Cotton을 효모 세포($Pichia$$stipitis$)의 고정화 담체로 사용하기 위하여 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride (DEAE HCl)로 derivatization 시켰다. 0.5 M DEAE HCl로 처리하였을 때, 효모 세포가 완전히 흡착하였으며, 이것은 DEAE-cotton g 당 101.8 mg의 효모 세포가 흡착하는 것이고, DEAE-cellulose에 효모 세포가 흡착하는 양의 약 6배 이상인 것으로 확인되었다. DEAE-cotton을 이용하여 효모 세포를 고정화하고, 이것을 ethanol 생산에 이용하였을 경우, glucose와 xylose가 포함된 배지에서 단당류에 대한 ethanol 수율로 0.33 정도로 ethanol을 생산 할 수 있다는 것을 실험적으로 확인하였다. 이를 이용하여 lignocellulosic bomass의 가수분해물로부터 bioethanol 생산에 이용될 수 있을 것으로 기대되어진다. DEAE-cotton에서 얻어진 결과는 DEAE-cellulose에서 같은 실험을 실시하여 서로 비교 분석하였다.
Cotton을 효모 세포($Pichia$$stipitis$)의 고정화 담체로 사용하기 위하여 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride (DEAE HCl)로 derivatization 시켰다. 0.5 M DEAE HCl로 처리하였을 때, 효모 세포가 완전히 흡착하였으며, 이것은 DEAE-cotton g 당 101.8 mg의 효모 세포가 흡착하는 것이고, DEAE-cellulose에 효모 세포가 흡착하는 양의 약 6배 이상인 것으로 확인되었다. DEAE-cotton을 이용하여 효모 세포를 고정화하고, 이것을 ethanol 생산에 이용하였을 경우, glucose와 xylose가 포함된 배지에서 단당류에 대한 ethanol 수율로 0.33 정도로 ethanol을 생산 할 수 있다는 것을 실험적으로 확인하였다. 이를 이용하여 lignocellulosic bomass의 가수분해물로부터 bioethanol 생산에 이용될 수 있을 것으로 기대되어진다. DEAE-cotton에서 얻어진 결과는 DEAE-cellulose에서 같은 실험을 실시하여 서로 비교 분석하였다.
In this study, DEAE-cotton [derivatized by 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride (DEAE HCl)] was prepared as a carrier for immobilized $Pichia$$stipitis$ for ethanol production. When cotton was derivatized with 0.5 M DEAE HCl, the yeast cell suspension was adsorbed at 1...
In this study, DEAE-cotton [derivatized by 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride (DEAE HCl)] was prepared as a carrier for immobilized $Pichia$$stipitis$ for ethanol production. When cotton was derivatized with 0.5 M DEAE HCl, the yeast cell suspension was adsorbed at 100% of the initial cell $OD_{600}$. The adsorbed yeast cells were estimated to be 101.8 mg-dry cells/g-DEAE-cotton. In particular, when a flask culture using the immobilized yeast cells was conducted in a glucose and xylose-containing medium, the yeast cells on the DEAE-cotton gradually produced ethanol, according to glucose and xylose consumption; the ethanol yield was approximately 0.33 g-ethanol/g-monosaccharide. Because DEAE-cotton was successfully used as a carrier for ethanol production from a glucose and xylose-containing medium, we expect that this bioethanol production process may be used for the bioethanol production process from the hydrolysate of lignocellulosic biomass. All the results of DEAE-cotton were compared with those of DEAE-cellulose as a carrier for immobilization.
In this study, DEAE-cotton [derivatized by 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride (DEAE HCl)] was prepared as a carrier for immobilized $Pichia$$stipitis$ for ethanol production. When cotton was derivatized with 0.5 M DEAE HCl, the yeast cell suspension was adsorbed at 100% of the initial cell $OD_{600}$. The adsorbed yeast cells were estimated to be 101.8 mg-dry cells/g-DEAE-cotton. In particular, when a flask culture using the immobilized yeast cells was conducted in a glucose and xylose-containing medium, the yeast cells on the DEAE-cotton gradually produced ethanol, according to glucose and xylose consumption; the ethanol yield was approximately 0.33 g-ethanol/g-monosaccharide. Because DEAE-cotton was successfully used as a carrier for ethanol production from a glucose and xylose-containing medium, we expect that this bioethanol production process may be used for the bioethanol production process from the hydrolysate of lignocellulosic biomass. All the results of DEAE-cotton were compared with those of DEAE-cellulose as a carrier for immobilization.
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문제 정의
Cotton을 효모 세포의 고정화 담체로 사용하기 위하여, cotton을 DEAE로 derivatization 시키는 최적조건에 대하여 연구하였다. Fig.
본 연구에서는 먼저 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose에 효모 세포를 흡착시키는 최적의 조건에 대하여 조사하였다. 그리고, 최적의 조건에서 효모 세포를 흡착시킨 후, glucose와 xylose가 들어 있는 배지에 넣어 배양하여, 세포성장, 단당류 소비, 그리고 ethanol 생산 등에 대하여 조사하였다.
본 연구에서는 이러한 선행연구결과를 바탕으로 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride [DEAE·HCl, (C2H5)2NCH2CH2Cl·HCl] 으로 cotton (탈지면)을 derivatization하여 cellulose로 이루어진 cotton을 효모 세포의 고정화 담체로서 사용하기 위한 연구를 시도하였다.
본 연구에서 glucose와 xylose가 들어간 배지를 사용하여 흡착 고정화된 효모로 ethanol 생산을 연구한 이유는, 많은 lignocellulosic biomass의 가수분해물에는 육탄당인 glucose 뿐만 아니라 오탄당인 xylose가 포함되어있기 때문이다. 즉, DEAE-cotton을 육탄당과 오탄당이 포함된 가수분해물에서 ethanol을 생산하는 공정의 담체로 이용하기 위하여서였다.
제안 방법
DEAE-cotton의 효모 흡착을 위한 담체로서의 성능을 비교 하기 위하여 시판되고 있는 DEAE-cellulose와 비교 실험을 수행하였다. Fig.
Fig. 1과 같이 여러가지 DEAE·HCl 농도(0.0-2.0 M)로 처리한 0.1 g의 DEAE-cotton에 효모 세포(OD600=2.9, 5.0, 7.1)를 흡착시켜 보았다.
DEAE-cotton의 효모 흡착을 위한 담체로서의 성능을 비교 하기 위하여 시판되고 있는 DEAE-cellulose와 비교 실험을 수행하였다. Fig. 4와 같이 먼저 효모 세포를 증류수에 현탁시킨 후, 효모 세포와 DEAE-cellulose와의 흡착을 관찰하였다. 이 때 효모 세포의 OD600은 1.
Glucose 와 xylose의 양은 thin-layer chromatography (TLC)를 이용하여 분석하였으며, TLC plate (Partisil® K5F, Whatman)는 20×10 cm로 잘라서 사용하였고, 시료는 1 μl를 loading 하였으며, 전개용매는 acetonitrile과 증류수를 85:15 비율로 혼합하여 사용하였다.
5% α -naphtol, 5% H2SO4 in ethanol)에 담갔다 꺼낸 후, dry oven에 넣고 80℃에서 15분간 말려서 발색시켰다. Glucose, isomaltodextrin와 maltodextrin이 TLC plate 상에서 나타내는 spot의 강도와 그들 농도와의 관계가 선형적으로 비례하였다 는 Robyt와 Mukerjea의 논문[15]에서의 이론을 근간으로 glucose와 xylose의 양은 TLC를 통하여 정량분석 하였으며, 이 때 단당류의 정량 분석을 위해서 단당류의 spot을 AlphaEase FC softwere (Alpha Innotech, USA)를 이용하여 일차원상의 peak로 전환한 후, 농도를 알고 있는 표준물질과 비교하여 단 당류의 함량을 계산하였다.
3C). 그러나 보다 완전한 효모 세포의 흡착을 위하여 OD600이 7.6의 효모를 사용하는 조건을 최적 조건으로 하고, 다음 실험에 적용하였다.
효모가 고정화된 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose를 증류수로 씻은 후, 60℃에서 24시간 건조한다[5]. 그리고 scanning electron microscope (ESEM, FEI QuantaTM 400, The Netherlands)를 이용하여 관찰하였다.
본 연구에서는 먼저 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose에 효모 세포를 흡착시키는 최적의 조건에 대하여 조사하였다. 그리고, 최적의 조건에서 효모 세포를 흡착시킨 후, glucose와 xylose가 들어 있는 배지에 넣어 배양하여, 세포성장, 단당류 소비, 그리고 ethanol 생산 등에 대하여 조사하였다. 특히, cotton에 “DEAE-“ 를 붙인 담체가 효모를 이용한 ethanol 생산용 담체로서 이용 가능하다는 것을 보여 주려고 하였으며, 그 성능을 DEAE-cellulose와 비교하여 분석하였다.
7A의 결과로 보아서 세포가 잘 흡착되어 자라면서 glucose와 xylose를 소비하고, ethanol을 생산 하였다는 것을 추론 할 수 있었다. 담체에 효모 세포가 흡착된 것을 직접 관찰하기 위하여 Fig. 6과 Fig. 7의 flask culture를 수행 후, 제일 마지막 sampling 후 남아있는 효모 세포가 흡착된 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose를 수확하여 전자현미경으로 Fig. 8과 같이 관찰하였다. 400배, 1400 배, 3000배의 배율에서 섬유상 구조의 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose 표면에 효모 세포가 흡착되어 있음을 관찰할 수 있었다.
위와 같이 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose에 흡착된 효모 세포를 ethanol 생산에 적용하여, 그 성능을 비교분석하기 위하여, 육탄당인 glucose와 오탄당인 xylose가 포함된 배지에서 배양실험을 실시하였다. 이 때 효모를 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose에 흡착 고정화 시킨 후, 배지가 포함된 flask에 옮겨 배양을 시작하였으며, flask 배지 내의 free cell 농도, glucose와 xylose의 소비, 그리고 ethanol 생성을 관찰하였다 (Fig.
이 때 Fig. 1과 같이 0.1 g의 cotton을 여러가지 농도의 DEAE·HCl (0.0-2.0 M)로 처리하였고, 효모 세포의 OD600은 2.8과 6.2로 조절하였다.
이 때 앞의 두 실험의 결과에서 얻은 최적의 DEAE·HCl 농도인 0.5 M로 cotton을 처리하였고, cotton은 0.1에서 0.2, 0.4 g으로 증가시켰다.
5). 이 때 효모 세포의 OD600은 1.2, 2.9, 7.2로 조절하였고 DEAE-cellulose는 0.1 g에서 1.0 g까지의 양으로 조절하였다. 그 결과 효모 세포가 DEAE-cellulose에 완전히 흡착하는 조건을 관찰할 수 있었다.
위와 같이 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose에 흡착된 효모 세포를 ethanol 생산에 적용하여, 그 성능을 비교분석하기 위하여, 육탄당인 glucose와 오탄당인 xylose가 포함된 배지에서 배양실험을 실시하였다. 이 때 효모를 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose에 흡착 고정화 시킨 후, 배지가 포함된 flask에 옮겨 배양을 시작하였으며, flask 배지 내의 free cell 농도, glucose와 xylose의 소비, 그리고 ethanol 생성을 관찰하였다 (Fig. 6, 7). Fig.
이와 같은 세포 흡착 정도를 증가 시키기 위하여, 이번에는 YPDX 배지에 세포를 현탁시킨 후, DEAE·HCl로 처리된 cotton의 양을 증가 시키는 실험을 수행하여 보았다.
즉, 효모의 세포 표면이 주로 negative charge를 가지는 것으로 알려져 있기 때문에[1], 효모와 cotton과의 흡착력을 증가시키기 위하여, 중성 pH에서 positive charge를 가지는 ligand인 “DEAE-“(pK=11.5)를 가지도록 DEAE·HCl을 처리하였다.
특히, cotton에 “DEAE-“ 를 붙인 담체가 효모를 이용한 ethanol 생산용 담체로서 이용 가능하다는 것을 보여 주려고 하였으며, 그 성능을 DEAE-cellulose와 비교하여 분석하였다.
1의 실험은 증류수에 효모 세포를 현탁시킨 환경에서 수행한 실험이었다. 효모 세포의 활성을 고정화 단계에서 좀 더 잘 유지하고, 배양환경으로 효모 세포의 보다 빠른 적응을 위하여, Fig. 2와 같이 YPDX 배지에서 DEAE-cotton과 효모 세포와의 흡착을 조사하였다. 이 때 Fig.
효모성장은 spectrophotometer (Spectronic, Thermo Scientific, USA)로 600 nm에서 optical density (OD600)를 측정하여 monitoring하였으며, 배양액 중의 에탄올 함량은 gas chromatography (8610C, SRI, USA)를 이용하여 분석하였다. 이때 컬럼은 Chromosomb 101 [L=6 ft, ID=1/8 inch, 80/100 mesh, stainless steel tubing (Alltech, USA)]을 사용하였고, 자세한 운전 조건은 선행 논문에 설명하였다[23-25].
대상 데이터
2-(Diethylamino)ethyl chloride hydrochloride (DEAE·HCl) 그리고 DEAE-cellulose는 각각 Acros (USA)와 Sigma-Aldrich (USA) 것을 사용하였다.
yeast extract와 peptone은 Becton Dickinson (USA) 것을 사용하였고, acetonitrile과 α-naphtol은 Daejung Chemical Co. (Korea)과 Sigma-Aldrich (USA) 제품을 사용하였다.
본 연구에서는 육탄당과 오탄당을 이용하여 ethanol을 생산할 수 있는 효모 Pichia stipitis (P. stipitis) CBS 7126을 사용하였다.
성능/효과
7C처럼 glucose를 완전히 소비한 후 xylose를 소비하면서 ethanol을 생성함을 확인하였다.
8과 같이 관찰하였다. 400배, 1400 배, 3000배의 배율에서 섬유상 구조의 DEAE-cotton과 DEAE-cellulose 표면에 효모 세포가 흡착되어 있음을 관찰할 수 있었다.
3C 에서는 DEAE-cotton 양의 증가로 효모 세포와 DEAE-cotton간의 완전한 흡착이 관찰되었다. 결론적으로 여러가지 최적 조건을 유추 할 수 있었으나, DEAE-cotton이 0.4 g이고 효모 세포의 OD600이 9.6 이하일 때에 적어도 1시간 내에 거의 100% 흡착이 일어날 수 있음을 확인하였다(Fig. 3C). 그러나 보다 완전한 효모 세포의 흡착을 위하여 OD600이 7.
결론적으로, cotton을 DEAE·HCl로 처리한 DEAE-cotton은 효모를 이용한 ethanol 생산에 담체로서 사용되어질 수 있다는 것을 확인 하였으며, 특히 lignocellulosic biomass의 가수분해물에 포함될 수 있는 glucose와 xylose가 함유된 배지에서 두 단당류를 이용하여 ethanol 생산이 가능하다는 것을 보여주었다.
그 결과 Fig. 2와 같이 cotton을 DEAE·HCl 농도 0.5 M로 처리하였을 때, 가장 많은 효모가 DEAE-cotton에 흡착하였다.
그 결과 효모 세포 농도가 2.9일 경우에는 0.25에서 2.0 M DEAE·HCl, 효모 세포 농도가 5.0 혹은 7.1일 경우에는 0.25에서 1.0 M의 DEAE·HCl로 cotton을 처리하였을 때, 적어도 3시간 정도 효모세포를 흡착을 시키면, 약 95% 이상의 세포가 세포농도와 관계없이 DEAE-cotton에 붙을 수 있음을 확인 하였다.
0 g까지의 양으로 조절하였다. 그 결과 효모 세포가 DEAE-cellulose에 완전히 흡착하는 조건을 관찰할 수 있었다. 이 때도 전체적인 흡착 정도가 효모 세포를 증류수에 현탁 시킨 것 보다 떨어졌으며, 그 이유는 위에 언급한 바와 같이 배지 성분 때문인 것으로 추론된다.
0 g까지 변화를 주었다. 그 결과 효모 세포의 농도에 따라 차이가 있었으나, Fig. 4A와 Fig. 4B에서는 0.1 g 이상의 DEAE-cellulose로 30분 정도에 모든 효모 세포가 흡착됨이 관찰되었다. 그리고 Fig.
본 연구에서 두 가지 담체 안의 효모 세포의 농도를 직접 측정하지는 못하였지만, Fig. 6A와 Fig. 7A의 결과로 보아서 세포가 잘 흡착되어 자라면서 glucose와 xylose를 소비하고, ethanol을 생산 하였다는 것을 추론 할 수 있었다. 담체에 효모 세포가 흡착된 것을 직접 관찰하기 위하여 Fig.
이 때도 전체적인 흡착 정도가 효모 세포를 증류수에 현탁 시킨 것 보다 떨어졌으며, 그 이유는 위에 언급한 바와 같이 배지 성분 때문인 것으로 추론된다. 이 결과를 바탕으로 우리는 효모 세포 OD600 2.9에 1.0 g의 DEAE-cellulose를 사용 할 경우에 적어도 1시간 반 내에는 효모 세포가 모두 흡착할 수 있다는 결론을 얻었으며, 이를 다음 실험의 최적 조건으로 사용하였다.
5 mg/g으로 계산되어진다. 이는 DEAE-cotton 이 DEAE-cellulose에 비해 6배 이상의 효모에 대한 흡착능력을 가지고 있다는 것을 의미하며, DEAE-cotton이 보다 더 효율적인 세포고정화 담체로서 사용되어 질 수 있다는 것을 보여주는 결과라 하겠다. 선행 문헌에서 효모 세포의 흡착량을 살펴보면, woodchip의 경우 188 mg/g [13], sorghum bagasse 의 경우 600 mg/g [26], corncob의 경우 22.
후속연구
본 연구에서의 ethanol 수율은 이러한 최적 환경에서 얻어진 것이 아니기 때문에 아마도 상대적으로 약간 낮은 값을 보이는 것으로 추론된다. 그래서 ethanol 수율 향상을 위하여서는 ethanol 생산 환경에 대한 최적화 과정이 필요하다고 할 수 있으며, 특히 xylose를 이용하여 ethanol을 생산하기 위한 배양환경 최적화가 선행되어야 할 것으로 생각된다.
2 mg/g [5]으로 보고되고 있다. 그러므로 본 연구에서의 DEAE-contton은 비교적 우수한 효모 세포 흡착능력을 가지는 담체임을 알 수 있으며, 이를 이용한 다양한 생물공정 개발에 효과적으로 응용이 가능할 것으로 판단된다.
결론적으로, cotton을 DEAE·HCl로 처리한 DEAE-cotton은 효모를 이용한 ethanol 생산에 담체로서 사용되어질 수 있다는 것을 확인 하였으며, 특히 lignocellulosic biomass의 가수분해물에 포함될 수 있는 glucose와 xylose가 함유된 배지에서 두 단당류를 이용하여 ethanol 생산이 가능하다는 것을 보여주었다. 앞으로 실제 lignocellulosic biomass의 가수분해물을 이용하여 효모 세포가 흡착된 DEAE-cotton을 이용한 bioethanol 생산 공정개발이 기대 되어진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
본 연구에서 확인한 효모 부착을 위해 cotton을 DEAE로 derivatization 시키는 최적 조건은?
3C 에서는 DEAE-cotton 양의 증가로 효모 세포와 DEAE-cotton간의 완전한 흡착이 관찰되었다. 결론적 으로 여러가지 최적 조건을 유추 할 수 있었으나, DEAE-cotton이 0.4 g이고 효모 세포의 OD600이 9.6 이하일 때에 적어도 1시간 내에 거의 100% 흡착이 일어날 수 있음을 확인하였다(Fig. 3C).
본래 연구실에서 cotton은 어떻게 사용되어 왔는가?
그 동안 cotton은 세포 고정화 담체로서 보다는 분리/정제를 위한 담체로서 많이 사용되어져 왔다[4,6,7,15,19]. 본 연구에서는 이러한 선행연구결과를 바탕으로 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride [DEAE·HCl, (C2H5)2NCH2CH2Cl·HCl] 으로 cotton (탈지면)을 derivatization하여 cellulose로 이루어진 cotton을 효모 세포의 고정화 담체로서 사용하기 위한 연구를 시도하였다.
효모를 고정화하여 ethanol 생산하기 위한 세포의 고정화에 이용될 담체 중 연구가 많이 되고 있는 종류와 그 이유는?
그리고, 이러한 고정화 효모 세포를 이용하는 다양한 반응기 시스템이 연구되어 왔으며[2,3,8-10,14,26], 특히, 경제성을 고려하여 세포의 흡착을 이용한 다양한 부산물 [2,3,5,9,13,17,18,26]이 세포 고정화를 위한 담체로서 관심을 끌고 있다. 그 중에서 woodchips, sugarcane bagasse, sorghum bagasse, 그리고 corncob과 같은 agricultural byproducts가 특히 이러한 경제성과 간편한 방법 때문에 많이 연구되어왔다.
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