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문제 정의
- 최근에는 국민 소득의 향상과 노령화 등 사회적 변화에 따라 건강에 대한 관심도가 고조되면서 각종 건강보조식품이 개발되고 그 수요 또한 증가하고 있는 실정이다(16). 따라서 본 연구에서는 스테비아는 앞에서 언급한 바와 같이 이용성이 높은 식물임에도 불구하고 diterpene 성분에 대한 생리활성이 과학적으로 주로 연구된 바 없어 항염증 효과를 규명하기 위한 일환으로 스테비아로부터 diterpene 주요성분인 austroinulin 화합물을 분리 정제하고, 이를 이용한 RAW 246.7 세포주에 대한 염증 억제 효과를 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 17(2H, br d, J =17 Hz)을 관찰하였다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 전형적으로 3-methylpenta-2,4-dienyl에서 관찰되는 6개의 탄소 피크를 관찰하였다. 특히 d 113.
- 분리된 austroinulin 화합물은 흰색의 분말로서 LC/MS를 통해 분자이온[M]+의 피크가 m/z=322를 확인하였다. 1H-NMR 스펙트럼의 양성자(proton) 개수와 13C-NMR 탄소 개수를 고려하면 화합물은 C20H34O3의 분자식을 갖는 화합물로 확인하였다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 quaternary methyls이 d 0.
- Methanol층을 H2O/ethyl acetate로 분획하여 diterpenoid glycoside가 완전히 제거된 ethyl acetate 분획물을 얻었다. Ethyl acetate 분획물을 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 통해 active-guided fractionation하여 분리하였다. 이때 n-hexane-acetone(50:1→1:1) 혼합용매를 이용하여 용매의 극성을 변화시키면서 용출시키고, TLC pattern에 따라서 fraction 하였다.
- 농축한 스테비아 80% 에탄올 추출물로부터 diaion 칼럼 크로마토그래피 실시하여 클로로필을 제거한 methanol층을 얻었다. Methanol층을 H2O/ethyl acetate로 분획하여 diterpenoid glycoside가 완전히 제거된 ethyl acetate 분획물을 얻었다. Ethyl acetate 분획물을 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 통해 active-guided fractionation하여 분리하였다.
- RAW264.7 세포를 최종농도 2×105 cells/mL가 되도록 100 mm dish에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후, austroinulin을 2.5, 5, 10 μg/mL의 농도로 전 처리하고 1시간 후에 LPS 1 μg/mL를 처리한 후, 20시간 동안 배양하였다.
- RAW264.7 세포를 최종농도 2×105 cells/mL가 되도록 96 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, austroinulin을 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL의 농도로 첨가하여 24시간 배양하였다.
- 반응 후 TBS-T buffer로 10분간 3번 세척한 후 2차 anti-rabbit IgG conjugated HRP를 실온에서 2시간 반응시켰다. TBS-T buffer로 10분간 3번 세척하고 enhanced chemiluminescence detection system(Amersham Pharmacia, Bucks, UK)를 사용하여 iNOS 단백질을 확인하였다.
- 본 연구에서는 스테비아는 이용성이 높은 식물임에도 불구하고 diterpene 성분에 대한 생리활성이 과학적으로 주로 연구된 바 없어 active-guided fractionation 방법을 이용하여 항염증 효과를 나타내는 지표화합물을 규명하기 위해 실리카겔 칼럼크로마토그래피 방법을 이용하여 분리 및 정제한 후, 1H와 13C-NMR, COSY, DEPT, HMQC, HMBC spectrum(500 MHz, CDCl3), MS, IR 분석을 통하여 분자량 322의 astroinulin임을 구조 동정하였다. 특히 HMBC spectrum을 통해 분리된 화합물이 decalin system에서 C-9에 3-methylpenta-2,4-dienyl 치환체를 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 스테비아에서 분리한 austroinulin에 대해 iNOS를 저해하는 효과가 있는지 알아보기 위하여 RAW264.7 세포에 LPS(1 μg/mL)를 처리하고 1시간 뒤, 스테비아에서 분리한 austroinulin 화합물을 2.5, 5, 10 μg/mL로 처리한 후 20시간 배양한 후 iNOS protein의 발현율 변화를 western blotting으로 확인하였다.
- 스테비아의 80% 에탄올 추출물로부터 active-guided fractionation하여 분리된 단일 화합물의 구조분석은 JNMECA 500 spectrometer(Jeol, Tokyo, Japan)를 사용하여 1D, 2D-NMR 스펙트럼과 LC/MS(Agilent 1100 series, Boeblingen, Germany)를 이용하여 MS를 측정하였고, 기존문헌의 측정값과 비교하여 구조를 분석하였다. 분리된 austroinulin 화합물은 흰색의 분말로서 LC/MS를 통해 분자이온[M]+의 피크가 m/z=322를 확인하였다.
- 얻어진 추출물을 실리카겔 칼럼에서(10×30 cm, 230～400 mesh, 700 g) hexane : acetone(50:1, 40:1, 20:1, 10:1, 8:1, 6:1, 3:1, 1:1)으로 순차적으로 용출시켜 7개의 subfraction(1-7)을 얻었다.
- 음건 세절한 스테비아 시료 1 kg을 80% 에탄올(20 L×3)로 실온에서 3일간 추출하였다.
- 39(1H, t, J =10 Hz)이었다. 전형적으로 3-methylpenta-2,4-dienyl에서 관찰되는 2개의 olefinic hydrogens d 5.43(1H, t, J =6.6 Hz), 6.83(1H, d, J =17 Hz)과 1개의 methylene d 5.08, 5.17(2H, br d, J =17 Hz)을 관찰하였다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 전형적으로 3-methylpenta-2,4-dienyl에서 관찰되는 6개의 탄소 피크를 관찰하였다.
- 추출액을 감압 농축시켜 340 g의 흑갈색의 조추출물을 얻었다. 추출물을 다이아이온 칼럼을 통해 H2O, methanol, CHCl3 층으로 나누었다. 그 다음 methanol 층을 H2O와 ethyl acetate(1:1) 혼합용액 2,000 mL와 함께 분획여두에 넣고 실온에서 3시간, 3회 반복하여 분획한 후 ethyl acetate 분획물 50 g을 얻었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 column chromatography 충진물로서 silica gel 60(70-230 mesh, Merck, Darmstadt, Germany)와 diaion HP-20(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며, 물질분리 및 확인을 위한 thin-layer chromatography(TLC)는 pre-coated silica gel 60(0.25 mm, Merck) plat를 사용하였다. 그 외 용매 및 시약류는 분석용 특급 또는 1급 시약을 각각 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 스테비아는 2010년 10월 전라북도 정읍시에서 수확한 것을 구입하여 사용하였으며, 건조된 상태로 저온(-5℃)에서 보관하면서 실험재료로 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 마우스 대식세포주 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 10% fetal bovine serum(FBS; Hyclone, Logan, UT, USA)와 100 units/mL of penicillin, 100 mg/mL of streptomycin을 첨가한 DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 세포밀도가 높아지면 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- (Chicago, IL, USA) version 18.0을 이용하였으며, one-way analysis of variance(ANOVA)를 시행하여 p<0.05인 경우를 유의적인 것으로 판정하였다.
- 모든 실험은 3회 반복실험에 대한 평균(mean)±표준편차(standard deviation; SD)로 나타내었다.
이론/모형
- 세포독성은 EZ-Cytox cell viability assay kit(DAEIL lab, Seoul, Korea)를 사용하여, 제조사의 실험방법에 따라서 측정하였다. RAW264.
성능/효과
- Astroinulin 화합물을 10 μg/mL의 낮은 농도에서 NO와 iNOS를 각각 67.9, 45.1%를 저해하는 결과를 나타내었다.
- 2). HMBC를 비롯한 2D-NMR을 통해 화합물은 decalin system에서 C-9에 3-methylpenta-2,4-dienyl 치환체를 가지고 있음을 추론할 수 있었다(Fig. 3). 이상의 분광학적인 자료를 종합하면 화합물은 austroinulin로 확인되었으며 문헌에 보고된 분광학적인 자료와 일치하였다(17,18).
- LPS를 첨가하지 않은 군에서는 8～10%의 NO를 생성하였고, austroinulin 화합물을 2.5, 5, 10 μg/mL로 처리한 결과에서 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제하는 것으로 관찰되었으며, 10 μg/mL에서 NO의 생성을 67.9%를 억제하였다.
- 본 연구에서 처리한 실험군의 농도 0∼40 μg/mL에서 95% 이상의 생존율을 보여 스테비아에서 분리한 austroinulin 화합물은 세포독성을 가지지 않는 것으로 나타났다.
- 분리된 astroinulin을 RAW264.7 세포에 2.5, 5, 10 μg/mL 처리한 결과 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제하였다.
- 스테비아의 80% 에탄올 추출물로부터 active-guided fractionation하여 분리된 단일 화합물의 구조분석은 JNMECA 500 spectrometer(Jeol, Tokyo, Japan)를 사용하여 1D, 2D-NMR 스펙트럼과 LC/MS(Agilent 1100 series, Boeblingen, Germany)를 이용하여 MS를 측정하였고, 기존문헌의 측정값과 비교하여 구조를 분석하였다. 분리된 austroinulin 화합물은 흰색의 분말로서 LC/MS를 통해 분자이온[M]+의 피크가 m/z=322를 확인하였다. 1H-NMR 스펙트럼의 양성자(proton) 개수와 13C-NMR 탄소 개수를 고려하면 화합물은 C20H34O3의 분자식을 갖는 화합물로 확인하였다.
- 그에 대한 활성 측정결과 용출액 중 subfraction 5에서 NO에 대한 활성 효과를 보였다. 용출액 중 subfraction 5를 n-hexane-ethyl acetate 혼합용매에서 극성을 변화시켜가며 2차 실리카겔 칼럼크로마토그래피 하여 분리한 결과 TLC pattern에서 용출액 중 fraction 8-12에서 main point인 1개의 화합물을 분리하였고, UV spectrum 254 nm에서 TLC 확인 결과 단일 화합물임을 알 수 있었다(Fig. 1).
- 이때 austroinulin 화합물을 2.5, 5, 10 μg/mL 농도로 처리한 결과 iNOS protein 발현율은 각각 11.4, 26.8, 45.1%를 감소시켜 우수한 활성이 관찰되었다(Fig. 6).
- 3). 이상의 분광학적인 자료를 종합하면 화합물은 austroinulin로 확인되었으며 문헌에 보고된 분광학적인 자료와 일치하였다(17,18).
- ), MS, IR 분석을 통하여 분자량 322의 astroinulin임을 구조 동정하였다. 특히 HMBC spectrum을 통해 분리된 화합물이 decalin system에서 C-9에 3-methylpenta-2,4-dienyl 치환체를 가지고 있음을 알 수 있었다. 분리된 astroinulin을 RAW264.
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