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문제 정의
- galloprovincialis) 내의 다이옥신류인 polychlorinated dibenzo-p-dioxins(PCDDs)와 polychlorinated dibenzofurans(PCDFs), 브롬계 난연제(flame retardant)의 일종인 polybrominated diphenyl ethers(PBDEs), 그리고 nonyphenol류 물질들을 조사 비교한 결과, 진해만이 Thau lagoon보다 그 오염도가 높은 것으로 확인되었다. 다양한 외래 오염 물질 유입에 의한 광양만과 진해만의 해양생태계 변화를 진단, 평가하는 기술을 개발하여 해양생태계 정보를 공급하기 위한 기초연구로, 이 연구에서는 광양만과 진해만에 서식하는 자연산 참굴의 세포성 면역을 담당하는 혈구의 기능들을 신속, 정확하게 측정할 수 있는 방법을 최적화하여 해산이매패류 건강성 평가를 위한 분석법으로 제시하고자 한다. 광양만과 진해만의 안쪽과 바깥쪽에 서식하는 자연산 참굴의 혈구를 유세포 분석기를 이용하여 형태학적 특성에 따라 종류를 분류하고, 혈구 종류별 수, 사멸률, DNA 손상도, 식세포 작용 능력을 측정하였다.
제안 방법
- Table 2. Correlation coefficients among the hemocyte parameters of the Crassostrea gigas collected in this study. P<0.
- 유세포 분석기의 FSC/SSC dot plot에서 혈구 세포만을 선택한 후 FL-3/Count histogram에서 cell cycle을 작성하였다. DNA가 손상되어 절편된 sub G0-G1 부분에 해당되는 혈구를 선택하여 전체 혈구에 대한 비율로 계산하였다.
- 150 µl의 혈림프액을 동일량의 멸균된 해수와 희석한 후, 30 µl의 희석된 2% 형광 bead를 첨가하여 실온의 암실에서 120분간 식세포 작용을 유도하였다. FSC/FL-1 dot plot에서 형광 bead를 식작용한 혈구들만을 선택하여 FL1/Count histogram에서 형광 bead를 3개 이상 식작용한 혈구들을 선택한 후, 전체 혈구 수에 대한 비율을 계산하여 phagocytosis index로 나타내었다.
- 다양한 외래 오염 물질 유입에 의한 광양만과 진해만의 해양생태계 변화를 진단, 평가하는 기술을 개발하여 해양생태계 정보를 공급하기 위한 기초연구로, 이 연구에서는 광양만과 진해만에 서식하는 자연산 참굴의 세포성 면역을 담당하는 혈구의 기능들을 신속, 정확하게 측정할 수 있는 방법을 최적화하여 해산이매패류 건강성 평가를 위한 분석법으로 제시하고자 한다. 광양만과 진해만의 안쪽과 바깥쪽에 서식하는 자연산 참굴의 혈구를 유세포 분석기를 이용하여 형태학적 특성에 따라 종류를 분류하고, 혈구 종류별 수, 사멸률, DNA 손상도, 식세포 작용 능력을 측정하였다. 또한, Neutral Red Retention(NRR) assay를 이용하여 혈구의 lysosomal membrane stability를 측정하였다.
- 남해의 광양만과 진해만에 서식하는 자연산 참굴의 건강성 평가를 위해 세포성 면역을 담당하는 혈구의 기능들을 유세포 분석기와 Neutral Red Retention(NRR) assay를 이용하여 신속, 정확하게 측정하였다. 광양만과 진해만의 안쪽과 바깥쪽에 서식하는 자연산 참굴의 혈구를 유세포 분석기를 이용하여 형태학적 특성에 따라 혈구의 종류를 분류하고, 혈구 종류별 수, 사멸률, DNA 손상도, 식세포능을 측정하였다. 또한 NRR assay를 이용하여 혈구의 lysosomal membrane stability를 측정하였다.
- 지역 별로 30개의 개체를 무작위로 선별한 후, 각장(shell length)을 측정하고 총 부피(total volume)를 측정하였다. 굴을 개각 후 조직과 패각을 분리하고 조직의 습중량(tissue wet weight)과 패각의 부피(shell volume)를 측정하였다. 참굴의 전반적인 생리상태를 조사하기 위하여 다음과 같이 비만도를 계산하였다.
- 남해의 광양만과 진해만에 서식하는 자연산 참굴의 건강성 평가를 위해 세포성 면역을 담당하는 혈구의 기능들을 유세포 분석기와 Neutral Red Retention(NRR) assay를 이용하여 신속, 정확하게 측정하였다. 광양만과 진해만의 안쪽과 바깥쪽에 서식하는 자연산 참굴의 혈구를 유세포 분석기를 이용하여 형태학적 특성에 따라 혈구의 종류를 분류하고, 혈구 종류별 수, 사멸률, DNA 손상도, 식세포능을 측정하였다.
- 광양만과 진해만의 안쪽과 바깥쪽에 서식하는 자연산 참굴의 혈구를 유세포 분석기를 이용하여 형태학적 특성에 따라 혈구의 종류를 분류하고, 혈구 종류별 수, 사멸률, DNA 손상도, 식세포능을 측정하였다. 또한 NRR assay를 이용하여 혈구의 lysosomal membrane stability를 측정하였다. 참굴의 혈구는 granulocytes, hyalinocytes, blast-like cells의 세 가지 종류로 분류되었다.
- 광양만과 진해만의 안쪽과 바깥쪽에 서식하는 자연산 참굴의 혈구를 유세포 분석기를 이용하여 형태학적 특성에 따라 종류를 분류하고, 혈구 종류별 수, 사멸률, DNA 손상도, 식세포 작용 능력을 측정하였다. 또한, Neutral Red Retention(NRR) assay를 이용하여 혈구의 lysosomal membrane stability를 측정하였다.
- 유세포 분석기는 유액 상태의 입자나 세포가 일정 감지 지역(sensing point)을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여 한 세포가 갖는 여러 특징(세포의 크기, 세포 내부 밀도, 세포 기능 등)을 동시에 측정할 수 있는 장비이다. 레이저 광원의 직진하는 빛을 통해 세포의 크기를 산란하는 빛의 정도에 따라 세포의 내부 밀도를 파악한다. 또한, 일정 파장을 띄는 형광이 표지된 항체나 형광염색소로 표지된 세포의 다양한 기능을 레이저 광원을 통해 측정할 수 있다.
- 100 µl의 혈림프액을 100 µl의 항응고제와 100 µl의 neutral red solution(200 µg/ml)과 혼합하여 실온의 암실에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 15분마다 현미경 하에서 시료당 25개의 혈구를 무작위로 관찰하고, 그 중에서 50% 이상의 혈구의 lysosome membrane이 불안정화되어 neutral red가 빠져나가기 시작하는 시간을 측정하였다.
- 비만도 측정이 끝난 굴을 개각 후 즉시 패각근으로부터 22G'' 1/2의 주사바늘을 이용하여 혈림프액을 채집한 후 응집을 방지하기 위하여 얼음에 보관된 1.5 ml 튜브로 옮겼다.
- 유세포 분석기(FACS Calibur flow cytometer, Becton-Dickinson, USA)의 FL-1 detector를 이용하여 SYBR green I에 염색된 세포들만을 선택하였다. 선택된 혈구들은 유세포 분석기의 Forward Scatter(FSC)와 Side Scatter(SCC)를 이용하여 세포의 크기와 내부 밀도에 따라 혈구의 종류를 분류하고 각 종류 별 구성비율을 측정하였다.
- 150 µl의 혈림프액을 동일량의 3% 포르말린에 고정시킨 후, 1,000×SYBR green I(final dilution=10×)을 첨가하여 실온의 암실에서 90분간 반응시켰다. 유세포 분석기(FACS Calibur flow cytometer, Becton-Dickinson, USA)의 FL-1 detector를 이용하여 SYBR green I에 염색된 세포들만을 선택하였다. 선택된 혈구들은 유세포 분석기의 Forward Scatter(FSC)와 Side Scatter(SCC)를 이용하여 세포의 크기와 내부 밀도에 따라 혈구의 종류를 분류하고 각 종류 별 구성비율을 측정하였다.
- 유세포 분석기를 이용한 참굴 혈구내 세포 형태, 크기 및 내부 밀도에 따라 granulocytes, hyalinocytes, blast-like cells의 3가지 종류로 구분되었다(Fig. 2A). 이렇게 분류된 혈구 집단내 세포 종류의 구성비는 hyalinocytes의 비율이 평균 67% 이상으로 가장 많았으며, granulocytes가 평균 16%이며 blast-like cells은 평균 6.
- 4)와 3 µl의 PI(1 mg/ml; final concentration=20 µg/ml)를 혼합한 후 4℃의 암실에서 10분간 반응을 시켰다. 유세포 분석기의 FL-3 detector를 이용하여 PI에 과하게 염색된 혈구만을 선택한 후 전체 혈구에 대한 비율을 계산하여 혈구 사멸률로 나타내었다.
- 세척이 끝난 후 1 ml의 PBS와 5 µl의 RNase(10 mg/ml)를 첨가하여 30분 동안 RNA를 제거하고 PI(final concentration=50 µg/ml)와 실온의 암실에서 30분간 반응시켰다. 유세포 분석기의 FSC/SSC dot plot에서 혈구 세포만을 선택한 후 FL-3/Count histogram에서 cell cycle을 작성하였다. DNA가 손상되어 절편된 sub G0-G1 부분에 해당되는 혈구를 선택하여 전체 혈구에 대한 비율로 계산하였다.
- 2007). 이러한 연구 결과들을 바탕으로 해산이매패류 혈구의 구조적 특징과 기능들의 변화 조사는 해양환경의 변화를 조기에 진단하고 모니터링할 수 있는 유용한 분석 바이오마커(biomarker)임을 시사한다.
- 2009a) 분류되었다. 이번 연구에서 유세포 분석기를 이용하여 분석된 자연산 참굴 혈구 내 혈구 세포의 구성은 세포의 크기와 내부 밀도에 따라 granulocytes, hyalinocytes와 blast-like cells의 세 가지 형태로 분류하였다(Fig. 2A). 분류된 세 종류의 혈구 집단내 구성 비율은 조사 지역 간에 차이는 있었지만 hyalinocytes가 평균 63.
- 지역 별로 30개의 개체를 무작위로 선별한 후, 각장(shell length)을 측정하고 총 부피(total volume)를 측정하였다. 굴을 개각 후 조직과 패각을 분리하고 조직의 습중량(tissue wet weight)과 패각의 부피(shell volume)를 측정하였다.
- 참굴의 생식소 발달 단계에 따른 혈구 기능들에 미치는 영향을 알아보기 위하여 혈구 채집이 끝난 참굴 조직을 약 3 mm 두께로 cross-section한 후 Davidson’s solution에 48시간 동안 고정시켰다.
- 여기에서 A는 10,000개의 혈구세포를 측정한 시간이며, B는 1분당 유세포 분석기의 유속, 2는 희석배수이다. 총 혈구 수에 대한 혈구 종류별 구성 비율을 계산하여 혈림프액 중 혈구 종류별 수를 계산하였다.
- 포매된 조직시료는 마이크로톰을 이용하여 6 µm 두께로 박절하여 Harris’ Haematoxylene과 Eosin Y로 염색하였다.
- 혈구 사멸률 측정은 DNA 이중가닥에 부착은 하지만 세포막을 통과하지 못하여 세포막이 불안정화된 세포들에만 염색되는 Propidium Iodide(PI; Sigama-Aldrich, USA)를 이용하였다. 150 µl의 혈림프액을 동일량의 항응고제(Anti-aggregant solution, containing 2.
- 혈구 식세포율을 측정하기 위하여 형광 bead(fluorescent bead; 2.0 µm diameter, Polyscience Inc.)를 이용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 참굴은 2011년 6월 남해 광양만의 섬진대교(내만)와 평산리(외만), 진해만의 광도면(내만)과 덕곡리(외만)의 총 4 지역에서 채집되었다(Fig. 1). 채집 지역의 조간대 암반에 부착되어 있는 참굴 중 크기가 큰 개체들을 대상으로 채집을 하였다.
- 1). 채집 지역의 조간대 암반에 부착되어 있는 참굴 중 크기가 큰 개체들을 대상으로 채집을 하였다. 채집한 굴은 즉시 실험실로 옮겨와 채집 지역과 동일한 수온과 염분의 해수에 24시간동안 순치하여 채집과 운송 도중에 발생할 수 있는 스트레스를 최소화하였다.
- 혈구의 lysosomal membrane stability를 측정하기 위하여 lysosome을 특이적으로 염색할 수 있는 Neutral Red(Sigma-Aldrich, USA)를 이용하였다. 100 µl의 혈림프액을 100 µl의 항응고제와 100 µl의 neutral red solution(200 µg/ml)과 혼합하여 실온의 암실에서 30분간 반응시켰다.
- 혈림프액 중 혈구 형태별 세포를 분류하기 위하여 DNA의 이중가닥에 부착할 수 있는 형광색소인 SYBR Green I(Sigma-Aldrich, USA)을 이용하였다. 150 µl의 혈림프액을 동일량의 3% 포르말린에 고정시킨 후, 1,000×SYBR green I(final dilution=10×)을 첨가하여 실온의 암실에서 90분간 반응시켰다.
- 혈림프액 중의 총 혈구의 수를 측정하기 위하여 총 10,000개의 세포를 계수한 시간을 기록하였다. 혈림프액 1 ml 당 혈구의 수를 계산한 식은 다음과 같다.
- 혈림프액은 지역별로 30개의 개체를 분석에 사용하였으며, 분석에 필요한 700 µl의 혈림프액을 취하기 위해 2-3개체의 혈림프액을 혼합하여 사용하였다.
데이터처리
- 또한 각 항목간 상관관계는 Pearson’s correlation coefficient를 분석하여 P <0.05인 경우 유의성 있는 관계로 간주하였다.
- 모든 조사항목에 대한 지역간 차이를 조사하기 위하여 one-way ANOVA test 후, 95%의 신뢰수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- 포매된 조직시료는 마이크로톰을 이용하여 6 µm 두께로 박절하여 Harris’ Haematoxylene과 Eosin Y로 염색하였다. Ngo et al. (2003)의 방법에 따라 광학현미경 하에서 참굴의 생식소 발달단계를 Stage 0(미분화기, indifferent stage), Stage 1(발달기, developing stage), Stage 2(완숙기, ripe stage), Stage 3(산란기, spawning stage), Stage 4(산란후기, spent stage)의 5단계로 구분하였다. 혈구 분석에 암, 수의 구분없이 혈림프액을 혼합하여 사용하였기 때문에 생식소 지수(Gonadal Index, GI)는 암, 수를 합쳐서 나타내었다.
성능/효과
- 4A, B). Granulocytes는 hyalinocytes 보다 평균적으로 2-3배 높은 활발한 식작용 활성을 보였다(Fig. 4C). 지역 간 혈구 식작용 활성의 차이를 조사한 결과, granulocytes의 식작용은 평산리의 참굴 혈구가 64.
- 이 연구에서 2-3개체의 혈림프액을 혼합하여 사용하였기 때문에 개체별 비만도와 혈구 측정값들과 비교를 할 수는 없었다. 그러나 지역 간의 차이를 조사하였을 때, 평산리와 광도면의 참굴보다 상대적으로 비만도가 낮은 섬진대교와 덕곡리의 참굴은 혈구의 식세포율과 lysosomal membrane stability가 낮았으며, DNA 손상도도 상대적으로 높았다. 그러므로 참굴의 비만도와 혈구 면역 기능들은 참굴의 생리상태를 평가하는데 중요하게 이용될 수 있을 것이다.
- 2010). 그러나, 이 연구에서 관찰된 참굴의 생식소 발달 단계는 대부분의 개체가 산란 전의 완숙기 상태로 일부 개체에서 생식세포 발달이 관찰되었지만, 생식소 지수는 지역간에 유의적 차이가 없었다. Gagnaire et al.
- 2009a)에서 조사된 이매패류들의 혈구세포 식작용 결과와 일치한다. 네 지역 간의 혈구의 식세포율은 hyalinocytes의 경우에는 유의적 차이가 없지만, granulocytes는 평산리가 유의적으로 가장 높았으며, 섬진대교와 덕곡리는 유의적으로 낮았다. 이외에도 해산 이매패류의 혈구 식세포율은 구리(Pipe and Coles 1995; Matozzo et al.
- 첫 번째는, 가을과 겨울철에 먹이 부족으로 인하여 세포 분열에 필요한 충분한 에너지가 제공되지 못하게 됨으로써, 새로운 혈구의 생산이 줄어들게 되어 혈구의 수가 감소한다는 것이다. 두번째는, 저수온과 먹이부족으로 인하여 혈구가 영양분의 운반과 소화와 같은 영양학적 활동(nutritional activities)이 감소하게 됨으로써 혈구의 수가 감소한다는 것이다. 그러므로 겨울철인 1월에 채집을 한 Donaghy et al.
- 2A). 분류된 세 종류의 혈구 집단내 구성 비율은 조사 지역 간에 차이는 있었지만 hyalinocytes가 평균 63.1-75.9% 이상으로 가장 높은 비율을 차지하였고, granulocytes 가 평균 10.8-19.2%, blast-like cells이 5.5-8.2%로 혈구 내 가장 낮은 구성 비율을 나타냈다. 이 결과를 Delaport et al.
- 참굴의 각장과 총 습중량은 서로 양(+)의 상관관계가 있었으나, 혈구 parameter들과의 상관관계는 보이지 않았다. 세 종류의 혈구 집단들의 총 수는 각자 서로 양(+)의 상관관계를 보였으며, 다른 항목들과는 상관관계가 없었다. 혈구 사멸률은 DNA 손상도와 양(+)의 관계, hyalinocytes의 식세포율과는 음(−)의 관계가 관찰되었다.
- 하지만, 해양환경 변화와 시료의 면역력과의 상관관계를 이해하기 위해서는 조사지역의 환경적 특성이나 오염정도, 그리고 시료 내의 오염물질 축적량 등의 객관적인 분석 결과와의 종합적인 고찰이 필요할 것이다. 유세포 분석기와 NRR assay를 이용한 참굴 혈구 집단의 형태 변화 및 면역능 측정 기술은 시료의 전처리 없이 빠른 시간 내에 세포의 특성을 분석할 수 있는 유용한 분석 tool로 활용될 수 있음을 확인하였다.
- 1990)에 노출시 그 기능이 저하됨이 알려져 있다. 이 연구에서 조사지역 간의 중금속과 같은 오염물질의 농도 측정을 실시하지않아 실질적인 오염정도를 확인할 수 없으나, 섬진대교와 덕곡리 지역 참굴의 낮은 식세포율은 환경적 스트레스로 인한 세포성 면역기능이 저하된 것으로 사료된다.
- 2010). 이 연구에서는 네 지역간의 NRR 시간이 유의적인 차이가 있었으며, lysosomal membrane stability는 광도면의 참굴이 가장 높고, 섬진대교의 참굴이 가장 낮은 것으로 조사되었다. 이러한 결과는 혈구 식세포율 조사 결과와 유사한 경향을 보였다.
- 이 연구에서는 세 종류의 혈구 집단 중 granulocytes와 hyalinocytes만이 식세포 작용을 하는 것으로 확인되었다. 그 중에서도 granulocytes가 hyalinocytes에 비해 약 3배 정도 활발한 식세포 작용을 하는 것으로 조사되었다.
- 이 연구에서는 유세포 분석기를 이용하여 참굴의 혈구집단을 분류하고, 이들의 면역 관련 기능들을 정량적으로 측정하여 참굴을 비롯한 해산이매패류 혈구의 세포성 면역기작 측정에 매우 유용한 tool임을 확인하였다. 특히, 이 매패류는 종에 따라 혈구세포내 분포하는 혈구 집단이 다를 수 있어, 각 종의 고유한 면역학적 특성으로 설명될 수 있다.
- 2003). 이 연구에서는 유세포 분석기를 이용하여 총 혈구 수를 측정하고 혈구 집단의 구성 비율에 따라 계산한 결과, 참굴의 혈림프액내 실제로 존재하는 혈구 집단 별 수는 지역 간에 유의적 차이가 없었다(Fig. 2B). 세 혈구 집단의 수를 합한 총 혈구 수는 Donaghy et al.
- (2009)은 카드뮴에 노출시킨 바지락의 DNA 손상도를 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과, 대조구에 비해 노출된 바지락 혈구의 DNA 손상도가 증가함을 확인하였다. 이 연구에서는 참굴 혈구의 DNA 손상도가 지역 간의 유의적인 차이는 없었지만, 광양만의 내만인 섬진대교, 진해만의 외만인 덕곡리가 평균적으로 약 1.5배 높은 것으로 측정되었다. 그러므로 섬진대교와 덕곡리 지역의 genotoxicity가 평산리와 광도면보다 높은 것으로 판단된다.
- philiinarum)의 크기는 식세포율과 혈구 사멸률에 음(−)의 상관 관계가 있다고 설명하였다. 이 연구에서는 채집 지역에 서식하는 참굴들 중 크기가 큰 개체들만 채집을 하였지만, 네 지역간 참굴의 각장은 유의적인 차이가 있었다(Table 1). 그러므로 시료의 크기나 나이에 따라 혈구 면역력의 차이가 발생할 수 있으므로, 혈구 분석 시 개체별 크기와 나이도 고려해야 할 것이다.
- 2A). 이렇게 분류된 혈구 집단내 세포 종류의 구성비는 hyalinocytes의 비율이 평균 67% 이상으로 가장 많았으며, granulocytes가 평균 16%이며 blast-like cells은 평균 6.4%로 가장 적었다. 지역 별 혈구의 수를 비교해본 결과 모든 혈구 집단에서 유의적인 차이가 없었다(Fig.
- 참굴의 혈구는 granulocytes, hyalinocytes, blast-like cells의 세 가지 종류로 분류되었다. 조사 지역 간의 혈구의 수, 사멸률, DNA 손상도는 유의적 차이가 없었지만, 식세포율과 lysosomal membrane stability와 같은 면역 관련 기능들은 유의적 차이가 있었다. 진해만은 내만과 외만 지역에 서식하는 참굴의 혈구 면역인자들 간에는 유의적 차이가 관찰되지 않았다.
- 조사결과, 섬진대교의 참굴 혈구의 유지 시간이 53.3±17.2분(평균값±표준편차)으로 가장 짧았으며 광도면에서 76.0±15.8분으로 가장 길었다(ANOVA, P <0.05).
- 지역 간 혈구 식작용 활성의 차이를 조사한 결과, granulocytes의 식작용은 평산리의 참굴 혈구가 64.8±12.6%(평균값±표준편차)로 유의적으로 가장 높았으며(P<0.05), 광도면이 63.2±10.5%, 덕곡리가 53.4±10.6%, 섬진대교가 52.5±12.7%로 조사되었다.
- 이 연구에서 조사한 참굴의 각장, 총 습중량 및 혈구 parameter들 간의 상관관계를 분석하여 Table 2에 나타냈다. 참굴의 각장과 총 습중량은 서로 양(+)의 상관관계가 있었으나, 혈구 parameter들과의 상관관계는 보이지 않았다. 세 종류의 혈구 집단들의 총 수는 각자 서로 양(+)의 상관관계를 보였으며, 다른 항목들과는 상관관계가 없었다.
- 참굴의 각장은 덕곡리가 80.9±9.8 mm으로 가장 컸으며 광도면(66.5±8.5 mm), 평산리(55.8±7.4 mm), 섬진대교(46.7±5.4 mm)의 순으로 네 지역 간에 유의적인 차이가 있었다(P<0.05).
- 참굴의 비만도는 광도면이 0.650±0.208으로 가장 높았으며 평산리가 0.539±0.106, 덕곡리가 0.381±0.085, 섬진대교가 0.289±0.114 순으로 네 지역 간에 유의적인 차이가 있었다(P <0.05).
- 채집 지역의 조간대 암반에 부착되어 있는 참굴 중 크기가 큰 개체들을 대상으로 채집을 하였다. 채집한 굴은 즉시 실험실로 옮겨와 채집 지역과 동일한 수온과 염분의 해수에 24시간동안 순치하여 채집과 운송 도중에 발생할 수 있는 스트레스를 최소화하였다.
- (2009b)는 가을과 겨울철에 바지락의 총 혈구 수가 줄어드는 이유를 두가지의 가설을 이용하여 설명하였다. 첫 번째는, 가을과 겨울철에 먹이 부족으로 인하여 세포 분열에 필요한 충분한 에너지가 제공되지 못하게 됨으로써, 새로운 혈구의 생산이 줄어들게 되어 혈구의 수가 감소한다는 것이다. 두번째는, 저수온과 먹이부족으로 인하여 혈구가 영양분의 운반과 소화와 같은 영양학적 활동(nutritional activities)이 감소하게 됨으로써 혈구의 수가 감소한다는 것이다.
- 혈구 사멸률은 DNA 손상도와 양(+)의 관계, hyalinocytes의 식세포율과는 음(−)의 관계가 관찰되었다.
후속연구
- 2005). 이러한 연구 결과들과 같이 환경오염에 대한 혈구의 수가 서로 다르게 변동하는 것을 이해하기 위해서는 혈구의 증식과 이동에 대한 구체적인 연구가 필요하다.
- (2010)은 2007년 한국의 서해안에 Hebei spirit호 유류 유출 사고 2년이 지난 후, 유출 지역인 태안 신두리와 대조구 지역인 인천 종현의 양식산 참굴의 혈구 집단별 구성 비율을 조사하여 hyalinocytes > blast-like cells > granulocytes의 분포도를 갖고 있다고 설명하였다. 이러한 혈구내 집단 구성 비율의 차이는 조간대 암반에 부착하여 서식하는 자연산 참굴과 수하식으로 양식(suspended culture)되는 참굴간의 양식에 따른 성장과 크기의 차이, 자연산 참굴 채집 시기가 여름철인 반면, 양식산 참굴의 채집 시기는 겨울철로 계절별 영향에 의한 차이일 수도 있으므로 정확한 원인을 파악하기 위해서는 자연산과 양식산 참굴의 계절별 혈구 집단 구성의 변동에 관한 추가적인 연구가 필요하다.
- 이에 반해, 광양만에 서식하는 참굴은 내만 지역의 섬진대교가 외만 지역의 평산리 지역에 서식하는 참굴보다 낮은 식세포율과 낮은 lysosomal membrane stability를 보여 면역력이 저하되어 있는 것으로 추정된다. 하지만, 해양환경 변화와 시료의 면역력과의 상관관계를 이해하기 위해서는 조사지역의 환경적 특성이나 오염정도, 그리고 시료 내의 오염물질 축적량 등의 객관적인 분석 결과와의 종합적인 고찰이 필요할 것이다. 유세포 분석기와 NRR assay를 이용한 참굴 혈구 집단의 형태 변화 및 면역능 측정 기술은 시료의 전처리 없이 빠른 시간 내에 세포의 특성을 분석할 수 있는 유용한 분석 tool로 활용될 수 있음을 확인하였다.
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