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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 60% HCl-ethanol 투여를 통한 급성 위염모델에서 안전성이 높은 천연물인 해삼 분말을 투여하여 SD rats의 육안적 위염증상 완화 및 위염, 위궤양 억제 정도를 조직학적인 검경을 통해 관찰하고, H. pylori 감염에 의한 만성 위질환 모델에서 조직병리학적 관찰을 통한 해삼 분말의 항위염, 항위궤양 및 항헬리코박터 효능 평가를 하고자 하였다.
- 실험에 사용된 개체수와 점수의 단위의 관계에 의해 통계 분포가 바뀔 수 있음을 감안할 때, 평가방법을 좀 더 다르게 수정한다면 통계적으로 유의한 결과를 얻을 수도 있을 것이다. 본 연구에서는 해삼의 항위염, 항위궤양 및 항헬리코박터 효과에 대한 가능성에 초점을 맞춰 연구를 수행하였으며, 항위염, 항위궤양 및 항헬리코박터 효과에 대한 연구에 있어서 기초자료로써 그 의미를 둘 수 있을 것으로 생각된다.
가설 설정
- 3)The animals of this group were inoculated culture media alone instead of H. pylori.
제안 방법
- 10% formalin 액에서 고정시킨 검체를 위체부에서 육안 손상이 관찰된 부위가 포함되도록 절취하여(trimming) 다시 10% formalin 액으로 후 고정시킨 후 일반적인 방법에 따라 조직학적 관찰을 실시하였다. 즉, 위조직을 파라핀에 포매 후 5∼7 μm의 두께로 절편하여 세절 후 hematoxylin-eosin으로 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.
- , Seoul, Korea)를 이용하였다. 1주 동안 H. pylori 감염 후 4주간 건해삼 투여한 동물 모델의 위 점막의 조직(pyloric region)을 Asan Helicobacter Test kit에 넣고 37℃로 12시간 배양 후에 판독하였다. 판독 결과 색이 노란색에서 적색으로 바뀐 경우 양성으로 판단하고, 색깔 변화가 없는 경우를 0점, 약간 붉은색을 나타낼 경우 1점, 연한 자주색을 나타낼 경우 2점, 진한 자주색을 나타낼 경우 3점으로 측정하였다.
- 60% HCl-ethanol 투여 급성 위염 질환모델 효능평가(SD rats, n=6)와 H. pylori 감염 만성 위염 질환 모델 효능평가(Mongolian gerbil, n=6)를 위하여 주간 체중에 근거하여 다음과 같이 군 분리를 하였다. 인체 유효 농도에 대한 근거가 부족하므로 동물을 대상으로 설정된 섭취량을 사람의 외삽(extrapolation) 계산방법(16)에 따라 정상군(Nor), 대조군(Con), DSCI(30 mg/kg, 저용량 건해삼), DSCII(100 mg/kg, 중간용량 건해삼), DSCIII(300 mg/kg, 고용량 건해삼)군으로 총 5군을 각각 임의배정 하여 건해삼을 각 농도별로 강제 경구투여 하였다.
- 6주령, 체중 250～350 g의 수컷 SD rat 6∼7마리를 한 군으로 하여 건해삼을 3주간 투여한 후, 위염 유발 물질인 150 mM HCl+60% ethanol을 1 mL씩 단회 경구투여 하여 위염을 유발하였다.
- 6～7주령 Mongolian gerbil을 12시간 절식시킨 후 2×109/mL CFU의 H. pylori 균을 마우스용 존데(sonde)를 이용하여 0.5 mL씩 이틀 간격으로 3회 경구투여 하여 감염을 유도하였다.
- H. pylori(ATCC 43504, American Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA) 균주를 10% calf serum이 첨가된 브루셀라 한천배지에 접종하여 10% CO2, 37℃및 microaerobic 조건에서 3일간 배양하였다. 배양된 H.
- ㈜해원(전주, 한국)에서 공급받은 해삼 동결건조물(DSC, dried sea cucumber)을 증류수에 혼탁하여 주 1회 체중을 측정하여 각각 30 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg의 농도로 1주일 급여량을 계산하여 조제하고 vortex한 후 냉장 보관하고, 매일 정해진 시간에 강제 경구투여 하였다.
- 사육기간 중 온도는 23±2 ℃, 상대습도는 50±5% 환기횟수는 10회/시간, 전배기 방식 및 조명시간은 12시간(7:00～19:00) 조도는 150～300 lux를 유지하였다. 동물 입수 시 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하였으며 시험을 실시하는데 적합하도록 설치류용 고형사료(샘타코, 경기, 한국)와 필터 및 자외선살균기로 여과 살균된 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하며 약 1주일간의 순화기간을 거쳤다. 본 연구에 사용된 동물실험에 관련된 모든 실험과정과 절차는 원광대학교 동물실험윤리위원회의 사전심의와 윤리 규정을 준수하여 수행되었다(Approval No.
- 이 실험모델에서 HCl-ethanol이 위 점막의 방벽을 파괴함으로써 H+이온의 역확산(back diffusion)을 유발하여 염증을 악화시키는 것으로 알려져 있다(20). 본 실험에서는 HCl-ethanol을 투여하지 않은 정상군에 비하여 HCl-ethanol과 함께 생리식염수만을 투여한 대조군은 HCl-ethanol 투여 후 위체부와 위저부 등에 선명한 점막 손상과 띠 모양으로 선상의 출혈 소견이 관찰되었다(Fig. 2). 이는 Robert 등(21)이 보고한 HCl-ethanol에 의한 위 손상 병변의 육안소견과 일치하게 glandular portion의 출혈에 의한 검붉은 선의 lesion이 발생된 것으로 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 1주간 H. pylori를 감염시킨 Mongolian gerbil을 이용하여 4주간 건해삼 투여하여 신속요소분해효소 검사를 실시하였으며, 결과는 Fig. 4와 같았다. H.
- 이후 위를 적출하여 유문부를 결찰하고 위내에 10% formalin 용액 10 mL를 주입한 상태로 formalin 용액에 10분간 반응시켜 위 내외를 고정하였다. 염증의 면적을 측정하기 위하여 대만부를 절개하여 촬영한 후 영상분석 프로그램(Image-ProR Plus 7.0, MediaCyberneticsR, Bethesda, MD, USA)으로 분석하여 염증 및 궤양 부위의 면적을 측정하였다.
- 이에 비하여 농도별로 해삼을 투여한 군에서 위 손상이 억제된 것을 관찰할 수 있었다. 위 손상 면적을 측정하여 억제율을 정량화하였다(Fig 3). 대조군에서는 위 전체 면적대비 25.
- 이러한 SD rats에 HClethanol을 경구투여하면 위점막층의 지질과산화 증가 및 점막손상을 유발한다는 보고(18)에 따라 위염 및 위궤양을 유발하였다. 위염 유발물질인 HCl-ethanol을 투여 30분 후 SD rat의 움직임과 증상을 살펴보고 1시간 동안의 활동량에 따른 평가를 실시하여 기록하였다. 실험 결과는 Table 1과 같은 기준으로 평가를 실시하였다(Fig.
- 위염유발 물질(150 mM HCl+60% ethanol)을 투여하고 30분 후에 움직임과 증상을 관찰하여 활동량, 호흡 등 임상적 증상을 Table 1과 같은 평가기준에 따라 3명의 관찰자가 같은 조건에서 배점하였다. 배점하여 기록하였다.
- 이 연구에서는 SD rat과 Mongolian gerbil에서 실험적으로 HCl-ethanol(150 mM HCl+60% ethanol)을 투여하여 급성 위염을 유발하고, H. pylori 감염시켜 만성 위염, 위궤양을 유발한 후, 건해삼을 투여하여 건해삼에 의한 항위염, 항위궤양 효과 및 H. pylori 감염 경향성 및 치료율을 검토하였던 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 7주령 SD rats와 H.
- 즉, 실험물질을 경구투여 하고 30분 후에 60% HCl-ethanol용액(60% ethanol에 150 mMHCl을 함유) 1 mL를 경구투여 하여 절식, 절수 하에서 1시간 방치 후 ether로 치사시켰다. 이후 위를 적출하여 유문부를 결찰하고 위내에 10% formalin 용액 10 mL를 주입한 상태로 formalin 용액에 10분간 반응시켜 위 내외를 고정하였다. 염증의 면적을 측정하기 위하여 대만부를 절개하여 촬영한 후 영상분석 프로그램(Image-ProR Plus 7.
- pylori 감염 만성 위염 질환 모델 효능평가(Mongolian gerbil, n=6)를 위하여 주간 체중에 근거하여 다음과 같이 군 분리를 하였다. 인체 유효 농도에 대한 근거가 부족하므로 동물을 대상으로 설정된 섭취량을 사람의 외삽(extrapolation) 계산방법(16)에 따라 정상군(Nor), 대조군(Con), DSCI(30 mg/kg, 저용량 건해삼), DSCII(100 mg/kg, 중간용량 건해삼), DSCIII(300 mg/kg, 고용량 건해삼)군으로 총 5군을 각각 임의배정 하여 건해삼을 각 농도별로 강제 경구투여 하였다.
- 24시간 이상 절식한 후 Mizui와 Doteuchi(17)의 방법으로 실험하였다. 즉, 실험물질을 경구투여 하고 30분 후에 60% HCl-ethanol용액(60% ethanol에 150 mMHCl을 함유) 1 mL를 경구투여 하여 절식, 절수 하에서 1시간 방치 후 ether로 치사시켰다. 이후 위를 적출하여 유문부를 결찰하고 위내에 10% formalin 용액 10 mL를 주입한 상태로 formalin 용액에 10분간 반응시켜 위 내외를 고정하였다.
- 즉, 위조직을 파라핀에 포매 후 5∼7 μm의 두께로 절편하여 세절 후 hematoxylin-eosin으로 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.
- pylori 감염 후 4주간 건해삼 투여한 동물 모델의 위 점막의 조직(pyloric region)을 Asan Helicobacter Test kit에 넣고 37℃로 12시간 배양 후에 판독하였다. 판독 결과 색이 노란색에서 적색으로 바뀐 경우 양성으로 판단하고, 색깔 변화가 없는 경우를 0점, 약간 붉은색을 나타낼 경우 1점, 연한 자주색을 나타낼 경우 2점, 진한 자주색을 나타낼 경우 3점으로 측정하였다.
대상 데이터
- ㈜오리엔트(경기, 한국)에서 구입한 Specific-pathogen free(SPF) 상태의 6주령, 체중 150～200 g의 Sprague-Dawley(SD) rats 수컷 40마리와 원광대학교 동원자원개발 연구센터(익산, 한국)에서 공급받은 체중 45～50 g의 Mongolian gerbil 수컷을 사용하였다. 사육기간 중 온도는 23±2 ℃, 상대습도는 50±5% 환기횟수는 10회/시간, 전배기 방식 및 조명시간은 12시간(7:00～19:00) 조도는 150～300 lux를 유지하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 통계적 유의성 검정은 ANOVA(one-way analysis of variance test) Duncan 사후검정 비교를 실시하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정하였다(SPSS V12., SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
- 모든 실험결과는 평균±표준오차(mean±SE)로 계산하였다.
이론/모형
- 6주령, 체중 250～350 g의 수컷 SD rat 6∼7마리를 한 군으로 하여 건해삼을 3주간 투여한 후, 위염 유발 물질인 150 mM HCl+60% ethanol을 1 mL씩 단회 경구투여 하여 위염을 유발하였다. 24시간 이상 절식한 후 Mizui와 Doteuchi(17)의 방법으로 실험하였다. 즉, 실험물질을 경구투여 하고 30분 후에 60% HCl-ethanol용액(60% ethanol에 150 mMHCl을 함유) 1 mL를 경구투여 하여 절식, 절수 하에서 1시간 방치 후 ether로 치사시켰다.
- 신속요소분해효소검사(rapid urease test)는 campylobacter-like organism(CLO) 검사 시약인 Asan Helicobacter Test kit(Asan Pharmaceutical Co., Seoul, Korea)를 이용하였다. 1주 동안 H.
성능/효과
- pylori 감염 경향성 및 치료율을 검토하였던 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 7주령 SD rats와 H. pylori 에 감염시킨 7주령 Mogolian gerbils를 정상군(Nor, n=6)과대조군(Con, 60% HCl-ethanol+증류수(vehicle), n=6)에 비하여 실험군 Ⅰ(DSD Ⅰ, 60% HCl-ethanol+건해삼 30 mg/kg, n=6), 실험군 Ⅱ(DSD Ⅱ, 60% HCl-ethanol+건해삼 100 mg/kg, n=6), 실험군 Ⅲ(DSD Ⅲ, 60% HCl-ethanol+건해삼 300 mg/kg, n=6)에서는 건해삼 투여 용량에 따른 항위염, 항위궤양 및 항헬리코박터 효과를 육안적 소견, CLO test 및 병리조직학적 검사를 통해 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합해볼 때 건해삼이 새로운 위염 및 위손상 치료제와 기능성식품의 개발에 활용할 수 있음을 확인하였다.
- DSC Ⅲ군의 신속요소분해효소는 대조군 1.83±0.31점에 비하여 1.33±0.49로 신속요소분해효소 양은 감소한 결과를 나타났으나, 통계적 유의성은 없었다.
- H. pylori 감염 후 해삼 추출물 고농도 투여군인 DCS Ⅲ군의 병리조직학적 점수는 1.3±1.11로서 대조군의 병리조직학적 점수인 3.0±2.16과 비교하여 유의성은 확인되지 않았으나 감소 경향이 있음을 알 수 있었다(Table 2).
- 5B). H. pylori 감염 후 해삼 추출물 저농도 투여군인 DCSⅠ군, 중간농도 투여군인 DCS Ⅱ, 고농도 투여군인 DCSⅢ 모두에서 개체에 따라 가벼운 위점막 상피세포 위축 소견과 염증세포 침윤이 있는 개체가 일부 관찰되었으나 대조군보다 병변 정도가 개선된 것을 알 수 있었다(Fig. 5C～E). H.
- H. pylori 감염 후 해삼 추출물 저농도 투여군인 DCSⅠ군의 병리조직학적 점수(histological lesion scores)는 2.2±1.47로서 대조군의 병리조직학적 점수인 3.0±2.16과 비교하여 유의성은 확인되지 않았으나 감소 경향이 있음을 알 수 있었다.
- H. pylori 감염 후 해삼 추출물 중간농도 투여군인 DCS Ⅱ군의 병리조직학적 점수는 2.1±1.86으로서 대조군의 병리조직학적 점수인 3.0±2.16과 비교하여 유의성은 확인되지 않았으나 감소 경향이 있음을 알 수 있었다.
- 4와 같았다. H. pylori를 감염시키지 않은 정상군에서 모든 개체에서 색의 변화은 없었으나, H. pylori 감염군인 대조군과 실험물질 투여군은 적색을 나타내어 양성반응을 나타내었다. DSC Ⅲ군의 신속요소분해효소는 대조군 1.
- 그러나 중, 고용량의 건해삼 투여한 실험군(DSCⅡ, Ⅲ)에서는 위 손상 면적이 각각 9.4±1.91%와 10.0±1.48%로 위 손상 억제률이 63.1±7.49%와 60.7±5.80%로 대조군에 비하여 유의하게 위 손상이 억제되었다(p<0.05)
- 그에 비하여 HClethanol과 함께 건해삼을 농도(30 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg) 의존적으로 투여한 DSCI, Ⅱ, Ⅲ군의 육안적 소견 점수는 각각 8.8±0.82, 5.7±0.71 및 5.6±0.63으로 대조군에 비하여 움직임이 증가하였다.
- 대조군에서는 위 전체 면적대비 25.4±2.50%의 위 손상이 관찰되었으며 건해삼을 저용량으로 투여한 실험군(DSCⅠ)에서는 19.2±4.05%로 위 손상 억제율이 24.5±15.93%로 관찰되었으나 유의성은 없었다.
- SD rat는 효능평가 및 독성학과 약물학 연구에서 광범위하게 이용되고 있다. 본 계통의 mice는 풍부한 시험 기초자료가 축적되어 있어서 시험결과의 해석 및 평가 시에 보다 객관적인 결과를 얻을 수 있다. 이러한 SD rats에 HClethanol을 경구투여하면 위점막층의 지질과산화 증가 및 점막손상을 유발한다는 보고(18)에 따라 위염 및 위궤양을 유발하였다.
- 본 연구에서는 대조군에 비하여 해삼 투여군의 신속분해효소 검사 점수가 감소하는 경향은 관찰되었으나 유의성은 없었다. 이는 H.
- pylori 에 감염시킨 7주령 Mogolian gerbils를 정상군(Nor, n=6)과대조군(Con, 60% HCl-ethanol+증류수(vehicle), n=6)에 비하여 실험군 Ⅰ(DSD Ⅰ, 60% HCl-ethanol+건해삼 30 mg/kg, n=6), 실험군 Ⅱ(DSD Ⅱ, 60% HCl-ethanol+건해삼 100 mg/kg, n=6), 실험군 Ⅲ(DSD Ⅲ, 60% HCl-ethanol+건해삼 300 mg/kg, n=6)에서는 건해삼 투여 용량에 따른 항위염, 항위궤양 및 항헬리코박터 효과를 육안적 소견, CLO test 및 병리조직학적 검사를 통해 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합해볼 때 건해삼이 새로운 위염 및 위손상 치료제와 기능성식품의 개발에 활용할 수 있음을 확인하였다.
- 정상군에서는 고개를 가누고 정상적 보행 및 털 고르기, 먹이 섭취 등의 행동을 보였으나 HCl-ethanol와 생리식염수를 투여한 대조군의 육안적 소견 점수는 10.5±0.50으로 대부분 움직임이 없었으며 자극에 의해서 약간의 움직임을 보였다.
- 해삼은 다양한 기능성 성분이 다량 함유되어 있고, 이러한 기능성분들은 HCl-ethanol과 같은 위 손상 물질로부터 위 조직을 보호할 것으로 생각되며, 본 연구에서 해삼 투여는 HCl-ethanol에 의한 위 손상을 감소시킴으로써 위 보호에 중요한 작용을 할 것으로 생각된다.
후속연구
- 16과 비교하여 유의성은 확인되지 않았으나 감소 경향이 있음을 알 수 있었다(Table 2). 실험에 사용된 개체수와 점수의 단위의 관계에 의해 통계 분포가 바뀔 수 있음을 감안할 때, 평가방법을 좀 더 다르게 수정한다면 통계적으로 유의한 결과를 얻을 수도 있을 것이다. 본 연구에서는 해삼의 항위염, 항위궤양 및 항헬리코박터 효과에 대한 가능성에 초점을 맞춰 연구를 수행하였으며, 항위염, 항위궤양 및 항헬리코박터 효과에 대한 연구에 있어서 기초자료로써 그 의미를 둘 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 대조군에 비하여 해삼 투여군의 신속분해효소 검사 점수가 감소하는 경향은 관찰되었으나 유의성은 없었다. 이는 H. pylori의 5주간의 감염기간으로 짧은 감염 기간으로 인해 통계학적인 유의성 있는 결과를 관찰하지 못한 것으로 예상되며, 감염기간을 증가 시 통계학적 유의성 있는 결과를 관찰할 것으로 생각된다.
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