을 촉진시키고 원심분리하여 침전물을 회수하였다.
- 가식부인 과실은 성숙전･후를 비교하기 위하여 녹과와 적과로 구분하였으며, 각 성숙시기의 과실을 태좌와 과피로 나누어 조직에 따른 발현여부와 발현량를 확인하였다. 또한 도입유전자의 세대 간 안정성 확인을 위해 제작된 F1 교잡종을 이용하여 도입 유전자의 발현을 확인하였다. RT-PCR 결과, 유전자 변형 작물인 H15 및 F1 교잡종에 대하여 잎과 과실 발달 시기 및 과실의 부위에 따라 CMV 외피 단백질(675bp) 및 kanamycin 저항성 유전자의 전사(799bp)가 안정적으로 이루어지는 것을 확인하였다(Fig.
- 1). 또한, 도입유전자에는 제한효소 자리가 없는 NdeI과 두 종류의 CaMV35S 프로모터 부위를 사이에 두고 절단하는 EcoRI을 조합하여 절단하는 방법으로 두 단편으로 서던 분석에서 검출신호가 가시화될 수 있도록 하였다. 이때, CaMV35S 프로모터와 혼성화시 결합하지 않는 탐침은 단일밴드로 나타났으나(Figs.
- 마쇄한 시료에 400μL의 RNA 추출 버퍼(Tris-Cl pH 8.0, 10% SDS, 0.5 M EDTA, 0.01% β-mercaptoethanol)를 첨가한 후 섞어 주었다.
- 분석을 위한 시료 준비, 면역반응 및 발색반응 유도는 제품 설명서에 준하여 Triple Antibody Sandwich(TAS) 기법을 이용하였다. 발색반응을 한 시료는 효소면역반응 측정기(Spectramax190, Molecular Device, USA)를 이용하였으며, 외피단백질은 405nm, NPTII 단백질은 450nm에서 흡광도를 측정하였다. NPTII 단백질의 정량은 양성대조구를 기준으로 환산하여 표기하였고, 외피단백질은 펩타이드 다클론 항체를 이용하여 획득한 표준 방정식(단백질(µg･g-1) = 303.
- 본 연구에서는 개발자가 개발 시 주로 제시하는 도입유전자에 의하여 발현되는 단백질의 western blot 분석을 통한 정성적인 자료(Lee et al., 2009) 이외에, 발현이 예상되는 CMV 외피단백질과 NPTII 단백질이 비유전자변형계통(P1: DEY)와 유전자변형 계통(P2: H15) 및 이들의 교잡후대식물체(F1: DEY × H15)에서 부위별(잎, 과실), 발현 시기별(잎, 녹과, 적과), 그리고 가식 부위인 과실의 조직부위별(태좌, 과피)로 발현량을 정량하여 제시하였다.
- 본 연구에서는 고추에 도입된 외래유전자가 단일사본으로 존재함을 입증하기 위하여 서던 분석시 탐침포화 방법을 이용하였는데, 각 탐침의 크기는 524-1,154bp의 범위로(Table 1)하여, 도입유전자 전체를 중복하여 포괄할 수 있도록 설계하였다(Fig. 1). 또한, 도입유전자에는 제한효소 자리가 없는 NdeI과 두 종류의 CaMV35S 프로모터 부위를 사이에 두고 절단하는 EcoRI을 조합하여 절단하는 방법으로 두 단편으로 서던 분석에서 검출신호가 가시화될 수 있도록 하였다.
- 서던 분석에 사용할 탐침제작을 위하여, 본 이벤트의 형질 전환시 사용한 벡터의 전장 염기서열을 바탕으로 프라이머를 설계하였고(Table 1), 도입유전자 내에 존재하는 kanamycin 저항성 유전자, CaMV35S×2 프로모터, 외피 단백질, CAM35S 프로모터 등과 도입유전자의 intervening 서열을 포함한 전체 염기서열에 대한 integrity확인이 가능한 탐침 10가지를(Fig. 1) DIG-labeling PCR 방법으로 제작하였다.
- 서던 분석을 위한 gDNA의 제한효소 자리는 도입유전자에 인접한 고추 게놈의 염기 서열정보를 바탕으로(Seo et al., 2009), 도입유전자 내부를 절단하지 않는 제한효소인 NdeI과 도입유전자 내부에 하나의 제한효소 절단 구역을 갖는 EcoRI과의 조합을 통한 이중절단(NdeI/EcoRI)을 선택하였다. 서던분석 결과, NdeI 단독 절단의 경우는 예상대로 10개의 모든 탐침에서 목적하는 크기인 약 5,200bp의 단편으로, 단일신호가 검출되었다(Fig.
- 이에 따라, 본 연구에서는 CMV 저항성 유전자변형 고추에 대한 평가분석 연구를 통해 유전자변형작물의 환경위해성 평가를 수행하는데 있어 도입유전자 확인을 위한 평가서 작성을 위해 요구되는 서던 분석을 위한 탐침 포화, 도입유전자의 발현 해석을 위한 RT-PCR, ELISA 실험에 관한 사례를 제시하고자 하였다. 서던 분석을 위해 삽입 유전자 전체 서열의 확인이 가능한 10개의 부분적으로 겹치는 탐침을 제작하였다. 서던 분석 결과, 고추에 도입된 외래유전자가 단일사본으로 존재하여, 게놈전체에서 도입된 위치 이외에 상동성을 갖는 다른 조각 부위가 없음을 확인하였으며, 도입유전자 전체의 안정성을 확실히 입증할 수 있었다.
- 선발마커로 사용한 kanamycin 저항성 유전자 및 외피단백질 유전자의 발현을 확인하기 위해 각 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였고, 모든 시료의 안정성을 확인하기 위한 양성대조구로 고추의 18S ribosomal RNA(forward primer: 5’-GACTGTGAAACTGCGAATGG-3’, reverse primer: 5’-TAAGTTTCAGCCTTGCGACC-3’)를 증폭하였다.
- 이는 H15의 도입유전자의 유전요소들이 고추에서 유래하지 않기 때문이다. 유전자 변형 고추의 도입유전자에 대해 포화한 탐침들의 의도된 표적에 대한 혼성 여부를 증명하기 위하여 P2377과 벡터의 각 DNA를 EcoRI으로 절단한 후 1:1의 게놈비율로 혼합하여 양성 대조구로 사용하였다(Fig. 2). 도입유전자를 포함하는 벡터를 EcoRI으로 절단하여 서던 분석시 검출되는 예상 크기는 10,606bp로 모든 탐침에서 동일한 위치에서 신호가 검출되었다.
- 재식거리는 75cm로 각 20주, 보식주로 6주를 정식하였다. 이중 10개체를 임의 선택하여 PCR검정으로 확인된 개체들을 대상으로 각 4반복으로 DNA, RNA, 단백질을 추출하여 사용하였다.
- 인위적으로 의도한 목적유전자와의 혼성화 여부를 확인하기 위해 2.7 × 109bp･C-1의 고추 haploid 게놈 크기를 기준으로 정량한 0.03ng의 형질전환 벡터를 혼합하였다(Yoo et al., 2003).
- 대상 고추 유묘들은 (주)농우바이오(여주, 대한민국)에서 공급받아 안성시 보개면 불현리에 위치한 중앙대학교 안성캠퍼스의 LMO 격리포장에 정식하였다. 재식거리는 75cm로 각 20주, 보식주로 6주를 정식하였다. 이중 10개체를 임의 선택하여 PCR검정으로 확인된 개체들을 대상으로 각 4반복으로 DNA, RNA, 단백질을 추출하여 사용하였다.
- 제조사의 설명서에 준하여 최종 농도가 200μM dNTP(70μM DIG-11-UDP), 0.2μM의 프라이머, 2.6unit의 enzyme mix(3.5U･µL-1), 1xPCR 버퍼(10 × conc. 1.5mM MgCl2 포함)가 되도록 혼합한 다음, 최종 반응 부피 50μL가 되도록 PCR급의 H2O를 첨가하였다.
- RT-PCR은 94℃에서 5분간 초기변성, 94℃ 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 60초의 증폭반응을 40회 반복하였다. 증폭산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 발현을 확인하였다.
- GM 고추에 도입된 유전자의 세대간 유전적 안정성 확인을 위하여 H15, F1, P2377의 gDNA를 NdeI으로 절단하여 서던 분석을 실시하였다. 추가적인 양성 대조구로 형질전환용 플라스미드 0.3ng을 EcoRI으로 절단하였다. 10개의 탐침 중 CMVP0-CP와 NPTII 프로모터 부위를 대상으로 혼성화 하였고, 아가로스 겔을 이용한 분리 및 서던 분석은 상기와 동일한 방법으로 실시하였다.
- 형질전환에 이용된 플라스미드 벡터와 벡터의 염기서열을 ㈜농우바이오에서 제공 받아, 벡터 지도를 제작하고, 유전정보를 바탕으로 선발 마커, 목적 유전자 등의 유전인자 및 도입유전자 서열 전체를 포함하는 탐침용 프라이머를 제작하였다. 탐침 조제는 PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Applied Science, Germany)을 이용하였으며, 1ng의 형질전환 벡터를 주형으로 하였다(Lee et al., 2009). 제조사의 설명서에 준하여 최종 농도가 200μM dNTP(70μM DIG-11-UDP), 0.
- 형질전환에 이용된 플라스미드 벡터와 벡터의 염기서열을 ㈜농우바이오에서 제공 받아, 벡터 지도를 제작하고, 유전정보를 바탕으로 선발 마커, 목적 유전자 등의 유전인자 및 도입유전자 서열 전체를 포함하는 탐침용 프라이머를 제작하였다. 탐침 조제는 PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Applied Science, Germany)을 이용하였으며, 1ng의 형질전환 벡터를 주형으로 하였다(Lee et al.
대상 데이터
- 3). P2377을 음성대조구로 사용하였고, 형질전환 벡터를 양성대조구로 이용하였다. 각 gDNA를 NdeI으로 절단하였으며, 형질전환 고추에서 도입유전자의 좌우 경계구역 외부에 NdeI 절단 부위가 존재하므로 서던 상에서 단일 밴드로 약 5,200bp에서 신호가 검출되도록 하여, H15 및 F1에서 도입유전자의 밴드를 확증하였다.
- (DEY × H15)을 이용하였다. 대상 고추 유묘들은 (주)농우바이오(여주, 대한민국)에서 공급받아 안성시 보개면 불현리에 위치한 중앙대학교 안성캠퍼스의 LMO 격리포장에 정식하였다. 재식거리는 75cm로 각 20주, 보식주로 6주를 정식하였다.
- 본 사례연구를 위하여 CMV저항성 GM고추(계통명: H15, T4 세대), 형질전환 모본인 P2377 계통, 그리고 H15와 비유전자변형 계통과의 교잡후대인 F1(DEY × H15)을 이용하였다.
- 도입유전자 내에서 발현하는 목적유전자인 외피단백질과 선발마커로 이용한 kanamycin 저항성 유전자의 단백질(NPTII)을 ELISA 기법을 이용하여 검출하였다. 외피단백질은 CMV serogroup II ELISA: Reagent set(SRA44800/500, Agdia, USA), kanamycin 저항성 단백질은 neomycin phosphotransferase II ELISA: Complete Kit(PSP 73000/0480, Agdia, USA)를 이용하였다. 분석을 위한 시료 준비, 면역반응 및 발색반응 유도는 제품 설명서에 준하여 Triple Antibody Sandwich(TAS) 기법을 이용하였다.
이론/모형
- 4). H15 및 F1 교잡종의 잎, 녹과 및 적과, 각 과실의 과피와 태좌 부위에서 외피 단백질 및 kanamycin 저항성 유전자의 번역산물인 단백질을 검출하기 위해 ELISA 기법을 이용하였다. 외피 단백질은 잎을 포함한 모든 시료에서 단백질이 발현하는 것으로 나타났다(Fig.
- H15의 잎과 과실에서 도입유전자의 발현을 검출하기 위하여 RT-PCR 및 ELISA를 이용하였다. 가식부인 과실은 성숙전･후를 비교하기 위하여 녹과와 적과로 구분하였으며, 각 성숙시기의 과실을 태좌와 과피로 나누어 조직에 따른 발현여부와 발현량를 확인하였다.
- PrimeScriptTM RT-PCR kit(TaKaRa, Japan)을 이용하여 1μg의 total RNA를 주형으로 cDNA를 합성한 후 RT-PCR을 실시하였다. cDNA합성 및 RT-PCR 조건은 제품 설명서에 준하였다. 선발마커로 사용한 kanamycin 저항성 유전자 및 외피단백질 유전자의 발현을 확인하기 위해 각 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였고, 모든 시료의 안정성을 확인하기 위한 양성대조구로 고추의 18S ribosomal RNA(forward primer: 5’-GACTGTGAAACTGCGAATGG-3’, reverse primer: 5’-TAAGTTTCAGCCTTGCGACC-3’)를 증폭하였다.
- 단백질 발현에 대한 분석은 정성적인 방법으로 western blot 분석법을, 정량적인 방법으로는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 방법을 이용하며, 항체에 대한 정보 제시가 최소한의 요구조건으로 명시되어 있다. 본 연구에서는 개발자가 개발 시 주로 제시하는 도입유전자에 의하여 발현되는 단백질의 western blot 분석을 통한 정성적인 자료(Lee et al.
- 도입유전자 내에서 발현하는 목적유전자인 외피단백질과 선발마커로 이용한 kanamycin 저항성 유전자의 단백질(NPTII)을 ELISA 기법을 이용하여 검출하였다. 외피단백질은 CMV serogroup II ELISA: Reagent set(SRA44800/500, Agdia, USA), kanamycin 저항성 단백질은 neomycin phosphotransferase II ELISA: Complete Kit(PSP 73000/0480, Agdia, USA)를 이용하였다.
- 외피단백질은 CMV serogroup II ELISA: Reagent set(SRA44800/500, Agdia, USA), kanamycin 저항성 단백질은 neomycin phosphotransferase II ELISA: Complete Kit(PSP 73000/0480, Agdia, USA)를 이용하였다. 분석을 위한 시료 준비, 면역반응 및 발색반응 유도는 제품 설명서에 준하여 Triple Antibody Sandwich(TAS) 기법을 이용하였다. 발색반응을 한 시료는 효소면역반응 측정기(Spectramax190, Molecular Device, USA)를 이용하였으며, 외피단백질은 405nm, NPTII 단백질은 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 8% 아가로스겔에서 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gDNA를 nylon membrane(Nylon Membrane positively charged, Roche Applied Science, Germany)으로 transfer한 후, 상기 PCR로 조제한 탐침의 혼성화, 세척, 검출 과정은 제조사의 설명서(Roche Applied Science, 2008)에 준하여 실시하였다. 인위적으로 의도한 목적유전자와의 혼성화 여부를 확인하기 위해 2.
- 각 gDNA를 NdeI으로 절단하였으며, 형질전환 고추에서 도입유전자의 좌우 경계구역 외부에 NdeI 절단 부위가 존재하므로 서던 상에서 단일 밴드로 약 5,200bp에서 신호가 검출되도록 하여, H15 및 F1에서 도입유전자의 밴드를 확증하였다. 혼성화를 통한 밴드 검출을 위해 탐침은 CMVP0-CP와 NPTII(Table 1)를 이용하였다. 양성 대조구인 플라스미드 벡터를 하나의 절단 부위를 가지는 EcoRI으로 절단한 뒤 탐침이 목적 유전자와의 혼성화에 사용될 수 있음을 확인하였다.
성능/효과
- 또한 도입유전자의 세대 간 안정성 확인을 위해 제작된 F1 교잡종을 이용하여 도입 유전자의 발현을 확인하였다. RT-PCR 결과, 유전자 변형 작물인 H15 및 F1 교잡종에 대하여 잎과 과실 발달 시기 및 과실의 부위에 따라 CMV 외피 단백질(675bp) 및 kanamycin 저항성 유전자의 전사(799bp)가 안정적으로 이루어지는 것을 확인하였다(Fig. 4). H15 및 F1 교잡종의 잎, 녹과 및 적과, 각 과실의 과피와 태좌 부위에서 외피 단백질 및 kanamycin 저항성 유전자의 번역산물인 단백질을 검출하기 위해 ELISA 기법을 이용하였다.
- , 2003). 결과적으로, 본 논문에서는 GM 작물의 승인에 요구되는 도입유전자의 부위별, 시기별 단백질 발현량들을 제시할 수 있었고, T4 세대 및 후대 교잡세대에서의 발현량 변화를 통하여 녹과까지의 안정적 발현을 확인할 수 있었다. 또한, 상용 단백질의 검정법을 사용할 경우에는 제품에 대한 원리와 제품번호의 표기가 원칙으로 활성 측정을 위해 다른 방법이 사용되었을 경우 재현 실험을 수행할 수 있는 수준의 방법론을 기술하여야 하는 조건을 충족하였다.
- 서던 분석 결과, 고추에 도입된 외래유전자가 단일사본으로 존재하여, 게놈전체에서 도입된 위치 이외에 상동성을 갖는 다른 조각 부위가 없음을 확인하였으며, 도입유전자 전체의 안정성을 확실히 입증할 수 있었다. 그와 더불어, 역전사 중합효소 연쇄반응 및 효소면역법 실험을 통하여, CMV 저항성 고추의 잎, 과실 등과 같은 주요 기관에서의 삽입 유전자에 대한 안정적인 발현을 확인 할 수 있었다.
- 2). 도입유전자를 포함하는 벡터를 EcoRI으로 절단하여 서던 분석시 검출되는 예상 크기는 10,606bp로 모든 탐침에서 동일한 위치에서 신호가 검출되었다.
- 5%인 287bp만이 CaMV35S 프로모터와 혼성화가 이루어지는 영역이고, 나머지 596bp는 CaMV35S 프로모터 외부로부터 right border까지의 intervening 서열에 혼성화가 이루어지기 때문에, 서던 분석시 혼성화가 이루어지는 단계에서 상동성이 상대적으로 낮은 CaMV35S×2 프로모터 영역과 경쟁적으로 혼성화가 이루어졌기 때문인 것으로 생각된다. 또한, 형질전환 과정에서 사용된 벡터의 전체 염기서열을 바탕으로 T-DNA의 도입부위 이외의 벡터 염기서열의 삽입이 없었음을 서던 분석을 통하여 확인하였고, 형질전환 과정에서 목적 유전자의 도입 외에 비의도적인 염기서열 삽입이 없었음을 알 수 있었다(자료 미제시). 종합적으로, H15의 LMO 환경위해성 평가에서 분자생물분야에서 요구하는 도입유전자의 확인사항에서 탐침포화(pcFNY1-6)를 통하여 단일사본으로 존재함과 기타 도입유전자 조각이 존재하지 않음을 충족시킬 수 있었다.
- 서던 분석을 위해 삽입 유전자 전체 서열의 확인이 가능한 10개의 부분적으로 겹치는 탐침을 제작하였다. 서던 분석 결과, 고추에 도입된 외래유전자가 단일사본으로 존재하여, 게놈전체에서 도입된 위치 이외에 상동성을 갖는 다른 조각 부위가 없음을 확인하였으며, 도입유전자 전체의 안정성을 확실히 입증할 수 있었다. 그와 더불어, 역전사 중합효소 연쇄반응 및 효소면역법 실험을 통하여, CMV 저항성 고추의 잎, 과실 등과 같은 주요 기관에서의 삽입 유전자에 대한 안정적인 발현을 확인 할 수 있었다.
- 서던 분석에서 2,887bp 절편에 결합할 것으로 예상한 탐침은 목표 유전자부위 특이적인 NPTII 및 CaMV35S×2와, pcFNY1, pcFNY2, pcFNY3이며, 이때 NPTII와 pcFNY1(Figs. 2A and 2E)는 단일신호가 검출되었고, CaMV35S×2 프로모터에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침들인 CaMV35S×2, pcFNY2, pcFNY3(Figs. 2B, 2F, and 2G)는 예상된 위치에서 두 단편 모두에서 결합한 결과가 나타났다.
- , 2009), 도입유전자 내부를 절단하지 않는 제한효소인 NdeI과 도입유전자 내부에 하나의 제한효소 절단 구역을 갖는 EcoRI과의 조합을 통한 이중절단(NdeI/EcoRI)을 선택하였다. 서던분석 결과, NdeI 단독 절단의 경우는 예상대로 10개의 모든 탐침에서 목적하는 크기인 약 5,200bp의 단편으로, 단일신호가 검출되었다(Fig. 2A-J). NdeI/EcoRI으로 절단하는 경우는 약 2,887와 2,287bp의 두 단편에 대한 혼성화 결과를 보여주었다.
- 혼성화를 통한 밴드 검출을 위해 탐침은 CMVP0-CP와 NPTII(Table 1)를 이용하였다. 양성 대조구인 플라스미드 벡터를 하나의 절단 부위를 가지는 EcoRI으로 절단한 뒤 탐침이 목적 유전자와의 혼성화에 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 이형접합체인 F1에서 검출된 신호가 H15 및 플라스미드 벡터에 비해 상대적으로 낮게 나타났다.
- , 2009) 이외에, 발현이 예상되는 CMV 외피단백질과 NPTII 단백질이 비유전자변형계통(P1: DEY)와 유전자변형 계통(P2: H15) 및 이들의 교잡후대식물체(F1: DEY × H15)에서 부위별(잎, 과실), 발현 시기별(잎, 녹과, 적과), 그리고 가식 부위인 과실의 조직부위별(태좌, 과피)로 발현량을 정량하여 제시하였다. 전체적으로 이형접합 세대인 F1에서는 유전자가 도입된 동형접합 부본인 H15보다 상대적으로 단백질 발현량이 동등하거나 낮았으며, 이는 비유전자변형계통(DEY)과의 교잡후대에서 도입유전자의 초우성 혹은 상위작용에 의한 목적단백질의 과다발현은 이루어지지 않았음을 의미한다. 또한 유전자투입효과(gene dosage effect)의 측면에서, 도입유전자가 이형접합상태보다 동형접합상태에서 발현수준이 높다는 기존의 연구(Beaujean et al.
- 또한, 형질전환 과정에서 사용된 벡터의 전체 염기서열을 바탕으로 T-DNA의 도입부위 이외의 벡터 염기서열의 삽입이 없었음을 서던 분석을 통하여 확인하였고, 형질전환 과정에서 목적 유전자의 도입 외에 비의도적인 염기서열 삽입이 없었음을 알 수 있었다(자료 미제시). 종합적으로, H15의 LMO 환경위해성 평가에서 분자생물분야에서 요구하는 도입유전자의 확인사항에서 탐침포화(pcFNY1-6)를 통하여 단일사본으로 존재함과 기타 도입유전자 조각이 존재하지 않음을 충족시킬 수 있었다.
- 2B, 2F, and 2G)는 예상된 위치에서 두 단편 모두에서 결합한 결과가 나타났다. 한편, 서던 분석으로 2,287bp의 절편에 결합할 것으로 예상된 탐침들은 CMVP0-CP와 CaMV35S, pcFNY4, pcFNY5, pcFNY6이며, CMVP0-CP, pcFNY4와 pcFNY6(Figs. 2C, 2H, and 2J)는 단일신호가 검출되었고, CaMV35S와 pcFNY5(Figs. 2C and 2I)는 각 단편에 해당하는 두 개의 신호가 검출되어 gDNA의 각 단편에 존재하는 CaMV35S 프로모터와의 상동성으로 인한 결합이 존재함을 시사하였다. 음성대조군으로 사용한 형질전환체의 모본인 P2377에서는 10개의 모든 탐침에서 신호가 검출되지 않았다.
후속연구
- 본 연구에서 제시한 CMV 저항성 GM 고추의 도입유전자의 확인 및 발현의 안정성에 관련한 위해성평가 자료 생산의 구체적 사례들은, 향후 다양하게 GM 작물을 개발하고자 하는 개발자 및 상용화를 위한 심사청구자에게 중요한 지침으로 활용될 것을 기대한다.
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