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문제 정의
- 본 연구에서는 능소화의 잎, 줄기의 물 및 메탄올 엑스를 이용하여 HIV-1 기원 효소인 reverse transcriptase 억제활성을 ELOSA(Enzyme Linked Oligonucleotide Sorbent Assay) 방법으로, HIV-1 protease 억제활성을 HPLC 검출법으로, 그리고 α-glucosidase의 억제활성은 spectrophotometer 측정법으로 평가를연구를 실시하였고, HTLV -1에 감염된 MT-4 cell line을 이용하여 바이러스 복제 억제력을 살펴 본 결과 유의적 활성이 관찰되어 보고하고자 한다.
- , 1995). 본 연구에서는 에이즈의 원인 바이러스인 HIV-1의 주요 효소와 그 바이러스를 대상으로 한국산 식물들의 복제억제 효능을 살펴보았으며 그 중 능소화 줄기와 잎 추출물의 활성효능이 관찰되어 보고하고자 한다. 능소화(Campsis grandifolia K.
제안 방법
- α-glucosidase에 의한 p-nitrophenyl-α-D-glucoside의 cleavage를 spectrophotometer로 측정하는 방법을 이용하였다.
- 능소화 추출물의 HIV-1에 대한 항바이러스 효과를 복제 관련 효소에 대한 억제실험과 바이러스 복제억제 실험을 통하여 살펴보았다. 역전사효소 억제활성을 ELOSA 방법으로 실험한 결과 능소화 줄기의 물 추출물이 100 ㎍/㎖농도에서 각각 37.
- 식물엑스의 MT-4세포에 대한 HIV-1 유도 세포변성(CPE, cytopathic effect)을 완전히 억제하는 농도(IC, inhibitory concentration)를 광학현미경으로 관찰하였으며 세포독성(CC, cytotoxic concentration)은 MT-4 세포의 생존력 감소로 측정하였다. 대조군은 HIV-1에 감염시킨 세포와 시키지 않은 세포에 식물엑스를 넣지 않고 측정하였다. 양성대조군은 AZT와 DS8000을 각각 이용하였다.
- 반응혼합물을 증류수 35 μl로 희석한 후 HPLC 분석을 행하였으며 HPLC 분석 조건으로 column은 LiChrospher 100 RP-18 (column size, 250 × 4 mm, Merck, Darmstadt, FRG)을, 용매는 0.1% TFA와 acetonitrile(20%-50% gradient)로 하였으며, 유속은 1.0 ml/min로 하면서 UV 280 nm에서 분석하였다(Fig. 1).
- 세척한 microplate에 형광검출액(3,3',5,5'- tetramethylbenzidine substrate 용액) 100 μl 를 첨가하여 실온에서 1시간동안 반응시킨 후 정지액(2.2% citric acid, 1.5% HCl, 1.5% sulfuric acid and 94.8% water) 100 μl를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
- 시료 5 g을 각각 물(100 ml) 또는 메탄올(100 ml)로 3시간씩 열수 추출한 후 감압 농축하여 메탄올의 최종농도가 2%가 넘지 않게 동결건조하여 활성 실험의 재료로 사용 하였다. 시료는 활성 실험 시에 멸균된 증류수나 DMSO에 100 μg/ml의 농도로 희석하여 사용하였다.
- 그리고 RPMI-1640배지에서 1 × 105 cells/ml로 재현탁시키고 현탁된 세포를 200 μl/well씩 96-well culture plate에 식물엑스와 함께 처리하고 5일간 배양하였다. 식물엑스의 MT-4세포에 대한 HIV-1 유도 세포변성(CPE, cytopathic effect)을 완전히 억제하는 농도(IC, inhibitory concentration)를 광학현미경으로 관찰하였으며 세포독성(CC, cytotoxic concentration)은 MT-4 세포의 생존력 감소로 측정하였다. 대조군은 HIV-1에 감염시킨 세포와 시키지 않은 세포에 식물엑스를 넣지 않고 측정하였다.
- 에서 얻은 α-glucosidase(Toyobo Company, Osaka, Japan)를 완충액(10 mM sodium phosphate, pH 7.0, 20% glycerol)에 0.5 U/ml가 되도록하여 사용하였으며, 기질은 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(Nacalai Tesque Inc., Osaka, Japan)를 멸균 증류수에 10 mM이 되도록하여 사용하였다.
대상 데이터
- Microplate washer 는 Immunowash model 1250(Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan)을, microplate reader는 Biorad 3550-UV (Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan)를, HPLC는 [System controller: Shimadzu SCL-6B, Pump: Shimadzu LC-9A, Detector: Shimadzu SPD-6A(UV spectrophotometric detector), Recorder & integrator: Shimadzu C-R6A Chromatopac.]을 각각 이용하였다.
- 실험에 사용된 세포는 HTLV-1 에 감염된 MT-4 cell line으로 penicillin G 100 U/ml (Banyu Pharmaceutical, Tokyo, Japan)와 streptomycin 100 μg/ml(Meiji Seika, Tokyo, Japan) 그리고 10% fetal calf serum(FCS, Flow Laboratories, North Ryde, Australia)을 포함하는 RPMI-1640배지(Flow Laboratories, Irvine, Scotland)를 이용하여 5% CO2와 37℃의 조건하에서 배양하여 실험에 사용하였다. 바이러스는 MOLT-4/HTLV-3ⅢB 세포로부터 얻은 HIV-1 (strain HTLV-ⅢB)을 이용하였다. 항 HIV-1 활성은 MT-4 세포를 50%-tissue culture infective dose(TCID50)에서 1시간 동안 HIV-1 (HTLV-ⅢB)에 감염시켰다.
- 시료로 사용한 능소화 전남 순천시 난봉산에서 채취한 후 순천대학교 한약자원학과에서 동정한 후 잎, 줄기를 통풍이 잘되는 곳에서 음건 세절하여 추출용 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용된 세포는 HTLV-1 에 감염된 MT-4 cell line으로 penicillin G 100 U/ml (Banyu Pharmaceutical, Tokyo, Japan)와 streptomycin 100 μg/ml(Meiji Seika, Tokyo, Japan) 그리고 10% fetal calf serum(FCS, Flow Laboratories, North Ryde, Australia)을 포함하는 RPMI-1640배지(Flow Laboratories, Irvine, Scotland)를 이용하여 5% CO2와 37℃의 조건하에서 배양하여 실험에 사용하였다.
- 대조군은 HIV-1에 감염시킨 세포와 시키지 않은 세포에 식물엑스를 넣지 않고 측정하였다. 양성대조군은 AZT와 DS8000을 각각 이용하였다.
- (1994)의 방법에 의해 준비하였다. 즉 HIV-1 protease (PR)의 DNA를 나타내는 JM 105 Escherichia coli 에서 생산된 HIV-1 protease를 {[50 mM NaOAc(pH 5.0), 1 mM EDTA-2Na, 2mM 2-Mercaptoethanol]:Glycerol}=75:25 용액에 희석하여 사용하였고, 기질은 oligopeptide {His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-(pNO2-Phe)-Glu-Ala- Nle-Ser-NH2 (M.W. 1315 )}를 (주)단백질 연구소 (Osaka, Japan)로부터 구입하여 완충액 (50 mM NaOAc, pH 5.0)에 2 mg/ml 농도로 희석하여 사용하였다. 항 HIV -1 protease 반응은 완충액 1 μl, 기질 1.
- 효소는 유전자 재조합에 의해 생산된 HIV-1 RT (10 U/μl, 100 mM potassium phosphate, pH 7.1, 1 mM dithiothreitol, 50% glycerol)를 효소완충액[100 mM Tris -HCl, pH 8.0, 160 mM KCl, 1 mM EDTA, 3 mM dithiothreitol, 0.3% (v/v) Triton X-100, and 10% (v/v) glycerol]에 0.005 U/μl로 희석하여 사용하였고 반응혼합물(reaction mixture)은 primer가 부착된 RNA template 와 triphosphate-DNA nucleosides를 반응혼합물 완충액 (reaction buffer: 200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 40 mM MgCl2)에 희석하여 사용하였다.
이론/모형
- Reverse transcriptase(RT) 억제활성 실험은 Dupont 사로부터 구입한 RT-DetectTM kit NEK-070A (Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 이용한 ELOSA 방법으로 4℃ 이하에서 저장하면서 assay 조건을 설정하였다. 효소는 유전자 재조합에 의해 생산된 HIV-1 RT (10 U/μl, 100 mM potassium phosphate, pH 7.
- 유전자 재조합으로 생산된 HIV-1 protease에 의한 기질의 cleavage를 HPLC로 측정하였고 효소원은 Otake et al. (1994)의 방법에 의해 준비하였다. 즉 HIV-1 protease (PR)의 DNA를 나타내는 JM 105 Escherichia coli 에서 생산된 HIV-1 protease를 {[50 mM NaOAc(pH 5.
성능/효과
- 5%의 HIV-1 protease 억제활성 나타 내었다. 그리고 HIV-1 복제 억제활성은 MT-4 세포에 대한 HIV-1 유도 세포변성억제를 광학현미경으로 관찰하여 살펴본 결과 줄기의 물 추출물이 100 ㎍/㎖ 농도에서 HIV-1 바이러스 증식을 완전히 억제하였다.
- 2). 그리고 재조합 HIV-1 프로테아제 억제활성 실험에서는 능소화 잎과 줄기 메탄올 추출물이 100 ㎍/㎖의 농도에서 각각 33.6%와 31.5%의 억제 활성이 관찰되었다(Fig. 3). 능소화 잎과 줄기의 물 추출물에서는 글루코시다제 억제 활성을 나타내지 않았지만 줄기의 메탄올 추출물에서는 10.
- 4). 능소화 추출물의 HIV-1 바이러스 증식을 완전히 억제하는 최소농도는 줄기의 물 추출물이 100 ㎍/㎖로 나타났으며, 줄기의 메탄올 추출물, 잎의 물 및 메탄올 추출물에서는 활성이 관찰되지 않았다(Table 1). 또한, 능소화 추출물을 농도별로 처리하여 배양하였을 때 세포독성을 나타내는 최소농도는 모든 추출물에서 100 ㎍/㎖ 이상으로 나타나 세포독성을 거의 일으키지 않음을 알 수 있었다(Table 1).
- 이상의 결과로 보아 능소화 줄기의 물 추출물이 높은 항 역전사효소 활성을 가짐과 동시에 바이러스의 복제억제에도 기여하는 것을 알 수 있었으며 이는 능소화의 HIV-1 복제 억제활성이 역전사효소 억제와 상관관계가 있는 것으로 추정된다. 또한 잎과 줄기의 메탄올 추출물은 유전자 재조합 HIV-1 protease 억제활성에서도 높은 활성을 나타냄으로써 바이러스 복제 억제에 일부 기여하는 것으로 추정된다. 반면 거의 모든 추출물에서는 글루코시다제 억제활성에서는 유의한 활성을 보이지 않았다.
- 능소화 추출물의 HIV-1 바이러스 증식을 완전히 억제하는 최소농도는 줄기의 물 추출물이 100 ㎍/㎖로 나타났으며, 줄기의 메탄올 추출물, 잎의 물 및 메탄올 추출물에서는 활성이 관찰되지 않았다(Table 1). 또한, 능소화 추출물을 농도별로 처리하여 배양하였을 때 세포독성을 나타내는 최소농도는 모든 추출물에서 100 ㎍/㎖ 이상으로 나타나 세포독성을 거의 일으키지 않음을 알 수 있었다(Table 1).
- 본 연구에서는 능소화 추출물의 HIV-1 억제활성을 실험하였고, 그 결과 능소화 잎, 줄기의 MeOH 추출물은 역전사 효소 억제 활성이 낮거나 거의 없었으며, 능소화 줄기의 물 추출물에서 100 ㎍/㎖ 농도에서 37.9%의 HIV 역전사 효소 억제 활성을 나타내었다(Fig. 2). 그리고 재조합 HIV-1 프로테아제 억제활성 실험에서는 능소화 잎과 줄기 메탄올 추출물이 100 ㎍/㎖의 농도에서 각각 33.
- 능소화 추출물의 HIV-1에 대한 항바이러스 효과를 복제 관련 효소에 대한 억제실험과 바이러스 복제억제 실험을 통하여 살펴보았다. 역전사효소 억제활성을 ELOSA 방법으로 실험한 결과 능소화 줄기의 물 추출물이 100 ㎍/㎖농도에서 각각 37.9%의 활성을 나타내었고, 능소화 잎과 줄기의 메탄올 추출물에서 33.6% 및 31.5%의 HIV-1 protease 억제활성 나타 내었다. 그리고 HIV-1 복제 억제활성은 MT-4 세포에 대한 HIV-1 유도 세포변성억제를 광학현미경으로 관찰하여 살펴본 결과 줄기의 물 추출물이 100 ㎍/㎖ 농도에서 HIV-1 바이러스 증식을 완전히 억제하였다.
- 이상의 결과로 보아 능소화 줄기의 물 추출물이 높은 항 역전사효소 활성을 가짐과 동시에 바이러스의 복제억제에도 기여하는 것을 알 수 있었으며 이는 능소화의 HIV-1 복제 억제활성이 역전사효소 억제와 상관관계가 있는 것으로 추정된다. 또한 잎과 줄기의 메탄올 추출물은 유전자 재조합 HIV-1 protease 억제활성에서도 높은 활성을 나타냄으로써 바이러스 복제 억제에 일부 기여하는 것으로 추정된다.
후속연구
- , 1994), 감염된 세포로부터 virus분자의 방출억제(Rossmann, 1988) 등에도 관여하는 것으로 생각되어 진다. 능소화 추출물의 HIV-1활성에 관여하는 화합물 탐색을 위하여 active guided fractionation을 실시하고 있으며, 향후 NMR등 분광학적 방법을 통해 활성화합물의 구조를 동정할 것이다.
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