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문제 정의
- 본 연구에서는 잎새버섯 균사체에서 열수, 분쇄, 산, 알칼리의 추출 방법을 이용하여 다당류를 추출하고, 각 추출공정에 따른 다당류의 항암 효과를 비교하였다. 이러한 추출조건에 따른 효능연구는 잎새버섯에서는 아직까지 수행된 적이 없고, 향후 버섯으로부터 기능성 다당류의 대량생산과 그 활용에 이용하고자 실험하였다.
제안 방법
- 500 ㎖ 삼각플라스크에 300 ㎖ 증류수에 Raper’s medium 조성에 따라 배지를 만들어 총량의 10%의 균을 접종하였다.
- 균사체 및 다당류 생장 측정에서 얻은 결과를 통해 5일 동안 배양한 잎새버섯을 열수, 분쇄, 산, 염기의 4가지 추출방법 으로 기능성 다당류를 추출하였다. 잎새버섯 균사체에서 기능성 다당류를 추출한 결과, 알칼리 추출법이 0.
- 균사체는 건조기(60℃)에서 overnight 한 후 균사체량을 측정하고, 배양액은 3배량의 95% ethanol을 첨가하여 4℃에서 overnight한 후 6,000×g에서 15분간 원심분리하여 침전물을 건조한 후 다당류를 측정하였다(Han 등 1995).
- 여과물은 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상청액을 얻고, 이에 3배량의 에탄올을 넣어 4℃에서 하룻밤 동안 냉침시켰다. 냉침된 침전물을 수집하여 15,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 침전 물을 얻은 후, 이를 동결건조하여 열수 추출된 다당류(HwFP) 를 얻었다.
- 항암 효과를 알아보기 위하여 96 well plate에 각 암세포주를 100 ㎕씩 분주 하여 2시간 배양하였다. 다당류 추출물을 HwFP는 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, HgFP, AlFP, AcFP는 1 ㎎/㎖, 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 농도로 분주하여 24시간 배양했다. 배양 후 96 well plate를 37℃에서 4시간 동안 MTT(5 ㎎/㎖) 10 ㎕를 넣어 반응시키고 배양액을 버린 후 DMSO를 처리하여 microplate reader(Fluostar, BMG labtech, Australia)에서 5분간 교반 후 540 ㎚에서 O.
- 배양 후 96 well plate를 37℃에서 4시간 동안 MTT(5 ㎎/㎖) 10 ㎕를 넣어 반응시키고 배양액을 버린 후 DMSO를 처리하여 microplate reader(Fluostar, BMG labtech, Australia)에서 5분간 교반 후 540 ㎚에서 O.D.(optical density)값을 측정하였다.
- 본 연구에서는 다양한 추출공정에 의하여 제조된 잎새버섯(G. frondosa) 균사체로부터 기능성 다당류 추출 분획의 항암효과를 구강암세포주인 KB cell과 간암세포주인 HepG2 cell을 사용하여 확인하였다. 실험결과, 잎새버섯 균사체의 최대 생장일은 5일째였으며, 추출공정별 수율을 비교한 결과, 알칼리 추출법으로 추출한 AlFP(0.
- 본 연구에서는 잎새버섯 균사체에서 열수, 분쇄, 산, 알칼리의 추출 방법을 이용하여 다당류를 추출하고, 각 추출공정에 따른 다당류의 항암 효과를 비교하였다. 이러한 추출조건에 따른 효능연구는 잎새버섯에서는 아직까지 수행된 적이 없고, 향후 버섯으로부터 기능성 다당류의 대량생산과 그 활용에 이용하고자 실험하였다.
- 25%)를 사용하여 떼어낸 암세포를 5분간 800 rpm으로 원심분리 하였다. 상청액은 버리고 새로운 배지로 현탁액을 만들어 trypan blue 용액(0.4%)과 20 ㎕씩 1:1 비율로 섞어 염색하여 세포수를 측정하였다. 세포수를 측정한 후 1×10 5cells/㎖ 농도로 조정하여 실험에 사용하였다.
- 10017)를 RPMI 1640(with 25 mM HEPES and 10% FBS) 배지로 3일 계대 배양하여 사용하였다. 암세포의 활성화 상태를 알기 위하여 hemocytometer(cat. no. 6300-30, Marienfeldsuperior, Germany)로 세포수를 측정하였다. 배양 3일 후 암세 포주(HepG2, KB)를 culture plate에서 떼어 내기 위해 trypsinEDTA(0.
- 다당류의 총 당 정량은 Phenol-Sulfuric acid법(DuBois 등 1956)으로 측정하였다. 위해 추출공정별 추출한 다당류 1 ㎎을 saline 10 ㎖에 녹이고 시료 조제액 1 ㎖에 phenol 25 ㎕를가한 다음 sulfuric acid 2.5 ㎖를 가하여 30℃에서 20분간 반응한 후 실온에서 냉각시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 측정 하였다. 포도당(Sigma-Aldrich, St.
- 잎새버섯 균사체는 potato dextrose agar(PDA) 배지에 균주를 보관하였으며, potato dextrose broth(PDB) 배지에서 균사체를 14일간 배양하여 활성화 시킨 후 7일간 계대 배양하여 접종용으로 사용하였다.
- 잎새버섯 균사체에서 다당류 추출공정은 Kim 등(2005)의 방법을 변형하여 Raper's 배지에서 7일간 배양한 잎새버섯 균사체 배양액을 표준체(No. 90)로 여과하여 배양액은 버리고, 균사체를 이용하여 Fig. 1, 2와 같이 추출하였다(Kim 등 2005).
- 추출법에 따른 다당류의 항암효과를 비교하기 위하여 구강암 세포주인 KB cell과 간암세포주인 HepG2 cell에 처리하여 항암효과를 확인하였다. KB cell에 각 다당류를 처리한 결과, 1,000 ㎍/㎖ 농도를 처리하였을 때 AlFP에서 47.
대상 데이터
- 실험에 사용된 잎새버섯은 한국버섯균주은행(CCDBM, Culture Collection of DNA Bank of Mushrooms, Incheon university Korea)에서 제공 받아 사용하였다.
- 5 ㎖를 가하여 30℃에서 20분간 반응한 후 실온에서 냉각시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 측정 하였다. 포도당(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준물 질로 하여 100 ㎍/㎖ stock solution을 만들고, 단계별 표준용 액을 만들어 당 함량을 정량하였다.
- 항암실험에 사용된 암세포주는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였으며, 사용한 암세포주는 인간유래 간암세포주(HepG2, KCLB No. 88065), 구강암세포주(KB, KCLB No. 10017)를 RPMI 1640(with 25 mM HEPES and 10% FBS) 배지로 3일 계대 배양하여 사용하였다. 암세포의 활성화 상태를 알기 위하여 hemocytometer(cat.
이론/모형
- 다당류의 총 당 정량은 Phenol-Sulfuric acid법(DuBois 등 1956)으로 측정하였다. 위해 추출공정별 추출한 다당류 1 ㎎을 saline 10 ㎖에 녹이고 시료 조제액 1 ㎖에 phenol 25 ㎕를가한 다음 sulfuric acid 2.
- 잎새버섯 균사체의 생장곡선 측정과, 다당류 추출방법을 위한 균주 활성화는 버섯 기본 배지 중 하나인 Raper's medium(Raper 등 1972)을 사용하였다.
성능/효과
- 추출법에 따른 다당류의 항암효과를 비교하기 위하여 구강암 세포주인 KB cell과 간암세포주인 HepG2 cell에 처리하여 항암효과를 확인하였다. KB cell에 각 다당류를 처리한 결과, 1,000 ㎍/㎖ 농도를 처리하였을 때 AlFP에서 47.76%로 가장 높은 세포 독성을 나타냈으며, AcFP는 28.71%, HgFP는 20.92% 순으로 암세포에 대한 세포독성을 나타냈다(Fig. 4). 간암세포주인 HepG2 cell에서는 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 AcFP 를 처리 하였을 때 28.
- Raper's medium에서 잎새버섯의 균사체 및 기능성 다당류의 생장 측정 결과, 0일부터 4일까지는 균사체와 다당류의 변화는 적었으나, 5일차에 균사체(3.97 g/ℓ)와 다당류(2.46 g/ℓ) 생산이 가장 높은 수치를 보였으며, 6일차부터 균사체와 다당류는 감소하였다(Fig. 3).
- 4). 간암세포주인 HepG2 cell에서는 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 AcFP 를 처리 하였을 때 28.88%로 가장 항암효과가 높았으며, 다음으로 알칼리 추출물인 AlFP가 22.86%로 암세포주 억제 효과가 높았다(Fig. 5). Kim 등(2011)이 세포독성 실험에서 잎새버섯 조다당류 2 ㎎/㎖ 농도에서 NIH3T3과 HT-29에서 항암 효과를 나타냈다고 보고하였으며, Kwon 등(2003)은 아가리쿠스, 표고, 영지, 운지, 상황버섯 배양액 열수 추출물의 항암 효과를 비교해본 결과, 1 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 세포독성을 나타내는 것으로 보아, 잎새버섯 균사체에서 추출한 기능성 다당류는 1 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 항암효과를 나타낼 수 있는 것으로 사료된다.
- frondosa) 균사체로부터 기능성 다당류 추출 분획의 항암효과를 구강암세포주인 KB cell과 간암세포주인 HepG2 cell을 사용하여 확인하였다. 실험결과, 잎새버섯 균사체의 최대 생장일은 5일째였으며, 추출공정별 수율을 비교한 결과, 알칼리 추출법으로 추출한 AlFP(0.175%)의 수율이 가장 우수 하였고, 1% HCl을 이용한 추출물(AcFP, 0.79%), 분쇄추출물 (HgFP, 0.016%), 열수추출물(HwFP, 0.004%) 순이었다. 추출한 기능성 다당류의 항암효과를 KB cell과 HepG2 cell을 통해 실험한 결과, KB cell에서는 AcFP와 AlFP가 1 ㎎/㎖에서 각각 38.
- 균사체 및 다당류 생장 측정에서 얻은 결과를 통해 5일 동안 배양한 잎새버섯을 열수, 분쇄, 산, 염기의 4가지 추출방법 으로 기능성 다당류를 추출하였다. 잎새버섯 균사체에서 기능성 다당류를 추출한 결과, 알칼리 추출법이 0.175 g으로 가장 높은 0.175%의 수율을 보였고, 1% HCl을 이용한 추출은 0.79%, 분쇄추출은 0.016%, 그리고 열수추출에서 가장 적은 0.004%의 수율을 나타내었다(Table 1). Kim 등(2011)이 잎새버섯 자실체에서 조다당류를 열수, 중성염, 메탄올을 이용해 추출한 결과, 메탄올, 중성염, 열수추출 순서로 높은 수율을 얻었다고 보고하였으며, Kim 등(2005)은 노루궁뎅이버섯 추출 공정별 다당류 추출결과 3% NaOH를 이용한 알칼리 추출법에서 추출 수율이 가장 높다고 보고하였다.
- 004%) 순이었다. 추출한 기능성 다당류의 항암효과를 KB cell과 HepG2 cell을 통해 실험한 결과, KB cell에서는 AcFP와 AlFP가 1 ㎎/㎖에서 각각 38.68%, 28.69%의 항암효과를 보였고, HepG2 cell에서는 AlFP가 1 ㎎/㎖에서 28.85% 항암효과를 보여 알칼리 추출법으로 추출한 기능성 다당류인 AlFP가 우수한 효과를 나타내었다. 이상과 같이 잎새버섯의 기능성 다당류는 우수한 암세포 억제 효과가 있어 항암보조제로 이용 가능성이 있을 것으로 생각된다.
- 표준 곡선을 기준으로 한 다당류의 당 함량은 열수추출물 (HwFP)이 84.97%로 가장 높았으며, 추출 수율이 가장 높았던 알칼리로 추출한 다당류는 54.97%로 나타났다(Table 2). Kim 등(2005)은 노루궁뎅이버섯의 추출 공정별 당 함량을 조사한 결과, 100℃에서 60분간 열수 추출한 다당류 추출물의 당 함량은 83.
후속연구
- 2 g/㎏ 이상으로 독성이 거의 없는 것으로 보고하였으며, 이는 본 연구에서 잎새버섯으로부터 알칼리 추출된 다당류도 중화와 정제단계를 통해 독성이 없을 것으로 판단된다. 따라서 잎새버섯의 알칼리 추출 분획물은 우수한 암세포 억제 효과가 있어 항암보조 제로 이용 가능성이 있을 것으로 생각된다.
- 85% 항암효과를 보여 알칼리 추출법으로 추출한 기능성 다당류인 AlFP가 우수한 효과를 나타내었다. 이상과 같이 잎새버섯의 기능성 다당류는 우수한 암세포 억제 효과가 있어 항암보조제로 이용 가능성이 있을 것으로 생각된다.
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